معلومة

يؤوي البلازميد وحدة فرعية S من النوع الأول R / M.


لدينا مجموعة من جينوم أحد أنواع العصيات اللبنية. يحتوي الجينوم أيضًا على بلازميد 7.5 كيلو بايت.

بصرف النظر عن "جينات البلازميد المعتادة" ، يحتوي البلازميد على: - نظام السم / مضاد السموم - الوحدة الفرعية S من النوع الأول R / M (لا توجد وحدة فرعية R أو M)

الآن ، تبدو هذه حالة مثيرة للاهتمام بالنسبة لي. يبدو أن البلازميد "يستغل" نظام R / M للمضيف (يبدو أن البكتيريا لديها نظام من النوع الأول R / M بالفعل).

قد يكون لهذا تأثير أن البلازميد يزيد من ملاءمة المضيف (ونفسه) عن طريق جعل نظام R / M أكثر مرونة من حيث التسلسلات المستهدفة بواسطة نظام R / M (Phages ، إلخ).

أسئلتي الآن:

  • لا أحد يعرف مثالا على مثل هذه الحالة. لم يتم العثور على أي.
  • هل تعتقد أنه يعمل بالطريقة التي أظن.
  • هل يمكن أن يكون هذا مثيرًا للاهتمام لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية لأن العاثيات في بيئة غذاء اليوميات تمثل مشكلة.
  • كيف تختبر ما إذا كان لهذا البلازميد هذا التأثير؟

يعزز التحلل غير المحدد للنصوص إزالة البلازميد أثناء مناعة النوع III-A CRISPR-Cas

تستخدم أنظمة CRISPR-Cas من النوع III-A مركب Cas10-Csm لتدمير العاثيات والبلازميدات ، باستخدام دليل RNA لتحديد موقع جزيئات الحمض النووي الريبي التكميلية من الغازي وتحفيز الاستجابة المناعية التي تقضي على الحمض النووي المصاب. بالإضافة إلى ذلك ، تمتلك هذه الأنظمة RNase Csm6 غير المحدد ، والذي يوفر مزيدًا من الحماية للمضيف. بينما تم تحديد دور Csm6 في المناعة أثناء عدوى الملتهمة ، فإن كيفية استخدام RNase ضد البلازميدات غير واضحة. هنا ، نظهر ذلك المكورات العنقودية البشروية مطلوب Csm6 للمناعة عندما يكون النسخ عبر هدف البلازميد نادرًا ، مما يؤدي إلى ضعف التعرف على الهدف وتدهور الحمض النووي غير الفعال بواسطة مجمع Cas10-Csm. في هذه الظروف ، يتسبب Csm6 في توقف النمو في المضيف ويمنع المزيد من تكرار البلازميد من خلال التدهور العشوائي للنسخ المضيفة والبلازميد. في المقابل ، عندما يتم نسخ متواليات هدف البلازميد بكفاءة ، يمكن الاستغناء عن Csm6 وتدهور الحمض النووي بواسطة Cas10 كافٍ لمناعة ضد البلازميد. لذلك يوفر Csm6 المتانة للاستجابة المناعية من النوع III-A CRISPR-Cas ضد الأهداف الصعبة لمركب Cas10-Csm.


اقتران ونقل بلازميدات Ti في الأورام الجرثومية

3 تقنيات معملية

المبادئ بسيطة للغاية. والهدف من ذلك هو اختيار المتحولات البلازميدية. نظرًا لأن بلازميدات Ti هي أيضًا بلازميدات تقويضية ، فإن السلالة التي تحتوي على بلازميد Ti يمكن أن تقوض مادة opine واستخدامها كمصدر للكربون أو النيتروجين أو كليهما. في وسط انتقائي ، عادةً ما يكون opine هو المصدر الوحيد لواحد على الأقل من هذه العناصر. قد يفتقر المستلم إلى بلازميد Ti أو ، إذا كان لديه واحد ، يجب أن يكون مختلفًا عن المتبرع حتى لا يتمكن من تقويض الفتحة في الوسط الانتقائي. يجب التخلص من خلايا المتبرع عادة عن طريق دمج المضادات الحيوية في الوسط الانتقائي الذي يكون المتبرع حساسًا والمقاوم له. عند استخدام ترميز البلازميدات أو الترانسبوزونات لمقاومة الأدوية ، يمكن استخدام تقنيات مختلفة ولكن لن يتم وصفها هنا.

في البداية ، تم إجراء نقل بلازميد Ti على مرشحات Millipore (Kerr وآخرون. ، 1977 جينيتيلو وآخرون. ، 1977) ، وعلى الرغم من أن هذه الطريقة لا تزال مرضية لمعظم الأغراض ، إلا أن الطرق الأسرع والأكثر ملاءمة متاحة الآن. كلها تنطوي على الاقتران مباشرة على سطح أجار. بيتي وآخرون. (1978) معلقات خلوية مختلطة من المتبرع والمتلقي وإضافة قطرة إلى سطح وسيط الاقتران ، وهو متوسط ​​الحد الأدنى الذي تمت إضافة المحفز المناسب إليه. تم السماح للقطرة بالجفاف ، وبعد ذلك تم إعادة تعليق البكتيريا وتخفيفها وتغليفها على وسط انتقائي. باستخدام هذه الطريقة ، لا يمكن تحديد تواتر النقل ، سواء من حيث المتبرع أو المتلقي بسبب النمو الانتقائي للمتحولين في وسط الاقتران. تيمبي وآخرون. (1977) حذف وسيط الاقتران. لقد قاموا بتحريض خلايا المتبرع مسبقًا عن طريق زراعتها في وجود opine ، وعلقوها وإضافة قطرة إلى حديقة من الخلايا المتلقية على وسط انتقائي. مع التخفيفات المناسبة ، يمكن قياس تواتر نقل البلازميد لكل متبرع إذا تم طلاء المتبرع بشكل منفصل على وسط غير انتقائي. يمكن تحديد تواتر نقل البلازميد لكل متبرع ولكل متلقي من خلال التقنية المستخدمة بواسطة Tempé وآخرون. (1978). تزرع سلالات المتبرع والمتلقي بشكل منفصل في وسط ضئيل ، ثم تختلط وتطلى مباشرة على وسط انتقائي. يحدث نقل البلازميدات من النوع البري فقط إذا تم حث المتبرع مسبقًا على النقل باستخدام الفتحة المناسبة. لا تتطلب الجهات المانحة التأسيسية التحويل المسبق. يتم طلاء البكتيريا المانحة والمتلقية بشكل منفصل على وسيط انتقائي كعناصر تحكم وأيضًا على وسط غير انتقائي لتحديد عدد الخلايا المانحة والمتلقية في خليط الاقتران. تيمبي وآخرون. (1978) لاحظت ترددات تصل إلى 2 × 10 −2 لكل متبرع في تقاطع بين السلالتين B6S3 و C58C1.

تعد تقاطعات الطلاء المتماثلة مفيدة عندما يتم اختبار العديد من السلالات أو المسوخات من أجل القدرة على النقل. إليس وآخرون. وصف (1979) طريقة يتم فيها طلاء العديد من مستعمرات المانحين المفترضة على لوحة رئيسية على حديقة من الخلايا المتلقية التي تنمو على وسط الاقتران ، يتم بعد ذلك طلاء السلالات المختلطة على وسط انتقائي. في ضوء نتائج Tempé وآخرون. (1978) يجب أن يكون من الممكن نسخ المتبرعين للوحة مباشرة على المستلمين على وسط انتقائي ، وبالتالي حذف نسخة طبق الأصل واحدة. ما لم تكن الجهات المانحة مكونة للنقل ، فيجب زراعتها على وسط يحتوي على محفز مفتوح مناسب. تم الآن استخدام هذه الطريقة بنجاح (J.G Ellis ، A. Kerr ، A. Petit ، و J. Tempé ، بيانات غير منشورة).


نتائج ومناقشة

التصميم المفاهيمي لمجموعة أدوات الاستنساخ

يتطلب بناء ناقل للتعبير عن بروتينات الاندماج الاستنساخ الفرعي لـ cDNA ذي الأهمية في العمود الفقري للناقل ، في موقع بجوار واحدة أو أكثر من الوحدات النمطية الموجودة مسبقًا في الإطار والتي توفر الوظائف التي يجب مراقبتها. ومن ثم ، فإن تصميم ناقل العمود الفقري المجمّع مسبقًا يضبط طبيعة الاندماج والموقع النسبي للوحدات المكونة له. هذا يحد من احتمالات فحص أفضل ترتيب وأداء معياري. يمكن تبسيط الاستنساخ الفرعي لبروتينات الاندماج عن طريق تحرير الوحدات الوظيفية من موضع ثابت في ناقل العمود الفقري واعتبارها وحدات قابلة للاستبدال يتم استنساخها في N- و C-termini في وقت واحد مع ORF ذي الأهمية (الشكل 1A). من الناحية المثالية ، سيعتمد هذا النهج على الاستنساخ بوساطة إعادة التركيب لأن هذا من شأنه أن يسمح بتوحيد الإجراءات والببتيدات التي تربط الوحدات النمطية ، مما يسهل اعتماد التكنولوجيا عالية الإنتاجية ، كما هو موضح في التقارير السابقة [9 ، 10]. سيكون التعبير عن البروتين بشكل اختياري من تلقاء نفسه أو اندماج مع وحدتين مرافقتين من عمود فقري متجه واحد أحد الأصول الإضافية (الشكل 1 أ). وبالتالي ، عند التعبير عنها في ظل ظروف موحدة ، فإن مقارنة سلوك البروتين في أي من الحالتين من شأنه أن يسهل التعرف على المصنوعات اليدوية المحتملة التي تحدث نتيجة للاندماج مع الوحدات الوظيفية [6]. سيسمح أيضًا باستنساخ عدد كبير من عمليات الاندماج استنادًا إلى ORF معين في وقت واحد في مجموعة من نواقل التعبير الخاصة بالنموذج جنبًا إلى جنب مع مجموعة من الوحدات الوظيفية (الشكل 1 ب). تمثل مجموعة أدوات الاستنساخ التي تحتوي على مثل هذه الميزات تقدمًا على الأنظمة السابقة التي تم إنشاؤها وفقًا لمبادئ تصميم مماثلة [10]. علاوة على ذلك ، فإن مجموعة الأدوات الخاصة بنا ستستفيد بشكل مثالي من ثروة موارد ORFeome التي تنتجها جهود المختبرات المختلفة التي تقود الإنتاج الضخم لأجزاء لبيولوجيا الأنظمة [5] ، وهي ميزة مشتركة مع التصميمات السابقة [9 ، 10]. لقد اخترنا مجموعة أدوات استنساخ تم تطويرها باستخدام مجموعة أدوات إنشاء متجه ثلاثية الأجزاء لبوابة MultiSite Gateway من Invitrogen (انظر الملف الإضافي 1) لأنها ستلبي المتطلبات المذكورة أعلاه. تفاعل إعادة التركيب يتضمن ثلاثة مستنسخات دخول منفصلة بناءً على نواقل pDONR من المجموعة (pDONRP4-P1R و pDONR221 و pDONRP2R-P3) وتحتوي على أجزاء من الحمض النووي محاطة بمتغيرات محددة من Att المواقع ، ينتج عنها استنساخ فرعي مرتب في ناقل الوجهة غير المحفز للمجموعة pDEST-R4-R3 (انظر الملف الإضافي 1). ومن المثير للاهتمام ، أن جزء الحمض النووي الذي يحتل الموقع المركزي محاط به اتل 1 و AttL2 المواقع في متجه الدخول (pDONR221) ، تمامًا كما هو الحال في ناقلات الدخول المتاحة من موارد cDNA العامة أو التجارية (على سبيل المثال ، الحيوانات المستنسخة المكوكية ORF المتاحة من خلال ORFeome Collaboration [11 ، 12]). علاوة على ذلك ، استنساخ الدخول الجديد الذي تم إنشاؤه بواسطة تضخيم PCR لـ cDNAs وإعادة التركيب بوساطة BP clonase في نواقل تحتوي على AttP1 / AttP2 تتوافق أيضًا المواقع المستخدمة لنسخ البوابة القياسية مع مجموعة البوابة متعددة المواقع (الشكل 2 ، اللوحة 1) (انظر أيضًا الملف الإضافي 1). تم تضمين الحفاظ على إطار الترجمة للأجزاء الثلاثة التي تم تجميعها معًا في تصميم نظام استنساخ MultiSite الأصلي [9]. لذلك ، من خلال استنساخ الوحدات الوظيفية N-term و C-term المقترحة في تصميم مجموعة الأدوات في pDONR-P4-P1R و pDONR-P2R-P3 ، على التوالي ، يمكن أن ينضموا إلى ناقل دخول يحمل ORF لبروتين مهم. في رد فعل استنساخ MultiSite من شأنه أن يخلق ORF وهمي لبروتين الانصهار (الشكل 2 ، اللوحة 2). ومع ذلك ، فإن pDEST-R4-R3 عبارة عن متجه وجهة غير محفز ، مما يعني أن مزيدًا من الهندسة لهذا المتجه ستكون مطلوبة لإدخال معزز في اتجاه المنبع من ORF الوهمي. بدلاً من ذلك ، بدا استبدال كاسيت البوابة الأصلي المكون من جزء واحد في أي ناقل تعبير وجهة مزود بمروج غير متجانس ، باستخدام كاسيت R4-R3 من pDEST-R4-R3 ، استراتيجية أكثر قوة (الشكل 2 ، اللوحة 3). سيسمح هذا بالاستفادة من العديد من متجهات وجهة البوابة الحالية التي ستصبح متاحة بهذه الطريقة لاستنساخ البوابة متعددة المواقع (انظر أيضًا المرجع [13]) ، مما يزيد من المرونة الوظيفية لمجموعة الأدوات. وبهذه الطريقة ، يمكن التعبير عن البروتين المعني بمفرده أو كبروتين اندماجي في سياق نفس العمود الفقري للناقل ، عن طريق اختيار إعادة تركيب LR بين المتجه غير المعدل وذلك باستخدام كاسيت البوابة المصمم هندسيًا ، والمستخدم بالاقتران مع استنساخ وحدات وظيفية ترميز. علاوة على ذلك ، ستشترك جميع العناصر في المجموعات المقترحة للوحدات الوظيفية الطرفية N و C الطرفية في نفس مبادئ البناء. وبالتالي ، يمكن استخدامها بطريقة اندماجية في تفاعلات إعادة التركيب بوساطة MultiSite Gateway LR Clonase مع أي استنساخ موجود لدخول البوابة يحتوي على عنصر AttL1 / AttL2- محاط ORF ، حيث سيتم ربط مكونات بروتينات الاندماج بالباقي المترجم اتب 1 و AttB2 متواليات تعمل كموصلات عالمية (الشكل 2 ، اللوحة 4). تسمح البنية المفتوحة لمجموعة الأدوات هذه بتحديث أي ترتيب اندماج ناجح بسهولة إلى أحدث إصدارات الوحدات الوظيفية المستخدمة (مثل البروتينات الفلورية). يمكن تحقيق ذلك ببساطة من خلال دمج مثل هذه الإصدارات كوحدات نمطية جديدة في المجموعة ، بحيث يمكن استخدامها بدلاً من الوحدات المستبدلة في إعادة تفاعل إعادة التركيب الذي أدى إلى الاندماج المعني.

استراتيجية اندماجية للتعبير عن البروتينات كدمج مع وحدات وظيفية. أ. يسمح تصميم مجموعة الأدوات الخاصة بنا بالتعبير بسهولة عن أي ORF مهم من تلقاء نفسه (أعلاه) أو اندماج (أدناه) مع الوحدات الطرفية N و C المنتقاة من بين مجموعة من الأجزاء (ممثلة كعجلات متعددة الألوان). ترتبط مكونات الاندماج بأذرع ببتيدية قصيرة معيارية (كرات ومثلثات سوداء) تم تقديمها كنتيجة لإجراء الاستنساخ. تم إنشاء المجموعة بحيث يمكن إرفاق وحدة وظيفية معينة إما في الطرف N أو الجانب C من البروتين محل الاهتمام ، وهو أمر مفيد للعثور على الترتيب الأمثل في كل حالة. ب. يمكن إنشاء عمليات اندماج متعددة من خلال الجمع بين ORF ذي الأهمية مع وحدات مختلفة من المجموعة. سيتم تحديد عمليات الاندماج المحددة التي تستهدف تطبيقات معينة من خلال اختيار الوحدات المستخدمة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام ORF ذي الأهمية N- الموسومة بوحدات فلورية مختلفة (أخضر ، أصفر ، أزرق) لمراقبة التوطين داخل الخلايا لبروتين الاندماج في ظل الظروف الأنسب لكل تجربة. علاوة على ذلك ، يسمح تصميمنا متعدد الاستخدامات باستنساخ ترتيب بروتين اندماج معين في نواقل محددة للتعبير في أنظمة نموذجية مختلفة في سياق الدراسات المقارنة.

استراتيجية استنساخ بروتينات الاندماج. يعتمد الاستنساخ على مجموعة البوابة متعددة المواقع من Invitrogen. يمكن أن يكون ترميز البلازميد لـ ORF محل الاهتمام إما استنساخ إدخال موجود من مكتبة ORFeome المستندة إلى البوابة ، أو يمكن بناؤه بواسطة Gateway-cloning the PCR-amplified ORF إلى pDONR221 مع BP clonase (اللوحة 1). يتم إنشاء مجموعة من استنساخ الدخول التي تشفر الوحدات الوظيفية المراد إرفاقها بـ ORF ذي الأهمية بشكل مشابه عن طريق استنساخ البوابة للوحدات المضخمة لـ PCR في pDONR P4-P1R (وحدات N-term) والبلازميدات pDONR P2RP3 (وحدات مصطلح C) من مجموعة بوابة MultiSite (لوحة 2، انظر النص الرئيسي للحصول على التفاصيل). جميع الإدخالات في ناقلات الدخول محاطة بشكل مناسب Att المواقع التي تم توفيرها بواسطة بادئات تضخيم PCR ، وتتم الإشارة إليها في جميع أنحاء هذا الشكل بمفتاح (على سبيل المثال اتب 1 يشار إلى الموقع باسم ب 1). تم تكييف متجهات التعبير عن وجهة البوابة أحادية الجزء المصممة للتعبير في أنظمة نماذج مختلفة عن طريق هندسة كاسيت البوابة للسماح بتفاعلات استنساخ البوابة المتعددة المواقع (اللوحة 3). تتضمن هذه التفاعلات متجهًا مقصودًا واحدًا مُكيفًا ، بالإضافة إلى البلازميدات التي تشفر ORF موضع الاهتمام والوحدات النمطية المختارة من المصطلح N و C (الخلفية البيضاء) ، والتي تطابقها Att إعادة تجميع المواقع (R4xL4 ، R1xL1 ، L2xR2 ، L3xR3) لإنتاج متجه تعبير الوجهة يشفر بروتين الاندماج في شكل cDNA خيمري (اللوحة 4). ينتج عن التعبير عن cDNA إنتاج بروتين اندماجي ترتبط أجزائه الثلاثة بببتيدات قصيرة ناتجة عن ترجمة اتب 1 و AttB2 المواقع المتبقية بعد إعادة تركيب LR (اللوحة 4 ، انظر النص الرئيسي للحصول على التفاصيل).

هندسة متجه تعبير الوجهة لتمكين الاستنساخ ثلاثي الأجزاء

استبدال الموقع الفردي - بواسطة MultiSite AttR4-attR3 تم تحقيق شريط البوابة في ناقل تعبير الوجهة الحالي من خلال تعديل طريقة تم الإبلاغ عنها لأول مرة بواسطة Magnani وزملاؤه [13]. يتكون هذا من تفاعل إعادة تركيب LR بين متجه يحتوي على AttR4-attR3 بوابة كاسيت من pDEST-R4-R3 ، محاط بـ AttL1 / AttL2 مواقع (pDONR221-R4-R3) ، ومتجه تعبير الوجهة في شكله القياسي ، المزود بـ AttR1 / AttR موقعان [13]. وبهذه الطريقة ، فإن تفاعل إعادة التركيب الناجح سيضع كاسيت بوابة R4-R3 بين اتب 1 و AttB2 المواقع (الناتجة عن إعادة تركيب LR بين AttL1 / AttL2 و AttR1 / AttR2 مواقع). ومع ذلك ، فقد أثار مثل هذا الإجراء مشكلة فنية ، شائعة في جميع التفاعلات حيث يتم استبدال أشرطة البوابة القياسية بإصدارات تحتوي على مواقع إعادة تركيب محاطة مختلفة ، أي كيفية التمييز بسهولة ، بعد التحول البكتيري ، بين بكتريا قولونية المستعمرات التي تحتوي على متجه الوجهة الأصلي من تلك التي تحتوي على المتجه مع كاسيت R4-R3 المعاد تجميعه ، نظرًا لأنها ستكون متطابقة من حيث علامات التحديد الخاصة بها. لحل هذه المشكلة ، استفدنا من حقيقة أن نواقل البوابة تمتلك عادةً جينات مقاومة للمضادات الحيوية ، أحدهما هو الكلورامفينيكول-أسيتيل ترانسفيراز (قط) الجين الموجود داخل كاسيت البوابة ، وآخر موجود في مكان آخر في الناقل. مقاومة ccdB بكتريا قولونية تكتسب البكتيريا المتحولة بمثل هذه النواقل مقاومة لكل من الكلورامفينيكول والمضاد الحيوي (الأمبيسيلين والكاناميسين وما إلى ذلك) المحدد بواسطة جين المقاومة الآخر. تألفت استراتيجيتنا من هندسة المتجه قبل تفاعل إعادة التركيب ، بحيث يتم إدخال طفرة معطلة عن طريق الطفرات الموجهة للموقع في قط الجين في كاسيت البوابة الحالي ، بينما تم الحفاظ على وظائف المتجه المتبقية. بكتريا قولونية كانت الخلايا المحولة بهذا الناقل حساسة لوجود الكلورامفينيكول في وسط المزرعة (انظر الملف الإضافي 2). من ناحية أخرى ، كان كاسيت بوابة MultiSite الذي تم تضخيمه بواسطة PCR ، والذي كان سيحل محل الأصلي بعد إعادة التركيب ، وظيفيًا. قط الجين. وبالتالي ، فإن إعادة التركيب الناجح من شأنه أن يعيد مقاومة الكلورامفينيكول في الناقل الهندسي ويسمح بنمو مستعمرات البكتيريا في وجود الكلورامفينيكول والأمبيسلين ، مع الاختيار السلبي للبكتيريا المحولة باستخدام ناقل الوجهة غير المعاد تجميعه. نظرًا لأن جميع نواقل البوابة تحتوي على نفس التسلسل في ملف قط الجين المستهدف من خلال تفاعل الطفرات ، يمكن استخدام هذه الاستراتيجية لتصميم كاسيت البوابة في أي ناقل. اختبرناه في البداية من خلال تجميع ناقل pDONR221-R4-R3 (الشكل 3 أ). تضمن ذلك تفاعل إعادة تركيب BP بين كاسيت R4-R3 Gateway الذي تم تضخيمه بواسطة PCR والمزود بنوع بري. قط الجين ، وأ قط- نسخة متحولة من ناقل pDONR221 (الشكل 3 أ). أثبتت استراتيجية الفحص نجاحها ، وتمكنا من عزل الحيوانات المستنسخة البكتيرية التي تحتوي على pDONR221-R4-R3 المعاد تجميعها ، كما أكده التسلسل ، والتي كانت مقاومة مرة أخرى للكلورامفينيكول والكاناميسين. استخدمنا لاحقًا نفس الإستراتيجية في تكييف متجه تعبير الوجهة لاستنساخ بوابة MultiSite ، كما هو مطلوب في تصميم مجموعة أدوات الاستنساخ الخاصة بنا. وهكذا ، تم إعداد تفاعل إعادة تركيب LR بين pDONR221-R4-R3 و قطنسخة متحولة من pEF5 / FRT / V5-DEST (الشكل 3 ب). بعد تحويل التفاعل والطلاء على وسط LB معزز بالأمبيسيلين والكلورامفينيكول ، تم عزل عدة مستعمرات مقاومة لكلا المضادات الحيوية. أظهر تسلسل البلازميد المحضر من هذه المستعمرات وجود كاسيت بوابة R4-R3 محاط بـ AttB1 / attB2 المواقع في سياق pEF5 / FRT / V5-DEST ، مما يُظهر الاستبدال الناجح للموقع الفردي - بواسطة كاسيت البوابة متعددة المواقع. وهكذا ، قمنا بتعيين هذا البلازميد pEF5 / FRT / V5-DEST-R4-R3 واستخدمناه في بناء نماذج بروتين الاندماج التي تمت مناقشتها أدناه. الأهم من ذلك ، تحور نواقل الوجهة قط لن يكون الجين الذي تتطلبه طريقتنا مفيدًا فقط لتمكين استنساخ إعادة تركيب MultiSite ، ولكن يمكن أيضًا استخدامه لاحقًا لتفاعلات التكيف الأخرى التي تتضمن كاسيتات بوابة مختلفة محاطة بأنواع أخرى من مواقع إعادة التركيب (مختلفة Att التسلسلات ، FRT أو loxP مواقع إعادة التركيب) ، والتي يمكن فحصها بنفس الإجراء.

تكييف نواقل وجهة البوابة الحالية للتعبير عن بروتينات الاندماج. أ. بناء ناقل المحول pDONR221-R4-R3. منتج PCR المطابق لـ أتر 4-AttR3- تم تضخيم كاسيت البوابة المحتوي على pDEST-R4-R3 باستخدام البادئات التي توفر المرافقة اتب 1 و AttB2 المواقع. تم إدخال طفرة معطلة في قط الجين (أحمر X) في pDONR221 عن طريق الطفرات الموجهة بالموقع بحيث تكون مقاومة لـ ccdB بكتريا قولونية تحولت مع هذا البلازميد حساسة للكلورامفينيكول (كام S). تم إنشاء تفاعل إعادة تركيب BP بين التضخيم AttR4-attR3 كاسيت البوابة و pDONR221_Cam S لإنشاء pDONR221-R4-R3 (انظر التفاصيل تحت الطرق). ال Att يتم تمييز المواقع المشاركة في التفاعل بمربعات زرقاء. الاختيار باستخدام وسط LB يحتوي على كاناميسين وكلورامفينيكول (كان/كام) أسفرت عن مستعمرات تحتوي على البلازميد المعاد تجميعه. ب. تكييف متجه تعبير الوجهة pEF5 / FRT / V5-DEST لتفاعلات إعادة تركيب بوابة MultiSite. نفس الطفرة المعطلة في قط تم إدخال الجين كما هو مذكور أعلاه (أحمر X) في متجه تعبير الوجهة أحادية الموقع المتاح تجاريًا pEF5 / FRT / V5-DEST لإنشاء إصدار حساس للكاميرا (pEF5 / FRT / DEST-Cam S). تعرض البلازميد الطافرة لتفاعل إعادة تركيب LR مع pDONR221-R4-R3 من أجل استبدال كاسيت البوابة الأصلي الخاص به مع AttR4-attR3 كاسيت إعادة التركيب MultiSite في pDONR221-R4-R3 (موهوب بنوع بري قط الجين). ال Att يتم تمييز المواقع المشاركة في التفاعل بمربعات خضراء. تم اختيار المستعمرات المحتوية على pEF5 / FRT / V5-DEST المعاد تجميعها (pEF5 / FRT / -DEST-R4-R3) باستخدام وسط LB يحتوي على الأمبيسيلين والكلورامفينيكول (أمبير / كام). تظهر فقط الميزات الموجودة في خريطة البلازميد pEF5 / FRT / V5-DEST ذات الصلة بالتفاعل.

إنشاء مجموعة من الوحدات الوظيفية

قمنا باستنساخ مجموعة من وحدات الحمض النووي الوظيفية في نواقل pDONR-P4-P1R و pDONR-P2R-P3 بحيث يمكن دمجها مع الطرف N أو C للبروتين محل الاهتمام ، على التوالي. تم تنفيذ ذلك عن طريق إعادة تركيب BP بين أتبمنتجات PCR المحاطة بما في ذلك الوحدات الوظيفية وأي من ناقلات pDONR. كانت منتجات PCR التي كان من المقرر استنساخها في pDONR-P4-P1R محاطة بـ AttB4 / AttB1 المواقع ، بينما كانت تلك التي سيتم استنساخها في pDONRP2R-P3 محاطة بـ AttB2 / attB3 المواقع (الشكل 2 ، اللوحة 2). يتم توفير القائمة الحالية للمكونات في مجموعتنا من الوحدات في الجدول 1. في الوقت الحالي ، تتكون في الغالب من نسخ تحتوي على cDNA لسلسلة من البروتينات الفلورية ، والتي يمكن دمجها إما في الطرف N أو الطرف C نهاية ORF ذات الأهمية. البروتينات الفلورية المتوفرة هي ECFP (سماوي) ، EGFP (أخضر) ، EYFP (أصفر) و mKate2 (أحمر بعيد). هناك أيضًا وحدة 3′ تسمح بالتعبير عن ECFP من موقع دخول الريبوسوم الداخلي (IRES) في سياق مرنا ثنائي الاتجاه يتم مشاركته مع بروتين اندماج مكون من وحدتين مشفر في نصف 5′ من الرنا المرسال. سنقدم وحدات ترميز متغيرات A206K EGFP و EYFP ، مع تكوين قليل القسيمات [14] ، لاستخدامها في عمليات الاندماج التي يمكن أن يتأثر سلوكها بتغير قلة البروتين الفلوري. لن يكون هذا ضروريًا لوحدات ترميز ECFP لأن هذا البروتين يحمل طفرة تأسيسية تمنع إضعافه [15]. نظرًا لأن متجهات الدخول الثلاثة من مجموعة استنساخ بوابة MultiSite يجب أن تكون موجودة لإعادة التركيب الناجح ، فقد قمنا بتضمين وحدة 3′ غير مشفرة بالببتيد مع كودون توقف وشريط إشارة SV40 مبكرًا من مادة البولي أدينيل للسماح بإنهاء انتقالي لـ ORFs الوهمي عند اندماج الوحدة النمطية في الطرف C ليست ضرورية أو ملائمة. يرجى ملاحظة أن متجه الوالدين pEF5 / FRT / V5-DEST يحتوي على إشارة BGH polyadenylation في اتجاه تيار كاسيت البوابة ويتم حفظها في pEF5 / FRT / V5-DEST-R4-R3. وبالتالي ، عند استخدام وحدة ترميز 3 الببتيد عادةً ، ستسمح إشارة BGH polyA بالمعالجة المناسبة للنسخة الوهمية ، مع توفير وحدة 3 كودون STOP في نهاية الببتيد المشفر. نظرًا لأن علامة N-terminal قد تتداخل مع التعديلات المهمة وظيفيًا للبروتين (على سبيل المثال myristoylation) ، فسنحصل أيضًا على وحدة 5′ محايدة تحتوي على تسلسل intronic الذي يمكن أن يخدم وظيفة مماثلة في N-terminus. لقد أنشأنا أيضًا وحدات تحتوي على علامات حلقية V5 و 6 xHis جيدة التوصيف. يمكن أن تكون الوحدات النمطية الأخرى هي تلك الترميز لمجالات البروتين التي تستهدف البروتينات إلى عضية (على سبيل المثال NLS وتسلسل استهداف الميتوكوندريا) ، وهو تطبيق سبق إثباته [9]. ال أتبتم إنشاء منتجات PCR المحاطة في اثنين من PCRs المتسلسلة ، مع مجموعتين من البادئات المتداخلة جزئيًا (انظر قسم الطرق). يتم توفير تسلسل الاشعال المستخدمة لإنشاء المجموعة الحالية من الوحدات الوظيفية كملف إضافي 3: الجدول S1. نظرًا لأن جميع الوحدات في كل فئة (N- أو C-terminal) تم استنساخها بنفس الطريقة في pDONR-P4-P1R أو pDONR-P2R-P3 ، فقد كانت قابلة للاستبدال بالكامل ومنحت الطابع التوافقي المطلوب لمجموعة الأدوات.

بناء النماذج الأولية لبروتين الاندماج والتعبير عنها

قمنا ببناء لوحة من النواقل للتعبير عن بروتينات الاندماج من أجل اختبار جدوى مجموعة أدوات الاستنساخ الخاصة بنا. تم الحصول على هذه المتجهات من خلال تفاعلات إعادة تركيب بوابة MultiSite بين البلازميدات التي تشفر الوحدات الطرفية N ، و ORFs ذات الأهمية ، والوحدات الطرفية C ، ومتجه التعبير الوجهة pEF5 / FRT / V5 / DEST-R4-R3 الموصوف أعلاه. إعادة التركيب بوساطة LR clonase بين المتوافقة Att أنتجت المواقع على البلازميدات المشاركة ORF خياليًا استبدل كاسيت البوابة المصمم هندسيًا على البلازميد pEF5 / FRT / V5 / DEST-R4-R3. ال AttB1 / attB2 المواقع المرافقة لـ AttR4 / AttR3 لم يتم استهداف كاسيت البوابة بواسطة LR-recombinase [13]. أنتج التعبير عن ORFs بروتينات اندماج حيث تم فصل الأجزاء المكونة الثلاثة بواسطة أذرع رابط الببتيد الناتجة عن ترجمة اتب 1 و AttB2 المواقع المرافقة لبروتين الفائدة (انظر أعلاه). منذ المنبع اتب 1 و اتب 4 توجد مواقع إعادة التركيب بين مروج EF1α وكودون بدء الترجمة للوحدة الطرفية N ، و AttB3 والمصب AttB2 تقع المواقع خارج كود الإيقاف في الوحدة الطرفية C ، ولن يشارك أي منها في المنتج المترجم (الشكل 2 ، اللوحة 4). على الرغم من أنه يبدو أنه لا يوجد تحليل منهجي للتداخل الوظيفي المحتمل للبقايا AttB1 / attB2 مواقع في التعبير عن بروتينات الاندماج [10] ، وجدت الدراسات الفردية أن هذه المواقع إما محايدة [16] أو ضارة [17] للتعبير البروتيني ، ومن هنا جاءت الحاجة إلى تقييم مدى ملاءمتها للتطبيقات المقصودة. يتم سرد بروتينات الاندماج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا النهج في الجدول 2 وتم تجميعها في مجموعات توضح بعض إمكانيات مجموعة أدوات الاستنساخ. تسلط المجموعة الأولى الضوء على الجانب الاندماجي لمجموعة الوحدات الوظيفية ، حيث إنها تتكون من بروتينين اندماج يشتركان في الوحدات الطرفية N والمركزية (أي البروتين محل الاهتمام) ولكن يتم دمجها مع بروتينات الفلورسنت المختلفة في C- نهاية. قد يكون هذا مفيدًا لتحسين بروتينات الانصهار الفلورية نظرًا لأنه يمكن إنتاج مجموعات مختلفة مقدمًا واختبارها لوجود عائق ستيركي ، واستقرار اندماج ضعيف ، وتداخل وظيفي عن طريق قلة قلة الوحدة النمطية الفلورية [18]. علاوة على ذلك ، سيوفر أيضًا بعض المرونة لتصميم تجارب التعايش ، لأن بروتينات الاندماج ذات أطياف الانبعاث المختلفة ستكون متاحة لتناسب كل حالة (انظر اللوحة أ ، ملف إضافي 4). تتكون هذه المجموعة من بروتينين اندماج يحتويان على مستقبل تنشيط البروتين PAR2 (V5-6xHis: PAR-2: mKate2 و V5-6xHis: PAR-2: EGFP ، الشكل 4A). تمثل المجموعة الثانية إمكانية توليد طفرات في ORF ذات الأهمية بينما لا تزال في استنساخ الدخول. بهذه الطريقة ، سيكون بناء مكتبة طفرية واحدة كافيًا لإعداد مجموعة من مكتبات ناقلات التعبير ليتم فحصها على أنظمة نماذج مختلفة (خلايا الثدييات ، الخميرة ، إلخ) أو مع مراسلين مختلفين. هذا من شأنه أن يتجنب الحاجة إلى المرور بتفاعلات الطفرات المستقلة لإنشاء مكتبات تستند إلى نواقل تعبير مختلفة (انظر اللوحة B ، ملف إضافي 4) ، ويجب أن يكون مفيدًا في دراسة آثار طفرات النقاط أو عمليات الحذف على وظيفة البروتين محل الاهتمام (مثل الاتجار داخل الخلايا). تشتمل هذه المجموعة على نموذج من النوع البري (wt) بالإضافة إلى حذف N-terminal للماوس sirtuin SIRT1 (ΔN-t-SIRT1 ، الشكل 4 أ) ، كلاهما N منصهر نهائيًا إلى mKate2. يؤثر هذا الحذف على أول إشارة موقع نووي (N1) وقد ينتج عنه تغييرات في التوزيع داخل الخلايا للبروتين [19]. أخيرًا ، تمثل المجموعة الثالثة الترتيبين المحتملين لبروتين الاندماج مع وحدات وظيفية تحيط بـ ORF محل الاهتمام (انظر اللوحة C ، ملف إضافي 4). إن القدرة على توليد البروتينين مقدمًا تسهل تحديد الترتيب الذي يسبب أقل تداخل في وظيفة البروتين. يتكون مثالنا من اثنين من بروتينات الاندماج حيث تم وضع بروتين الفلورسنت الأحمر البعيد mKate2 [20] وشريط العلامة الحلقية V5-6xHis إما N-terminal أو C-terminal بالنسبة للوحدة الفرعية p65 / RelA البشرية لـ NFkB (mKate2: p65 : V5-6xHis و V5-6xHis: p65: mKate2 ، الشكل 4A).

التعبير عن بروتينات الانصهار الفلوري. أ. تمثيل تخطيطي لبروتينات الاندماج التي تم إنتاجها من أجل اختبار جدوى مجموعة الأدوات الخاصة بنا ، مما يشير إلى لوحات الصور المجهرية في الشكل 4 ب حيث يتم عرض تعبير كل بروتين. يتم عرض المواضع النسبية لإشارات الموقع النووي (N1 ، N2) وإشارات التصدير النووي (E1 ، E2) في النوع البري الفأري (بالوزن) SIRT1. ΔN-tSIRT1 ، يشار إلى الجزء المحذوف من الشكل الإسوي بالوزن. تتجمع بروتينات الانصهار في مجموعات وظيفية ، كما هو موضح في النص الرئيسي. ب. الكشف عن اندماج البروتين الفلوري تحت مجهر epifluorescence. اللوحات a-d: التعبير عن PAR-2 ​​مدمج في mKate2 (أ ، ب) أو EGFP (ج ، د) في خلايا هيلا المنقولة بشكل عابر تحت ظروف تحكم (أ ، ج) أو بعد العلاج باستخدام ناهض خاص بـ PAR2 AC55541 (ألواح 5 ميكرومتر ، 1 ساعة ب, د). الشريط الأبيض: 10 ميكرومتر. اللوحات ه, F: التعريب التفاضلي للوزن- (هـ) أو ΔN-tSIRT1 (F) البروتينات المندمجة مع mKate2 في خلايا هيلا المنقولة بشكل عابر ، تحت ظروف تحكم. الشريط الأبيض: 10 ميكرومتر. اللوحات (ز ي): التعبير عن اندماجين مستندة إلى p65 / RelA مع mKate2 بعد انتقال عابر لنواقل التعبير الخاصة بهم إلى حيدات Raw264.7 ، تحت السيطرة (ز ، ط) أو الظروف المحفزة بـ LPS (ألواح 100 نانوغرام / مل ، 1 ساعة ح,ي). الشريط الأبيض: 10 ميكرومتر. تم التقاط جميع الصور المجهرية بتكبير 200X. ج . إطارات من فيلم فاصل زمني لـ Raw 264.7 monocyte منقولة مع ناقل التعبير لبروتين الاندماج PAR2-mKate2 وتم تصويره على مجهر متحد البؤر (عدسة موضوعية 63X) بعد إضافة 5 ميكرومتر AC55541 من أجل مراقبة الاتجار الخلوي للمستقبل . يتم توفير تجربة الفاصل الزمني الكاملة كملف إضافي 5: فيلم S1. يشار إلى الوقت المنقضي بعد إضافة ناهض في كل إطار. السهم الأبيض في نقاط 20 min-panel في بعض الحويصلات داخل الخلايا التي تحمل علامة PAR2-mKate2 والتي يتم رؤيتها في ملف إضافي 5: فيلم S1.

تم نقل التركيبات الموضحة أعلاه بشكل عابر إلى خلايا لاختبار جدوى نهجنا (الشكل 4 ب ، اللوحات من الألف إلى الياء). في خلايا هيلا ، تم التعبير عن اندماج C- المحطة الطرفية لـ PAR-2 ​​مع mKate2 (الشكل 4B ، اللوحات أ ، ب) أو مع EGFP (اللوحات ج ، د) بشكل منفصل في تجارب تعداء عابرة. أظهرت الخلايا تحت ظروف التحكم توطين الانصهار الفلوري PAR-2 ​​في الغالب في حجرة حول النواة [21] ، مع وجود إشارة أضعف بالقرب من غشاء البلازما (أ ، ج). تسببت معالجة الخلايا باستخدام ناهض PAR-2 ​​الخاص بـ AC55541 في إعادة توزيع طفيفة للإشارة الفلورية من بروتين الاندماج الذي يتركز على منطقة أصغر حول النواة (ب ، د). أيضًا في خلايا هيلا ، أظهر التعبير عن وزن SIRT1 المندمج في mKate2 توطينًا نوويًا (الشكل 4 ب ، اللوحة هـ) ، لكن فقدان جزء N- طرفي من mSIRT1 الذي يشمل N1 ، تسبب في توطين بروتين الاندماج في السيتوبلازم (الشكل 4 ب) ، اللوحة و) بالاتفاق مع البيانات السابقة [19]. في حيدات Raw264.7 ، أظهر كل من mKate2: p65: V5-6xHis و V5-6xHis: p65: اندماج mKate2 (الشكل 4 أ ، المجموعة 3) توطين السيتوبلازم تحت ظروف التحكم (الشكل 4 ب ، اللوحات ز ، ط) ، كما هو متوقع [ 22]. علاج LPS للخلايا الناجم عن الإزاحة النووية لكل من بروتينات الاندماج (الشكل 4 ب ، الألواح ح ، ي). يشير وجود اختلافات طفيفة في التوزيع داخل الخلايا للفلورة بين الاندماجات المختلفة لنفس ORF (مقارنة اللوحات a و c ، أو g و i) إلى أنه قد تكون هناك تأثيرات مرتبطة بترتيبات الاندماج التي تستحق مزيدًا من البحث. إذا تم تأكيدها ، فإنها ستوضح فائدة استراتيجيتنا في الاستنساخ. كما أشرنا في قسم الخلفية ، قد تساعد دراسة السلوك داخل الخلايا لبروتين موصوف حديثًا في تحديد وظائفه المحتملة. قد تكون مجموعة أدوات الاستنساخ الخاصة بنا مفيدة لتوليد عمليات الاندماج لاستخدامها على وجه التحديد في مثل هذه الدراسات. يتضح هذا من خلال الملف الإضافي 5: الفيلم S1 ، حيث تم التعبير عن اندماج البروتين الفلوري الأحادي mKate2 إلى الطرف C لـ PAR-2 ​​في خلية أحادية خام 264.7 بواسطة ترنسفكأيشن عابر لـ pEF5 / FRT-DEST-R4- R3_V5-6xHis: PAR2: ناقل تعبير mKate2 ، وتم ملاحظته تحت مجهر متحد البؤر في تجربة الفاصل الزمني التي تهدف إلى تتبع سلوك البروتين بعد العلاج باستخدام ناهض PAR-2 ​​المحدد AC55541. يوفر الشكل 4 ج سلسلة من الإطارات الثابتة المستخرجة من تسجيل الفاصل الزمني في الأوقات المشار إليها بعد إضافة ناهض. تُظهر هذه التكتل الناجم عن الناهض واستيعاب غشاء البلازما المرتبط بغشاء PAR-2: انصهار mKate2 ، بالإضافة إلى وجود حويصلات داخل الخلايا تحتوي على البروتين الفلوري (الشكل 4C ، السهم) ، كما هو موضح سابقًا [21]. يمكن تقدير التهريب النشط حول النواة للحويصلات في فيلم الفاصل الزمني الكامل (ملف إضافي 5: الفيلم S1). يتوافق الملف الإضافي 6 فيلم S2 مع تسلسل زمني أقصر للخلية نفسها مسجلة تحت ظروف تحكم ، قبل إضافة الناهض مباشرة ، ويظهر تعبيرًا عن بروتين الاندماج في ارتباط مستمر بغشاء البلازما ، وكذلك في بعض الحويصلات داخل الخلايا التي تُظهر سلوكًا أكثر تواضعًا في الاتجار.

تم التعبير عن جميع بروتينات الاندماج الموصوفة أعلاه من pEF5 / FRT / V5 / DEST-R4-R3 ، وهو بلازميد مشتق من pEF5 / FRT / V5 / DEST (انظر أعلاه وقسم الطرق). هذا ناقل متوافق مع نظام FLP-In (تقنيات الحياة) ، والذي يسمح بتوليد استنساخ متساوي المنشأ مع تكامل بلازميد مستقر باستخدام مجموعة مختارة من خطوط الخلايا التي تحتوي على تسلسل إعادة تركيب FRT واحد في الجينوم (خطوط الخلايا FLP-In ). وبالتالي ، يجب أن يسهل نظامنا تجميع مكتبات ناقلات التعبير التي تتكون من اندماج بين وحدات وظيفية مختارة ومكتبة من الطفرات العشوائية لـ cDNA ، بحيث يمكن نقلها بشكل ثابت إلى خط خلية FLP-In وفحصها بحثًا عن طفرة تمنح سعى وراء الخصائص ، في حالة عدم وجود التلون النسيلي الناجم عن تأثيرات موضعية الجينوم. علاوة على ذلك ، لن يقتصر هذا على مكتبات الطفرات العشوائية ، ولكن يمكن أيضًا تطبيقه على المكتبات التي تتكون من مجموعات من cDNAs (على سبيل المثال ، مجموعة إطار القراءة المفتوحة Kinase البشرية القائمة على البوابة من مركز بيولوجيا أنظمة السرطان (DFCI) / معهد واسع ( معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا) [23]). سيكون نظامنا مفيدًا أيضًا في توليد البروتينات الكيميرية. وبالتالي ، يمكن تقسيم تسلسل تشفير البروتين إلى ثلاثة أجزاء في مواقع مناسبة لا تؤثر على البنية أو الوظيفة الرئيسية للبروتين ، مع استنساخ كل جزء في واحد من نواقل pDONR الثلاثة في مجموعة الأدوات. يمكن استنساخ الأشكال الإسوية المختلفة في عائلة من البروتينات بهذه الطريقة بحيث يمكن تبديل المجالات المتجانسة المستنسخة في نفس النوع من ناقل pDONR بين الأشكال الإسوية من أجل تحليل التأثير على وظيفة البروتينات. وبالمثل ، يمكن استنساخ مجموعة من المسوخات من مجال واحد مع ما تبقى من النوع البري ORF من أجل فحص المخلفات المتضمنة في وظيفة معينة. على الرغم من أننا لم نتطرق إلى هذه التطبيقات المحددة ، إلا أن العمل الرائد على مستقبلات الخميرة STE2 بواسطة Cheo وزملاؤه بإعداد مماثل [9] يشير إلى أنه يمكن استخدام تصميمنا في مثل هذه الدراسات.

ومن المثير للاهتمام ، أن بعض النسخ التي ترميز الوحدات الوظيفية في مجموعة الأدوات الخاصة بنا يمكن استبدالها مع تلك الموجودة في منصات مماثلة تم إنشاؤها باستخدام نفس مجموعة استنساخ بوابة MultiSite مثل مجموعتنا ، مما يزيد من عدد مجموعات بروتين الانصهار الممكنة. أحد الأمثلة هو المنصة المعروفة باسم Tol2Kit [24]. وهو يتألف من سلسلة من الحيوانات المستنسخة 5′- ، والمتوسطة- 3′ مرتبة في سياق عدة نواقل وجهة محددة لتكوين أسماك الحمار الوحشي ، وتم إنشاؤه لتسهيل الحصول على سلالات تعبر عن مجموعة متنوعة من بنيات minigene التي تتكون من Promer_coding التسلسل_3′tag الترتيبات [24]. مثال آخر هو نظام pTransgenesis [25] ، والذي يتكون من مجموعات من نواقل الدخول التي تم تطويرها في البداية لتسهيل بناء minigenes ليتم التعبير عنها في Xenopus سلالات ، ولكنها متوافقة أيضًا مع التولد في الكائنات الحية النموذجية الأخرى مثل ذبابة الفاكهةونماذج خلايا أسماك الزرد والثدييات ، مما يسهل دراسة الخصائص المحفوظة تطوريًا للأنظمة البيولوجية [25].أخيرًا ، أبلغ Nagels-Durand وزملاؤه مؤخرًا عن مجموعة جديدة من متجهات الوجهة المحددة للتعبير في Saccharomyces cerevisae التي تسمح بإعادة تركيب MultiSite استنساخ المروجين و ORFs وعلامات epitope جنبًا إلى جنب مع اختيار علامات الضمور وآليات النسخ المتماثل في هذا الكائن الحي النموذجي [26]. تتداخل بعض الوحدات الوظيفية الموصوفة في عملنا مع تلك الموجودة في هذه المنصات الأخرى (الجدول 1 و [24-26]) ، وقد تم استخدامها بنجاح للتطبيقات الموضحة فيه. يمكن أيضًا استخدام وحدات ترميز البروتين الفلوريسنت من مجموعة أدواتنا وكذلك من الأنظمة الأساسية الأخرى المذكورة أعلاه كمراسلين في مشاريع جديدة تهدف إلى توصيف المروجين المستوحى من ORFeome ، كما هو الحال في العمل الرائد لـ Denis Dupuy والمتعاونين [27] ، الذين أنشأ مكتبة من المناطق بين الجينات التي تضم عناصر تنظيمية للنسخ القريبة بالإضافة إلى 5 UTRs المستنسخة في ناقل pDONR P4-P1R ، واستخدمتها مع ORFs المشتقة من ORFeome للديدان الخيطية في تفاعلات استنساخ البوابة متعددة المواقع التي ولدت نواقل مع a المروج: ORF: مراسل ترتيب. تم استخدام هذه لاحقًا في دراسات الآليات التنظيمية التي تتحكم في نسخ الجينات وتوطين البروتين على مستوى الجينوم [27 ، 28].

على الرغم من توفر إصدار أحدث من مجموعة استنساخ MultiSite Gateway (MultiSite Gateway Pro) التي تسمح باستخدام أي متجه وجهة أحادية الجزء في تفاعلات إعادة التركيب المكونة من جزئين أو ثلاثة أو أربعة أجزاء دون مزيد من التعديل [29] ، اخترنا الإصدار السابق من المجموعة لأن هذا سيسمح باستخدام متجهات الدخول التي تحتوي على AttL1 / AttL2- محاط ORF للمصلحة كما تم الحصول عليه من مصادر عامة ، دون مزيد من الاستنساخ الفرعي. تم استبعاد هذا في إصدار Pro من المجموعة ، منذ ذلك الحين Att يجب أن تقع المواقع على متجهات دخول منفصلة بسبب تكوين المجموعة. وهكذا ، مع أ MultiSite Gateway Proمنصة استنساخ ، أي AttL1 / AttL2 لا يزال من الضروري تضخيم PCR واستنساخه في متجه pDONR واحد على الأقل مناسب لإصدار Pro من المجموعة قبل تفاعل إعادة التركيب MultiSite ، مما يضعف الميزة الممنوحة من التوافر الجاهز لـ استنساخ الدخول. في نهجنا ، تقتصر الهندسة بدلاً من ذلك على متجه الوجهة المختار ، والذي يمكن استخدامه مرة واحدة لإعادة تركيب بوابة MultiSite لتوليد بروتينات اندماج متعددة باستخدام نسخ الدخول غير المعدلة من المكتبة. ومع ذلك ، فإن منصات الاستنساخ التي تستخدم مجموعة MultiSite Gateway Pro ممكنة تمامًا وقد تم تطوير أحد هذه المنصات [30] ، مما يسمح بإنشاء متعدد الاستخدامات من minigenes لاستخدامها في ذبابة الفاكهة transgenesis للتعبير الخاص بالأنسجة عن البروتينات ، بما في ذلك مراسلي الفلورسنت. تم الإبلاغ عن المنصات في المنشورات السابقة ، مثل ذبابة الفاكهة مجموعة ناقلات البوابة التي ابتكرها مختبر مورفي في مؤسسة كارنيجي [31] ، و Saccharomyces cerevisae مجموعة من نواقل وجهة البوابة التي تم إنشاؤها في مختبر Lindquist [32] تسمح أيضًا بإنتاج بروتينات اندماج مباشرة مع كل من استنساخ الدخول المصنوع حسب الطلب أو المشتق من ORFeome ، نظرًا لأن مدخلاتها تتكون من البلازميدات التي تحتوي على ORFs المحاطة بـ AttL1 / AttL2 المواقع ، التي تُستخدم في عمليات إعادة تركيب LR أحادية الجزء لتوليد نواقل التعبير. في هذه المنصات ، على الرغم من ذلك ، يكمن التباين في متجهات الوجهة ، التي تحتوي على وحدات وظيفية مُدرجة مسبقًا عند 5 أو 3 بالنسبة إلى كاسيت البوابة القياسي ، والذي سيتم التعبير عنه في الإطار باستخدام ORF الذي يتم نقله عبر البوابة ذات الأهمية. نظرًا لأن الوحدات الوظيفية تكمن وراء Att يتطلب إنشاء هذه المنصات استنساخًا معقدًا لمشتقات كاسيت البوابة إلى عدد كبير من نواقل التعبير من أجل تحقيق العدد المطلوب من مجموعات الوحدات.

على الرغم من أن مجموعات الأدوات الخاصة ببناء بروتين الاندماج على أساس طرق الاستنساخ الموجهة بالتسلسل توفر تنوعًا وسهولة في الاستخدام ، فإن التأثير الوظيفي المحتمل لـ "ندوب" الببتيد التي تربط الوحدات (الناتجة عن ترجمة مواقع الاستنساخ المتبقية المتداخلة ، انظر أعلاه) ، يجب أن يكون تؤخذ في الاعتبار [33]. في ضوء ذلك ، فإن طرق الاستنساخ المؤتلف الأخرى الأكثر اقتصادا ، وغير الموجهة بالتسلسل ، "السلس" للانضمام إلى جزأين أو أكثر من شظايا الحمض النووي دون تشغيل متواليات دخيلة ، قد تمثل بديلاً جذابًا [34 ، 35]. ومع ذلك ، في أكثر الطرق غير الملحومة استخدامًا ، يجب تضخيم شظايا الحمض النووي المراد تجميعها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات التي توفر بعض التداخل المتسلسل في نهاياتها. يضمن توزيع هذه التداخلات التسلسلية بين الأجزاء أنها مُدمجة معًا بالترتيب المطلوب. في حالات أخرى ، يمكن استخدام أليغنوكليوتيدات "خياطة" التي تعمل كجسر يشمل نهايات التسلسلات غير ذات الصلة التي سيتم ربطها [35]. في كلتا الحالتين ، فإن إنشاء منصة استنساخ اندماجية تعتمد على هذه الأساليب قد ينطوي على معرفة مسبقة بالاندماج الذي سيكون ذا أهمية من أجل توفير الأدوات اللازمة مسبقًا. هذا من شأنه أن يحد إلى حد ما من تنفيذ الاستراتيجيات عالية الإنتاجية القائمة على استخدام الحيوانات المستنسخة المشتقة من ORFeome ، حيث سيتطلب تصميمًا قائمًا على الحالة ، وهو ليس ضروريًا عند الموصلات الخارجية العالمية (على سبيل المثال. Att المواقع) المستخدمة. علاوة على ذلك ، فإن تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للوحدات النمطية لبناء عمليات اندماج محددة سيتطلب فحص كل cDNAs الوهمي الناتج عن وجود طفرات غير مرغوب فيها ، في حين أن هذه الضوابط مطلوبة فقط في وقت الاستنساخ الفرعي إذا استمرت نفس الوحدات كإدراج بلازميد في السياق منصة قائمة على البوابة. في حالة عدم وجود حل مثالي قائم على إعادة التركيب ، يجب على المرء أن يفكر في ما هو الأفضل لتطبيق معين ، سواء كان تقليل مخاطر مواجهة تأثيرات وظيفية مشتقة من الندبة ، أو استخدام تطبيقات عالية الإنتاجية. ومع ذلك ، فإن هذا لا يمثل عقبة أمام استخدام كلا النهجين بطريقة تكميلية لأنه ، على سبيل المثال ، يمكن تحقيق تجميع الوحدات المركبة المشتقة من تسلسل بروتينين أو أكثر باستخدام الاستنساخ المترابط السلس ، ويمكن بعد ذلك دمج الوحدات الجديدة في منصات الاستنساخ القائمة على البوابة من أجل اندماجها مع الببتيدات الأخرى. ومن المثير للاهتمام ، أن منصات الاستنساخ غير القائمة على إعادة التركيب مثل Golden Gate و Golden Braid و MoClo [33 ، 36 ، 37] ، والتي أظهرت إمكانات كبيرة لقابلية التوسع في بناء نواقل التعبير متعددة الأجزاء ، يمكن أيضًا تكييفها للاستنساخ السلس من بروتينات الاندماج مع إمكانية استخدام وحدات ترميز الببتيد في التطبيقات عالية الإنتاجية. قد يسمح التصميم الدقيق لإستراتيجية الاستنساخ النموذجي ببناء بروتينات الاندماج بأقل مساهمة في تسلسل الندبة بين الوحدات [33 ، 36]. الجوانب السلبية هي أن هذه الأنظمة تتطلب أن تكون أجزاء الحمض النووي المستنسخة خالية من المواقع المستهدفة النادرة لأنزيمات تقييد IIS التي تستند إليها (قد يتطلب ذلك تعديل تسلسل الجزء قبل الاستنساخ) ، وأن ORFs ذات الأهمية لا يمكن يمكن استخدامها مباشرة من مجموعات ORF القائمة على البوابة ولكنها تتطلب تضخيم PCR مع بادئات توفر مواقع إنزيم التقييد المناسبة. بشكل عام ، يجب أن تكون الاعتبارات المذكورة أعلاه دليلًا للتطوير المستقبلي لاستراتيجيات الاستنساخ مع إمكانية استخدام وحدات ترميز الببتيد عبر منصات مختلفة.


الملخص

علم الجينوم الأفقي هو مجال جديد في علم الأحياء بدائية النواة يركز على تحليل تسلسل الحمض النووي في الكروموسومات بدائية النواة التي يبدو أنها نشأت من بدائيات النوى الأخرى أو حقيقيات النوى. ومع ذلك ، من المهم بنفس القدر فهم العوامل التي تؤثر على حركة الحمض النووي: البلازميدات والعاثيات واللينقولات. على الرغم من أن هذه العوامل تحدث في جميع بدائيات النوى ، إلا أن الجينوميات الشاملة لمجموعة الجينات المتنقلة بدائية النواة أو "Mobilome" تتخلف عن مبادرات الجينوميات الأخرى بسبب التحديات التي تختلف عن تحليل الكروموسومات الخلوية. يُظهر العمل الأخير الوعد بتحسين علم جينوم العناصر الجينية المتنقلة (MGE) والفرص اللاحقة للاستفادة - وتجنب المخاطر - من هؤلاء "مهندسي الوراثة الطبيعية". تصف هذه المراجعة MGEs ، وخصائصها المهمة في نقل الجينات الأفقي ، والفرص الحالية لتطوير جينوم MGE.


المقاومة الحمضية بكتريا قولونية O157: H7

مقاومة الأحماض (AR) هي قدرة البكتيريا على حماية نفسها من درجة الحموضة المنخفضة للغاية (& # x0003cpH 3.0). يعتبر الرقم الهيدروجيني المنخفض في المعدة (الأس الهيدروجيني 1.5 إلى 3.0) أحد الدفاعات الأولى ضد مسببات الأمراض المعوية المنقولة بالغذاء [54]. تزيد القدرة على البقاء في البيئة الحمضية للمعدة من فرصة استعمار البكتيريا للأمعاء والتسبب في العدوى. ترتبط مقاومة الأحماض بخفض الجرعة المعدية من مسببات الأمراض المعوية [60]. الجرعة المعدية المنخفضة هي واحدة من أفضل الخصائص المعروفة بكتريا قولونية O157: H7 ، مما يجعل هذه البكتيريا شديدة العدوى.

أبلغت مجموعة متنوعة من الدراسات عن AR من بكتريا قولونية سلالات O157: H7 [5 ، 12]. حددت هذه الدراسات ثلاثة أنظمة AR فعالة. يتطلب نظام AR الأول عامل سيجما البديل RpoS وقمع الجلوكوز. ال rpoS متحولة بكتريا قولونية تم التخلص من O157: H7 بأعداد أقل في الفئران والعجول المصابة تجريبياً. يتطلب نظام AR الثاني إضافة الأرجينين أثناء التعرض للحالة الحمضية. ديكاربوكسيلاز أرجينين (عدي) والمنظم عدي (CysB) تم الإبلاغ عنها في نظام AR الثاني هذا. يتطلب نظام AR الثالث الغلوتامات للحماية في حالة انخفاض درجة الحموضة. تشمل المكونات الأساسية لنظام AR هذا اثنين من أنزيمات الغلوتامات ديكاربوكسيلاز (جادا أو جادب)، والغلوتامات المفترضة ، & # x003b3-amino butyric acid antiporter (جادك). في حين أن هناك حاجة إلى واحد فقط من اثنين من decarboxylases الغلوتامات للحماية عند درجة الحموضة 2.5 ، فإن كلا من إنزيمات الغلوتامات ديكاربوكسيلاز مطلوبة عند درجة الحموضة 2.0. كشفت النتائج السابقة أن AR المعتمد على الغلوتامات هو الحماية الأكثر فعالية عند درجة الحموضة 2.0 في الوسط المعقد. بكتريا قولونية O157: H7 تمتلك ثلاثة أنظمة AR متداخلة ، لكن التحكم ومتطلبات نشاط AR تختلف في كل نظام AR.

بخلاف أنظمة AR الثلاثة ، هناك العديد من البروتينات المشاركة في AR من بكتريا قولونية تم تحديد O157: H7. تشمل هذه البروتينات chaperone HdeA ، وبروتين SspA المرتبط ببوليميراز RNA ، وبروتين Dps المرتبط بالحمض النووي. علاوة على ذلك ، فقد تبين أن التغييرات في غشاء جدار الخلية أو إنتاج حمض القولون ترتبط بنجاح AR. هكذا، بكتريا قولونية O157: H7 يستخدم أنظمة الواقع المعزز المختلفة بناءً على نوع البيئة الحمضية التي تتم مواجهتها بشكل طبيعي.


الإجراءات التجريبية

سلالات ووسائط النمو

يتم عرض البكتيريا والبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول التكميلي 1. بكتريا قولونية و شيغيلا تم نشرها في مرق Lysogeny السائل (LB Invitrogen ، Waltham ، MA) ، أو على وسائط صلبة تحتوي على 1.5 ٪ (وزن / حجم) أجار (Oxoid ، Basingstoke ، المملكة المتحدة). تم استخدام المضادات الحيوية بالتركيزات التالية: كاربينيسيلين ، 50 ميكروغرام مل -1 كلورامفينيكول ، 20 ميكروغرام مل -1 كاناميسين ، 50 ميكروغرام مل -1. ل شيغيلا، أحمر الكونغو (0.01٪ وزن / حجم ، التركيز النهائي) تمت إضافته إلى مرق الصويا التريبتي (Fluka ، Buchs ، سويسرا) للوسائط الصلبة. للاختيار على السكروز ، تم تعقيم 1٪ (وزن / حجم) التربتون (فلوكا) ، 0.5٪ (وزن / حجم) مستخلص الخميرة (فلوكا) والأجار كما هو مذكور أعلاه في الماء ، مع السكروز (التركيز النهائي 10٪ وزن / حجم) يضاف قبل صب الأطباق.

سلالة والبلازميد البناء

تم إجراء التلاعب في الحمض النووي في بكتريا قولونية تم تجميع DH5α والبلازميدات باستخدام مزيج رئيسي من NEBuilder HiFi DNA Assembly (New England Biolabs ، Ipswich ، MA). تم شراء جميع البادئات (الجدول التكميلي 2) من Sigma. ال sacB-neo R. تم تضخيم الكاسيت من pIB279 (Blomfield وآخرون.، 1991). تم استخدام Electroporation لتحويل الخلايا البكتيرية بالبلازميدات أو الحمض النووي الخطي. لإدخال الطفرات في الكروموسوم أو pINV ، تم إجراء إعادة التركيب الأحمر (Cherepanov and Wackernagel ، 1995 Datsenko and Wanner ، 2000) باستخدام منتجات PCR بما في ذلك

1 كيلو بايت من تسلسل المرافقة المنبع والمصب. بعد إعادة التركيب الأحمر في شيغيلا، عاثية P1فير تم استخدامه كما هو موضح سابقًا (McVicker and Tang ، 2016) لتحويل الطفرات إلى خلفية وراثية نظيفة لتقليل مخاطر الطفرات خارج الموقع التي أنشأها نظام λ Red. تم التحقق من جميع الطفرات بواسطة PCR والتسلسل.

فحوصات ثبات البلازميد الفوعة

نمت البكتيريا على أجار LB من المخزونات المجمدة ، وحضنت في درجات حرارة مختلفة ل

25 جيلًا (أي 25 ضعفًا) بعد النمو ، تم إعادة تعليق المستعمرات الكاملة في برنامج تلفزيوني ، وتم تخفيفها ، ثم صقلها لقياس عدد البكتيريا التي تؤوي pSTAB أو pINV مكسي ح::sacB-neo R. ، إما على وسائط تحتوي على كاناميسين (pSTAB + أو PAI + ، مقاومة كاناميسين) أو سكروز (pSTAB - أو PAI -) لاكتشاف وجود / عدم وجود sacB-neo R. كاسيت. تم استخدام مجموع هذه الأرقام لحساب العدد الإجمالي لوحدات CFU لتأكيد عدد الأجيال المنقضية. تم استبعاد المستعمرات من التحليل إذا كان لديهم

مقاومة السكروز بنسبة 100٪ (تشير إلى تأثير المؤسس). تم حساب أي اختلاف في معدلات نمو السلالات عن طريق قياس عدد الأجيال من خلال تقييم عدد CFU بدلاً من استخدام أوقات نمو معينة.

الأساليب الإحصائية والحسابية

تم تحويل البيانات إلى سجل (موزعة بشكل طبيعي) وتحليلها باستخدام غير مقترن ر-اختبارات ، أو انحدار خطي ، أو ANOVA أحادي الاتجاه أو ثنائي الاتجاه مع اختبارات مقارنات متعددة مناسبة كما هو موضح في مفاتيح الرسم البياني. تم افتراض الدلالة الإحصائية إذا ص & lt 0.05.


نتائج

تحديد العناصر الأنانية لتعديل التقييد الفريد في جينومات الميتوكوندريا katablepharid

نتج عن مبادرتنا الأخيرة لتقييم محتوى الجينوم الميتوكوندريا باستخدام تسلسل الجينوم المضخم أحادي الخلية (SAG) المأخوذ من العينات بيئيًا ، تسلسل الميتوكوندريا الكامل للعديد من المتقدرات البحرية غير المتجانسة [26]. النشر المعاصر الكامل مرسى Leucocryptos أكد جينوم الميتوكوندريا هوية mtDNAs المشتقة من SAG على أنها katablepharid [30]. الجينومات من mtDNA المتولدة من SAG و ليوكوكريبتوس كانت mtDNA متطابقة في مخزونها من جينات الميتوكوندريا الكنسية ، بما في ذلك تلك التي تشفر الحمض الريبي النووي النقال (الشكل 1 أ). لقد شاركوا التركيب في جميع أنحاء غالبية الجينوم ، بما في ذلك مواقع intron القريبة في rnl, قطعة خبز، و cox1 (رمادي في الشكل 1 أ) ، واحتفظت بثلاثة ORFs غير مخصصة في مواقع جينومية متطابقة (برتقالي في الشكل 1 أ). المناطق التي تفتقر إلى التوليف بين الجينومات الكاملة المشفرة atp9, rns، الاغلبية العظمى من الحمض الريبي النووي النقالs ، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من ORFs غير المعينة. من بين ثمانية ORFs غير مخصصة في هذه المنطقة من جينوم الميتوكوندريا katablepharid المشتق من SAG ، كان لثلاثة متماثلات في إل. مارينا (برتقالي في الشكل 1 أ) ، لكن خمسة لم يستردوا إل. مارينا البروتينات كأفضل النتائج باستخدام عمليات بحث BLASTx (أحمر في الشكل 1 أ). كان أحدها عبارة عن نوكلياز داخلي شديد التباين GIY-YIG homing ، وتم تحديد اثنين على أنهما إنزيمات تقييد ، وتم تحديد اثنين على أنهما سيتوزين methyltransferases (CMs) (الشكل 1 ب). تتألف إنزيمات التقييد و CMs من عنصرين وراثيين أنانيين من النوع II RM مشفر بالترادف يتكون كل منهما من نوكلياز داخلي مقيد و CM مشابه. على وجه التحديد ، تم تحديد جهازي katablepharid RMs على أنهما يتألفان من نوكلياز داخلي لتقييد HpaII (Kat-HpaII) و CM (Kat-HpaII-CM) ، بالإضافة إلى نووكلياز داخلي من نوع MutH / Restriction II (Kat-MutH) مع cognate cytosine-C5 methyltransferase (Kat-MutH-CM) (الشكل 1 ب). يُحاط نظام Kat-HpaII RM بتسلسلات شبه متطابقة (152/155-bp) قد تعكس التكامل الأخير لهذا العنصر الأناني (يظهر باللون البرتقالي في الشكل 1 ب) في katablepharid mtDNA.

(أ) يشفر K4 الميتوكوندريا SAG ستة ORFs (برتقالي) مع متماثلات في إل. مارينا ولكن مع عدم وجود تشابه مع أي حقيقيات نواة أخرى. تم العثور على خمسة ORFs في K4 ولكن ليس في إل. مارينا (أحمر). تشتمل هذه الجينات الخمسة على نوكلياز داخلي مفترض GIY-YIG ونظامين مفترضين RM ، يتكون كل منهما من نوكلياز داخلي و CM. أزرق ، جينات ترميز البروتين أرجوانية ، جينات الرنا الريباسي رمادية ، إنترونات. تتوفر بيانات contig جينوم الميتوكوندريا K1 و K4 على https://doi.org/10.6084/m9.figshare.7314728. (ب) التباين في العناصر الأنانية المكتشفة في جينومات مفردة و eDNA. تم إجراء PCR متبوعًا بتسلسل Sanger لتأكيد تكامل جينات العناصر الأنانية في K1 و K3 و K4 SAGs (أوضاع التمهيدي المشار إليها بواسطة الأسهم). حدد PCR لعينات eDNA منتجًا واحدًا له هوية تسلسل عالية (99.7 ٪) إلى K4 ومنتج فريد أقصر (2،264-bp) متوسط ​​الطول مقارنةً بـ K3 و K4. تمثل الخطوط الحمراء نتائج النسخ الفوقية (95٪ إلى 100٪ هوية) تم تحديدها من قاعدة بيانات نسخة MATOU (بيانات S1). اختصارات اسم الجينات: atp9، ATP synthase 9 فرعية W ، التربتوفان الحمض الريبي النووي النقال HpaII، نوكلياز HpaII سم، سيتوزين ميثيلاز MutHنوكلياز موث rns، جين صغير الرنا الريباسي. تم إنشاء الشكل 1 ب باستخدام الكلنكر [31] وتم تعديله يدويًا. ألوان ORF لا تتوافق بين الشكل 1 أ و 1 ب. CM ، cytosine methyltransferase eDNA ، DNA ORF البيئي ، إطار القراءة المفتوح RM ، تعديل التقييد SAG ، جينوم الخلية المفردة المتضخم.

أشار تحليل BLASTP لـ methyltransferases المفترضة مقابل قاعدة بيانات REBASE (http://rebase.neb.com تم الوصول إليه في يناير 2021) إلى أن Kat-HpaII-CM من المحتمل أن تكون محددة لتسلسلات التعرف على الحمض النووي لـ CCGG ، مع الجيبكتر (Flavobacteria) methyltransferase (الانضمام: ALJ03853.1) كأفضل نتيجة (59٪ هوية الأحماض الأمينية). علاوة على ذلك ، اقترح تحليل BLASTP أن Kat-MutH-CM من المرجح أن يتعرف على وجه التحديد على تسلسل التعرف على الحمض النووي لـ GATC ، مع إصابة الجزء العلوي بنقل ميثيل من Arenitalea lutea (Flavobacteria) (انضمام الجينوم: ALIH01000012.1 ، 74٪ هوية حمض أميني). اقترح تحليل نوكليازات مفترضة أيضًا أن Kat-HpaII كان محددًا لتسلسل التعرف على الحمض النووي CCGG ، مع المجاميع (γ- بروتيوبكتريا) نوكلياز داخلي (انضمام: RDE88890.1) كأعلى BLASTP ضرب (36٪ هوية حمض أميني) وأن نوكلياز Kat-MutH قد يكون محددًا لـ GATC ، يتعافى عندما أصاب BLASTP العلوي بروتين إصلاح عدم تطابق الحمض النووي من مانغروفيموناس (Flavobacteria) (الانضمام: KFB02001.1 ، 27٪ هوية حمض أميني).تفتقر منطقة 2،240-bp التي تشفر نظام Kat-HpaII / Kat-HpaII-CM RM إلى أي أشكال CCGG ، والتي من المتوقع أن تحدث بالصدفة مرة واحدة كل 752 نقطة أساس في ميتوكوندريا katablepharid ، بناءً على محتوى GC بنسبة 38٪ لهذا الغرض. جينوم عضوي. مجتمعة ، يتوقع تحليلنا أن المنتجات الجينية داخل كل زوج katablepharid RM تستهدف نفس تسلسل التعرف.

للتأكد من أن جميع المناطق المحددة لم تكن نتيجة التلوث أو القطع الأثرية لتجميع الجينوم ، قمنا بإعادة تضخيم المنطقة المقابلة للميتوكوندريا من عينات SAG DNA ، مما يؤكد أن بنية الجينات الأربعة للعنصر الأناني المحدد كانت موجودة في عينتين ( "katablepharid 1 (على سبيل المثال ،" K1 ")" و "katablepharid 4" (أي "K4")) (الشكل 1 ب) وأن الجينات مجاورة للميتوكوندريا katablepharid atp9 و rns الجينات. أكد تحليل PCR هذا أيضًا وجود متغير منخفض (في "katablepharid 3") ، والذي يتكون فقط من المنطقة الأمينية الطرفية لجين MutH-CM (الشكل 1 ب).

بعد ذلك ، أجرينا ثلاث تقارير PCR منفصلة ومستهدفة باستخدام الحمض النووي البيئي المستعاد من عينات المياه البحرية الموازية التي تم جمعها في نفس التاريخ ، ومن نفس الموقع ، مثل تلك التي تحتوي على الخلايا الفردية المصنفة لتسلسل الجينوم [26]. أكدت هذه التحليلات أيضًا أنه تم العثور على العناصر الأنانية بجوار جينات الميتوكوندريا وأن المنتجات لم تكن نتيجة لتضخيم الإزاحة المتعددة كجزء من خط أنابيب التسلسل أحادي الخلية. حددنا أيضًا كونتيجًا إضافيًا يمتلك شكلًا متوسطًا ومخفضًا من بنية جينات العنصر الأناني ، والتي تحتوي فقط على جين MutH-CM (الشكل 1 ب). في المجموع ، تم أخذ عينات من تضخيم أنظمة RM الشبيهة بالبكتيريا من جينومات الميتوكوندريا بشكل مستقل خمس مرات. بشكل جماعي ، تشير هذه النتائج إلى أن العناصر الجينية الأنانية RM قد تم دمجها في mtDNAs ، وأن هذه العناصر قد تعرضت لتغير تطوري سريع ، بما في ذلك فقدان الجينات / تقليل ORF.

لاستكشاف ما إذا كان يتم التعبير عن جينات العناصر الأنانية المحددة ، قمنا باستجواب مجموعة من بيانات النسخ الفوقية البحرية المتاحة للجمهور في Ocean Gene Atlas (OGA متاح على http://tara-oceans.mio.osupytheas.fr/ocean-gene- أطلس/). حددنا عددًا من النصوص حقيقية النواة من مواقع أخذ العينات البحرية المتنوعة جغرافيًا مع نسبة عالية من هوية النيوكليوتيدات إلى كات- HpaII, كات- HpaII-CM، و كات-موث-سم الجينات (بيانات S1) ، مما يدل على أن هذا العنصر الجيني الأناني يتم التعبير عنه من جينوم الميتوكوندريا katablepharid. يتم عرض المناطق المحددة في قاعدة بيانات نسخ MATOU_v1_metaT بهوية & gt95٪ في الشكل 1 ب. ومن المثير للاهتمام ، أن اثنين من contigs المستمدة من OGA RNAseq والتي أظهرت & gt99 ٪ هوية النوكليوتيدات لجين الميتوكوندريا Kat-HpaII تتكون من قراءات متسلسلة مأخوذة من مواقع متعددة في المحيط الهادئ وجنوب المحيط الأطلسي والمحيط الهندي والبحر الأبيض المتوسط. تضمنت هذه العينات عينات "السطحية" و "الحد الأقصى للكلوروفيل العميق". تشير هذه النتائج إلى أن نوكلياز Kat-HpaII نشط نسبيًا عبر مجموعة واسعة من بيئات المحيطات. علاوة على ذلك ، تضمنت تسلسلات نص OGA أحد contig الذي يعبر ملف trnW الجين وتسلسل المرافقة المتكرر المنبع لمجموعة جينات Kat-HpaII-CM / Kat-MutH-CM ، مما يدل على النسخ المشترك للميتوكوندريا.

يحتوي نظام Katablepharid Mitochondrial RM على أصل فلافوبكتيري

لاستكشاف أصل النشوء والتطور للعنصر الجيني الأناني ، أجرينا تحليلًا للتطور باستخدام نهج Bayesian وأقصى احتمالية ، مع التركيز على Kat-HpaII-CM و Kat-HpaII الكاملة الموجودة في مجموعة K4 [26] ، مثل Kat- تم العثور على MutH-CM و Kat-MutH ليس لهما وظيفة يمكن اكتشافها (تمت مناقشتها أدناه). أظهر نسالة نوكلياز التقييد أن جينات الميتوكوندريا تتفرع أساسًا إلى بكتيريا flavobacteria ، مع دعم ضعيف لحذاء التمهيد (S1A التين). في المقابل ، تحليل النشوء والتطور لـ Kat-HpaII-CM (S1B الشكل) وأظهرت المحاذاة المتسلسلة لكل من Kat-HpaII و Kat-HpaII-CM دعمًا قويًا للتمهيد (الشكل 2 أ) للعنصر الجيني الأناني للميتوكوندريا المتفرعة داخل كومة من البكتيريا المصفرة. لا يوجد حاليًا أي دليل على أن البكتيريا المفلطحة ، أو المواد الجينية المشتقة من البكتيريا المفلطحة ، لعبت دورًا في أصل حقيقيات النوى أو الميتوكوندريا [32،33]. علاوة على ذلك ، فإن مجموعات katablepharid SAG لا تحتوي على تسلسلات ملوثة واضحة شبيهة بالبكتيريا (S2 التين). على هذا النحو ، نستنتج أن العنصر الجيني الأناني قد تم نقله إلى جينوم الميتوكوندريا من الأنواع المانحة التي تتفرع داخل أو بالقرب من البكتيريا المفلطحة. أظهر تحليلنا للتطور أن العنصر الجيني الأناني يمثل فرعًا أطول في نسالة (الشكل 2 أ) ، مما يشير إلى سيناريوهات تطورية تتفق مع غزو جينوم mtDNA ، مثل الاختيار الإيجابي و / أو المريح.

(أ) تمت إعادة بناء سلالة متسلسلة باستخدام متواليات من K4 و 38 نوعًا بدائية النواة تحتوي على بروتينات HpaII-CM و HpaII المشفرة بالترادف. نتج عن التسلسل طول محاذاة 767 موضعًا من مواقع الأحماض الأمينية. قيم الدعم هي الاحتمالات اللاحقة المحسوبة باستخدام MrBayes v3.2.6 [34] و 100 نسخة مكررة من bootstrap باستخدام RAxML v8.2.10 [35] وتم الإبلاغ عنها على أنها MrBayes / RAxML. يتم عرض طوبولوجيا MrBayes. يشار إلى الأنواع الشعبة كفروع ذات ألوان مختلفة كما هو موضح في الشكل الداخلي. الأجزاء ذات الدعم الأقل من 0.9 / 50 غير موسومة. للأشجار الفردية من HpaII و HpaII-CM ، انظر S1 التين. تتوفر بيانات المحاذاة على http://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.5336963. (ب) مقارنات زوجية لمجموعات من ترددات الكودون البديلة لـ Kat4-HpaII-CM / HpaII ، الجيبكتر-HpaII-CM / HpaII ، وذخيرة جينات ترميز البروتين المحفوظة لـ Kat4 mtDNA. تظهر المقارنات الزوجية في الشبكات المعنية. يظهر المفتاح شبكة مع الأحماض الأمينية المقابلة. يتم عرض نتائج اختبارات فيشر الدقيقة التي تقارن استخدام الكودون لكل حمض أميني في الجداول. تشير العلامات النجمية إلى استخدام كودون مختلف بشكل كبير ، وتشير "-" إلى عدم وجود فرق كبير في ترددات الكودون ، وتشير "NA" إلى ميثيونين وتريبتوفان ، اللذين لم يتم اختبارهما لأن هذه الأحماض الأمينية مشفرة بواسطة كودون واحد. يتم وضع الشبكات على دائرة رمادية بين مجموعات الجينات الثلاث المقارنة لتحديد نتائج كل مقارنة زوجية. البيانات الأولية متوفرة في بيانات S2. mtDNA ، الحمض النووي للميتوكوندريا RM ، تعديل التقييد.

لمزيد من استكشاف طبيعة تطور التسلسل المرتبط بحدث HGT هذا ، قمنا بحساب ترددات استخدام الكودون لـ Kat4-HpaII RM ، وذخيرة جينات ترميز البروتين المحفوظة لـ Kat4 mtDNA ، و الجيبكتر-HpaII RM. باستخدام اختبارات فيشر الدقيقة ، أظهرنا أن استخدام الكودون كان مختلفًا بشكل كبير بالنسبة لـ 14 من الأحماض الأمينية عند مقارنة تكملة Kat4 لبروتينات الميتوكوندريا الأسلاف بشكل لا لبس فيه. الجيبكتر-HpaII RM. في المقابل ، يمثل Kat4-HpaII RM وسيطًا ، يعرض ستة أحماض أمينية مع استخدام كودون يختلف عن Kat4 mtDNA (مرة أخرى أخذ عينات من جميع بروتينات الميتوكوندريا الأسلاف بشكل لا لبس فيه) ، وسبعة أحماض أمينية مع استخدام كودون يختلف عن ذلك من الجيبكتر-HpaII RM (الشكل 2 ب ارى بيانات S2 للبيانات الخام). تتوافق هذه البيانات مع الفرضية القائلة بأن Kat4-HpaII RM في طور التحسين نحو خصائص تسلسل mtDNA المضيف. قد تكون هذه التغييرات أيضًا ، جزئيًا ، محركًا و / أو نتيجة لمعدل التطور المتسارع الذي يشير إليه الفرع الطويل الذي يتكون منه العنصر الأناني katablepharid في أشجار النشوء والتطور (الشكل 2 أ).

تأكيد وجود الميتوكوندريا الوظيفية katablepharid methyltransferase

لاستكشاف وظيفة العنصر الأناني واختبار ما إذا كان قد خضع لعملية تكوين كاذب ، قمنا باستنساخ Kat-HpaII-CM وأقرب متماثل بكتيري له من حيث هوية التسلسل ، الجيبكتر HpaII-CM (Alg-HpaII-CM) إلى بلازميد pACYC184 وعبر عنها في ه. القولونية Top10 خلايا. هذه ه. القولونية لا تحتوي السلالة على أي ميثيل ترانسفيرازات تستهدف تسلسل التعرف على HpaII-CM المفترض (CCGG) ، ولكنها بدلاً من ذلك تعبر عن Dcm methylase ، الذي يقوم بميثيل بقايا السيتوزين الثاني في CCWGG [36] ، و Dam methylase ، الذي ميثيل بقايا الأدينين في تسلسل GATC [ 37]. معربا عن HpaII-CM ه. القولونية تمت زراعة سلالات Top10 لمدة 16 ساعة جنبًا إلى جنب مع سلالة تحكم تؤوي بلازميدًا فارغًا. تم بعد ذلك استخلاص هذه البلازميدات ، وخطيها وإخضاعها لتحويل بيسلفيت ، وهي عملية تحول نيوكليوتيدات السيتوزين إلى اليوراسيل ولكنها لا تغير 5-ميثيل سيتوزينات الميثيل (5-مولار). تم تضخيم منطقة 299 نقطة أساس لكل بلازميد وتسلسلها. في البلازميد من سلالة التحكم ، ظهرت جميع مواقع CCGG على أنها TTGG في التسلسل اللوني ، في حين أن البلازميدات المتسلسلة من السلالات التي تعبر عن Kat-HpaII-CM أو Alg-HpaII-CM تحتوي على مواقع TCGG (الشكل 3 أ) ، مما يدل على قدرة Kat-HpaII-CM على ميثيل تسلسل CCGG في قاعدة السيتوزين الثانية.

(أ) تحويل بيسلفيت لتحديد تعديل 5-ميثيل سيتوزين بواسطة katablepharid HpaII-CM. رسم تخطيطي لبروتوكول تحويل بيسلفيت لتقييم تعديلات 5-ميثيل سيتوزين. تمت تنقية البلازميدات من ه. القولونية تعرض Top10 وتحويل بيسلفيت لتحويل السيتوزين إلى اليوراسيل (تم استبداله بالثيمين أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل) ، بينما يظل 5-ميثيل سيتوزين (5-مولار) غير متأثر. علاوة على ذلك ، تم اكتشاف بقايا 5-mC داخل منطقة التضخيم عندما كان katablepharid HpaII-CM موجودًا على البلازميد pDM040. والجدير بالذكر أن كل موقع مميثل (مشار إليه باللون الأزرق) كان موجودًا في CCGG ، وهو تسلسل التعرف على HpaII (تحته خط). (ب) كفاءة تحويل ه. القولونية سلالات عندما تتحول مع katablepharid المفترضة HpaII-CM. كفاءة تحويل ه. القولونية سلالات DH5α و Top10 عند تحويلها باستخدام تحكم ناقل فارغ (pACYC184) أو ناقل يحتوي على تسلسل ترميز ميثيل ترانسفيراز المفترض katablepharid (pDM40). تم إجراء التجارب من ثلاث دفعات من الخلايا المختصة المستقلة على الأقل ، وتم تعداد وحدات CFU وتوحيدها إلى عنصر التحكم الإيجابي (pACYC184) داخل كل دفعة. توضح هذه البيانات أن katablepharid HpaII methyltransferase هو مادة سامة في ه. القولونية DH5α (مكرا+) ، ولكن ليس في Top10 (مكرا-). تمثل أشرطة الخطأ انحرافًا معياريًا واحدًا عن المتوسط. البيانات الأساسية في S3 البيانات. (ج) نمو ه. القولونية أعلى 10 خلايا مع مجموعات من البلازميدات التي تحتوي على katablepharid المفترض ميثيل ترانسفيراز (CM +) ، katablepharid HpaII (كات HpaII) و Algibacter HpaII (ألغ HpaII) أو النواقل الفارغة المقابلة ("لا يوجد CM مضاف" أو "لا يوجد REase مضاف" [نوكلياز داخلي للتقييد]). نمت الثقافات المكررة من المحولات المستقلة لمدة ثماني ساعات تحت اختيار Amp / Cm ، المستحثة باستخدام 0.0004 ٪ أرابينوز ، عند 37 درجة مئوية ، وتم تقييم النمو عن طريق قياس OD595 كل خمس دقائق. أظهرت السلالة التي تفتقر إلى نوكلياز داخلية نموذجية ه. القولونية النمو ، مع إضافة إما الجباكتير (ألغ) نوكلياز داخلي أو Katablepharid (كات) تسبب نوكلياز داخلي للسلالة التي تفتقر إلى ميثيل ترانسفيراز في حدوث تسمم. (د) أدت إضافة katablepharid methyltransferase (CM +) إلى إنقاذ هذه السمية إلى مستويات قريبة من النمو (تم نقل عناصر التحكم من ج). تمثل أشرطة الخطأ انحرافًا معياريًا واحدًا عن المتوسط. البيانات الأساسية لـ C و D في بيانات S4. CFU ، وحدة تشكيل مستعمرة CM ، سيتوزين ميثيل ترانسفيراز.

لتأكيد وظيفة Kat-HpaII-CM ، قمنا بتحويل البلازميد الذي يعبر عن تسلسل katablepharid إلى ه. القولونية سلالة DH5α. تقوم هذه السلالة بترميز McrA ، الذي يشق تسلسل الحمض النووي الميثيل في السيتوزين الثاني لعزر التعرف على HpaII (C me CGG) [38]. كعنصر تحكم ، قمنا أيضًا بتحويل Kat-HpaII-CM إلى تنسيق مكرا- إي. القولونية سلالة Top10. أكدت مقارنات كفاءة التحويل أن katablepharid methyltransferase عالية السمية في mcrA + E.. القولونية خلفية DH5α (الشكل 3 ب) ، مما يدل أيضًا على أن Kat-HpaII-CM يشفر إنزيمًا وظيفيًا يقوم بميثيل مواقع CCGG.

بعد ذلك ، أجرينا تجارب تحويل وتسلسل بيسلفيت باستخدام Kat-MutH-CM. نحن هنا نستهدف منطقة 233 نقطة أساس بديلة من البلازميد لتمكين اكتشاف المثيلة المحتملة في مواقع GATC. ومع ذلك ، لم نعثر على أي دليل على أي مثيلة في GATC ، أو في مواقع أخرى ، بواسطة Kat-MutH-CM ، مما يشير إلى أن هذا الإنزيم ربما فقد نشاطه التحفيزي المحدد لـ GATC ، أو يتطلب عوامل إضافية للوظيفة ، أو طور وظيفة بديلة.

تأكيد نوكلياز ميتوكوندريا وظيفية katablepharid

لاستكشاف وظيفة نوكليازات مرشح ، قمنا باستنساخ المفترضة الجيبكتر نوكلياز HpaII (Alg-HpaII) ، نوكلياز داخلي شبيه بـ katablepharid MutH (Kat-MutH) ، و Kat-HpaII إلى ناقل تعبير pBAD ، حولت هذه البلازميدات إلى ه. القولونية، ومقارنة نمو الثقافة لكل سلالة ناتجة. لم يُظهر Kat-MutH الذي يعبر عن الإجهاد أي دليل على السمية ، مما يدل على ديناميكية نمو مماثلة لـ بكتريا قولونية سلالة تحتوي فقط على ناقل فارغ (S3 التين) ، ولم يتم متابعة وظائف Kat-MutH-CM و Kat-MutH. في المقابل ، نمت مزارع السلالات التي تعبر عن Kat-HpaII و Alg-HpaII ببطء ، بما يتوافق مع هذه الجينات التي تشفر نوكليازات داخلية وظيفية تشكل "سمًا" حسن النية (الشكل 3 ج). أظهر katablepharid HpaII فاعلية أكبر خلال هذه التجارب بالمقارنة مع الجيبكتر HpaII. من أجل اكتشاف ما إذا كانت وظيفة Kat-HpaII و Kat-HpaII-CM تعمل كزوج من السموم / مضاد للسموم ، فقد شاركنا في التعبير عن هذين البروتينين. أظهر هذا أن Kat-HpaII-CM كان قادرًا على عكس تأثيرات تعبير Kat-HpaII جزئيًا في ه. القولونية (الشكل ثلاثي الأبعاد). أدت التجارب اللاحقة التي زادت من التعبير عن إنزيم Kat-HpaII عن طريق إزالة ATG إضافي عند 5 ′ من التسلسل إلى اضطراب هذا الإنقاذ (S4 التين) ، مما يشير إلى أن الاختلافات في التعبير النسبي للسم / مضاد السم يمكن أن تحدد درجة السمية.

استهداف HpaII-CM و HpaII لميتوكوندريا الخميرة يؤكد أنشطة نقل الميثيل والنوكلياز الداخلي

لمزيد من استكشاف الأدوار المحتملة لـ Kat-HpaII-CM و Kat-HpaII في ميتوكوندريا katablepharid ، استهدفنا كل بروتين في ميتوكوندريا س. الخباز باستخدام تسلسل استهداف الميتوكوندريا الأميني-الطرفية Su9 (MTS) من نيوروسبورا كراسا [39]. احتوت البنايات أيضًا على علامة GFP كربوكسيل الطرفية للسماح بتأكيد توطين الميتوكوندريا ، وتم التحكم في البروتينات بواسطة محفز يحفز الجالاكتوز للسماح بالحث الزمني للتعبير الجيني. بعد تحريض su9 (MTS) -Kat-HpaII-CM-GFP ، قمنا بتسلسل منطقة من الميتوكوندريا كوكس 1 الجين التالي لتحويل بيسلفيت. كما رأينا بعد التعبير غير المتغاير في ه. القولونية، تم ميثلة مواقع CCGG لـ mtDNA ، مما يشير إلى أن Kat-HpaII-CM يمكن أن تعمل في سياق مصفوفة الميتوكوندريا (الشكل 4 أ). قمنا أيضًا بتسلسل هذه المنطقة من كوكس 1 الجين من أ س. الخباز سلالة تفتقر إلى بلازميد su9 (MTS) -Kat-HpaII-CM-GFP وأظهرت أن هذه البقايا لا يتم ميثليتها في الثقافات البرية.

(أ) تحويل بيسلفيت والتسلسل اللاحق لتأكيد استهداف HpaII-CM وظيفي لميتوكوندريا الخميرة. رسم تخطيطي لبروتوكول تحويل بيسلفيت لتقييم تعديلات 5-ميثيل سيتوزين بعد تحريض katablepharid HpaII-CM من البلازميد pDM072. تم الكشف عن بقايا 5-mC داخل منطقة التضخيم لـ cox1 الجين. كان كل موقع مميثل (مشار إليه باللون الأزرق) يقع في تسلسل التعرف على HpaII (تحته خط). (ب) تقييم مضان لـ HpaII-CM و HpaII الموسوم بـ GFP ، بالتزامن مع mtDNA المسمى DAPI. أظهر HpaII-CM التوطين المشترك مع DAPI ، بينما أظهر HpaII عدم وجود تركيز DAPI ، مما يدل على نقص mtDNA ، والذي من المحتمل أن يكون نتيجة لوظيفة نوكلياز داخلية وتدهور الحمض النووي. شريط المقياس = 3 ميكرومتر. (ج) يسبب تعبير HpaII تكوينًا صغيرًا. تكوين مستعمرات صغيرة (بيضاء بسبب نقص وظيفة سلسلة نقل الإلكترون) بعد تحريض HpaII (يمين) ، مقارنة بسلالة غير مستحثة (يسار). سم ، سيتوزين ميثيل ترانسفيراز.

قمنا بعد ذلك بتقييم ما إذا كان سيتم تجنيد su9 (MTS) -Kat-HpaII-CM-GFP إلى mtDNA عن طريق تلطيخ نوكليويد الميتوكوندريا باستخدام DAPI [40] ووجدنا أن katablepharid methyltransferase مشترك مع بؤر DAPI النقطية (الشكل 4 ب). عندما تم استهداف su9 (MTS) -Kat-HpaII-GFP للميتوكوندريا ، تم العثور على هذا البروتين أيضًا في نقاط النقاط ، ولكن ظهرت إشارة DAPI المترجمة بشكل مشترك غائبة ، مما يشير إلى أن mtDNA قد تدهور على الأرجح (الشكل 4 ب). تم دعم قدرة Kat-HpaII على إتلاف mtDNA من خلال زيادة تكوين مستعمرات صغيرة بعد تحريض su9 (MTS) -Kat-HpaII-GFP (الشكل 4 ج). مجتمعة ، تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن Kat-HpaII-CM و Kat-HpaII قادران على العمل داخل الميتوكوندريا لميثيلة وتحلل mtDNA.


نقاش

الريبوسوم عبارة عن آلة نانوية معقدة غير عادية تم حفظ مخططها بشكل كبير خلال التطور عبر جميع ممالك الحياة الثلاث (ميلنيكوف وآخرون.، 2012). يتضح هذا بشكل لافت للنظر عندما يقارن المرء ريبوسومات الخلايا حقيقية النواة البسيطة والأكثر تعقيدًا ، مثل الخميرة الناشئة والخلايا البشرية (بن شام وآخرون.، 2011 الغضب وآخرون.، 2013). أدى هذا التشابه إلى افتراض أن التكوين الحيوي للريبوسوم يجب أن يكون متشابهًا تمامًا في الخميرة والبشر. تشير الأبحاث الحديثة إلى أن هذا صحيح ، ولكن إلى حد ما فقط ، حيث بدأت الخصائص المهمة في الظهور (Sloan وآخرون.، 2013 Tafforeau وآخرون.، 2013). على سبيل المثال ، فإن exosome RNA المتضمن في معالجة ITS2 في الخميرة مطلوب أيضًا لنضج ITS1 في البشر ، ولا يبدو أن EndoRNase MRP ، الذي يشق ITS1 في الخميرة ، يلعب مثل هذا الدور في البشر (Sloan) وآخرون.، 2013 Tafforeau وآخرون.، 2013). مثل هذه الخصائص في معالجة ما قبل الرنا الريباسي تجعل من الضروري للغاية إجراء البحوث مباشرة على الخلايا البشرية. إذا كانت اعتلالات الريبوسومات - أي المتلازمات البشرية المرتبطة بخلل في تجميع الريبوسوم (Narla and Ebert، 2010) - تم تصميمها فقط في الخميرة الناشئة ، فقد يتم اختيار الأهداف العلاجية المحتملة لأسباب خاطئة وترك البعض الآخر دون أن يلاحظها أحد.

قمنا هنا بتمييز نوعين من ناقلات الميثيل البشرية بخصوصية تجاه الرنا الريباسي الصغير للوحدة الفرعية الريباسية.نظهر أن وجودها في الخلايا ، ولكن ليس نشاطها التحفيزي الميثلي لـ RNA ، لا غنى عنه لخطوات معالجة ما قبل الرنا الريباسي التي تؤدي إلى تخليق الرنا الريباسي 18S (الأشكال 4 و 5 و 7 و 8 والشكل التكميلي S3). نثبت أن DIMT1L مسؤول عن ن 6 ,ن 6 ثنائي الميثيل في المواضع أ1850 و أ1851 وأن WBSCR22 مطلوب من أجل ن 7 مثيلة في النوكليوتيدات G1639 (الشكلان 1 و 6 انظر أيضًا Haag وآخرون.، 2015). مواضع النوكليوتيدات هذه مكافئة لتلك التي تم تعديلها في الخميرة بواسطة ميثيل ترانسفيرازات المتماثلة. نظهر أن WBSCR22 يتفاعل مباشرة مع TRMT112 ، مكونًا مغايرًا مغايرًا ، وأن البروتين الأخير مطلوب لتحقيق الاستقرار الأيضي للأول (الشكل 3). مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى الحفاظ القوي على وظائف Dim1 / DIMT1L و Bud23-Trm112 / WBSCR22-TRMT112 في الخميرة والخلايا البشرية (لافونتين وآخرون.، 1994، 1995 أبيض وآخرون.، 2008 فيجارو وآخرون.، 2012 Sardana and Johnson، 2012 Létoquart وآخرون., 2014).

في أواخر السبعينيات ، كشف تحليل بصمات الأصابع أن كلا من m 7 G و التعديلات هي أحداث النضج المتأخرة في الخميرة الناشئة (العلامة التجارية وآخرون.، 1977). تم اقتراح أن m 7 G يتم إدخاله في سلائف الرنا الريباسي قبل 18S في النواة ، وهذا يتم تصنيعه بعد تصدير الرنا الريباسي قبل 18S إلى السيتوبلازم ، قبل المعالجة النهائية (العلامة التجارية وآخرون.، 1977). على هذا الأساس ، تم استخدام ثنائي الميثيل بوساطة Dim1 كعلامة ملائمة لأحداث التجميع السيتوبلازمية المتأخرة (على سبيل المثال ، Grandi وآخرون.، 2002 شافر وآخرون.، 2003 فيجارو وآخرون.، 2012). أكد رسم خرائط التمديد التمهيدي أنه ، في الخميرة الناشئة ، كلاهما م 7 جم1575 و يتم تقديمها على مستوى 20S pre-rRNA ، السلائف المباشرة لـ 18S rRNA (Lafontaine وآخرون.، 1995 ليتوكوارت وآخرون.، 2014). تم الإبلاغ منذ فترة طويلة عن أن ثنائي الميثيل في خلايا هيلا يعد تعديلًا متأخرًا للرنا الريباسي 18S (Salim and Maden ، 1973) ، ولكن لم يتم تحديد ما إذا كان قد حدث في النواة أو السيتوبلازم في البشر. باستخدام تعيين التمهيدي التمهيدي ، اكتشفنا في خلايا هيلا مع قليل النوكليوتيد الذي يختار 21S قبل الرنا الريباسي وسلائفه (الشكل 6). نظرًا لأن هذه المواد الوسيطة قبل الرنا الريباسي هي نووية ، فإننا نستنتج أن ثنائي الميثيل في الخلايا البشرية ، على عكس خلايا الخميرة (العلامة التجارية وآخرون.، 1977) ، هو حدث نووي.

من غير الواضح في هذه المرحلة ما إذا كانت تعديلات RNA فردية معينة ، مثل مثيلة القاعدة النادرة ، تعمل كنقاط فحص لمراقبة الجودة أثناء التكوُّن الحيوي للوحدة الفرعية. الاحتمال الجذاب هو أنهم قد يساهمون في إرسال إشارات لآلات التجميع إلى أن خطوات النضج الرئيسية قد اكتملت. سوف تلتزم Preribosomes بعد اجتياز هذا الحاجز بخطوة التجميع التالية ، وسيتم إحباط الآخرين (انظر المناقشة اللاحقة حول المراقبة). لأن هو حدث نووي في الخلايا البشرية ، فيمكنه ، على سبيل المثال ، إلزام وحدات فرعية قبل 40 ثانية للتصدير إلى السيتوبلازم.

تم تحديد عدة مئات من عوامل تجميع الريبوسوم في الخميرة الناشئة ، ومؤخرًا في الخلايا البشرية (Wild وآخرون.، 2010 Tafforeau وآخرون.، 2013 وولفورد وباسرجا ، 2013). يواجه المجال الآن مهمة شاقة تتمثل في تخصيص وظائف محددة لهم ، وتحديد مواقع أو ركائز الارتباط الخاصة بهم على ريبوسومات السلائف ، وتحديد توقيت تدخلهم - أي التسلسل الدقيق للأحداث. نوضح هنا أن DIMT1L متورط في خطوات معالجة سابقة من WBSCR22-TRM112 (الشكلان 4 و 5 والشكل الإضافي S3). هذا يتوافق مع المواقع الخلوية ذات الصلة لهذه البروتينات: النواة والنيوكليوبلازم. يتوافق التوطين النووي لـ WBSCR22 مع التقارير السابقة (Nakazawa وآخرون.، 2011 Ounap وآخرون.، 2013) ، لكن هذه الدراسات فشلت في اكتشافه في الحويصلات حول النواة (انظر المناقشة لاحقًا).

الخلايا التي تفتقر إلى DIMT1L تتراكم في 43S و 26S و 21S / 21S-C pre-rRNAs. ومن ثم فإن الانقسامات التي تحدث في المواقع A0 و 1 ، والتي عادة ما تكون مصاحبة ، يتم فصلها في هذه الخلايا ، ويتم منع الانقسام في المواقع 1 و C و E. الخلايا التي تفتقر إلى WBSCR22 أو TRMT112 تتراكم السلائف 18S-E. يشير هذا إلى تثبيط الانقسام في الموقع 3 ، وهي خطوة معالجة تم الإبلاغ عن حدوثها في السيتوبلازم (Mullineux and Lafontaine ، 2012). التفسير المحتمل لهذا النمط الظاهري للمعالجة هو أنه في غياب WBSCR22-TRMT112 ، لا يتم ببساطة تصدير البريبوسومات إلى السيتوبلازم. بالاتفاق مع هذه الفرضية ، لاحظ الباحثون الاحتفاظ بالمركب الفلوري المسمى قبل 40 ثانية في النواة عند استنفاد WBSCR22 (Wild وآخرون.، 2010) ، والأشكال الممتدة 3′ من 18S-E التي تتراكم في ظل هذه الظروف تم الإبلاغ عنها أنها نووية (Haag وآخرون., 2015).

لأنه يتم الإبلاغ عن الاختلافات الدقيقة في معالجة ما قبل الرنا الريباسي بين خطوط الخلايا (على سبيل المثال ، سلون وآخرون.، 2014) ، اختبرنا تأثيرات استنفاد DIMT1L و WBSCR22-TRMT112 على معالجة ما قبل الرنا الريباسي في أنواع خلايا متعددة: خطوط خلايا سرطان عنق الرحم والقولون ، وخلايا الكلى الجنينية ، والخلايا الليفية الرئوية الأولية (الأشكال 4 و 5 و 7 و 8 والشكل التكميلي S3). كانت أنماط المعالجة التي لوحظت متشابهة إلى حد كبير ، لكننا لاحظنا بعض الاختلافات. على سبيل المثال ، لم يؤثر استنفاد DIMT1L بشدة على تراكم الرنا الريباسي الناضج في خلايا هيلا ، ولكنه قلل من مستوى الرنا الريباسي 18S في أنواع الخلايا الأخرى التي تم اختبارها.

بالنظر إلى الروابط العديدة بين p53 وتركيب مكونات الريبوسوم من جهة (Ruggero and Pandolfi ، 2003) وبين السلامة الوظيفية للنواة واستقرار التمثيل الغذائي p53 من جهة أخرى (جيمس وآخرون.، 2014 فلاتكوفيتش وآخرون.، 2014) ، قمنا بفحص ما إذا كان p53 قد يساهم بطريقة ما في عيوب المعالجة الملحوظة. استخدام زوج من خطوط خلايا سرطان القولون متساوي المنشأ التي تختلف فقط عن طريق التعبير عن p53 (Bunz وآخرون.، 1998) ، وجدنا أن p53 ليس له أي تأثير (الشكل 4). من الجدير بالذكر أن وصفنا لمتطلبات WBSCR22 في معالجة ما قبل الرنا الريباسي يتوافق مع التقارير الأخيرة ويوسعها (Ounap وآخرون.، 2013 هاج وآخرون., 2015).

في الخلايا المستنفدة من DIMT1L أو WBSCR22-TRMT112 ، لاحظنا باستمرار شظايا سلائف الرنا الريباسي 18S المقطوعة التي ظهرت متشابهة في الطول (الأشكال 4 و 7 و 8 والشكل التكميلي S3). يشير هذا إلى أنه في حالة عدم وجود تجميع وحدة فرعية مخلص ، يتم تنشيط مواقع المعالجة المشفرة ، مما يؤدي إلى زيادة معدل دوران السلائف RNAs بسبب مراقبة محددة أو زيادة الحساسية لـ RNases الخلوية. قد تحدث مثل هذه المراقبة المحددة في بنية مستقطبة حول النواة متداخلة مع Golgi و lysosomes حيث تم اكتشاف WBSCR22-TRMT112 (الشكل 2). تنشط آليات المراقبة في جميع خطوات التكوُّن الحيوي للريبوسوم ، والغرض منها هو التعرف على الريبوسومات غير المجمعة واستهدافها للتطهير السريع (لافونتين ، 2010). من حيث المبدأ ، يمكن أن تحدث المراقبة في أي مكان في الخلية. يمكن أن يحدث في مراكز تحلل مخصصة ، مثل تلك الموصوفة في النواة ، والنيوكليوبلازم ، والمنطقة المحيطة بالنواة ، والسيتوبلازم (تمت مناقشته في لافونتين ، 2010). في الخميرة trm112Δ تخضع الخلايا ، ما قبل الرنا الريباسي لتدهور هائل ، ويتم قمع هذا النمط الظاهري عند تعطيل آلية المراقبة النووية عن طريق حذف الجين المشفر للبوليميراز متعدد (A) Trf4 أو Trf5 (Figaro وآخرون.، 2012). كلا هذين البروتينين هما وحدتان فرعيتان من مجمعات TRAMP التي تعمل كمحولات محددة لـ RNA Exosome (Schneider and Tollervey ، 2013). نحن نفترض أن WBSCR22-TRMT112 يمارس وظائف في المراقبة ، بالإضافة إلى كونه مطلوبًا لمعالجة ما قبل الرنا الريباسي ومثيلة الحمض النووي الريبي. نتوقع أيضًا أن تكون الحويصلات المستقطبة حول النواة التي توطين WBSCR22 و TRMT112 لها مراكز تدهور. من المثير للاهتمام ، أن عملية تسمى بالتهام الجزئي الجزئي للنواة (PMN) قد تم وصفها في الخميرة والتي خلالها تقوم الفجوة (ليسوسوم الخميرة) حرفياً "بقرص" أجزاء من النواة ، بما في ذلك النواة ، من أجل تحللها (روبرتس) وآخرون.، 2003 Kvam and Goldfarb ، 2006 تمت مناقشته في Lafontaine ، 2010). لا يزال يتعين التحقيق فيما إذا كانت وظيفة المراقبة الافتراضية لـ WBSCR22-TRMT112 في الخلايا البشرية قد تتعلق بعملية مشابهة لـ PMN في الخميرة.

استراتيجية محفوظة تطوريًا لربط الحمض الريبي النووي الريبي المعالج بتعديل أمين؟

أظهر تحليل متغيرات Bud23 و Dim1 التي تعاني من نقص تحفيزي في خلايا الخميرة أنه لا يوجد م 7 جم1575 ولا مطلوب للنمو ، على الأقل في ظل الظروف المختبرية المثلى (لافونتين وآخرون.، 1998 أبيض وآخرون.، 2008 Létoquart وآخرون.، 2014). من ناحية أخرى ، يعد كل من Dim1 و Bud23-Trm112 ضروريين أو مهمين لنمو الخلايا (لافونتين وآخرون.، 1994 أبيض وآخرون.، 2008 فيجارو وآخرون.، 2012). يرتبط Dim1 و Bud23-Trm112 مع الريبوسومات الأولية المبكرة (Schafer وآخرون.، 2003 فيجارو وآخرون.، 2012) ومطلوبة لخطوات معالجة ما قبل الرنا الريباسي النواة المبكرة (لافونتين وآخرون.، 1995 أبيض وآخرون.، 2008). تحدث التعديلات المقابلة لاحقًا ، على سلائف الرنا الريباسي قبل 18S (Létoquart وآخرون.، 2014). في حالة ، يحدث التعديل في السيتوبلازم (العلامة التجارية وآخرون.، 1977). هذه الملاحظات لها تأثيران مهمان. أولاً ، لا يحدث التعديل في وقت ربط ميثيل ترانسفيراز بالجسيمات الأولية. وهذا يعني أن هناك تأخيرًا منظمًا وتنشيطًا تحفيزيًا محددًا لميثيل ترانسفيراز. من المفترض أن هذا ينطوي ببساطة على اكتساب الركيزة للكفاءة للتعديل بعد النضج الكافي لاعتماد التشكل المناسب (المنتج). ثانيًا ، نظرًا لأنه لا تتم معالجة سوى ما قبل RNAs التي تربط ميثيل ترانسفيراز ، فمن المقرر تعديل جميع RNAs المشقوق. نحن نفسر هذا على أنه دليل قوي على وجود رقابة صارمة على الجودة (لافونتين وآخرون.، 1995 ، 1998). نتائجنا على الخلايا البشرية التي توضح أن الانقسام قبل الرنا الريباسي يتطلب وجود ميثيل ترانسفيراز ولكن ليس نشاطه التحفيزي يسمح لنا الآن بتوسيع نموذجنا إلى البشر. من اللافت للنظر أن آلية مراقبة الجودة المقترحة لإشراكها يبدو كذلك بدائيًا لأنه في البكتيريا ، فإن KsgA مطلوب أيضًا لمعالجة فعالة قبل الرنا الريباسي وينظم الخطوات الأخيرة لتشكيل الوحدة الفرعية قبل 30 ثانية (Connolly وآخرون.، 2008 Xu وآخرون., 2008 مقدمة).

الدور الدقيق لـ 18S rRNA m 7 G و التعديلات في وظيفة الريبوسوم ليست مفهومة تمامًا. من الواضح ، مع ذلك ، أن كلا التعديلين موجودان في مواقع ريبوزومية مهمة ومحفوظة (موقع فك التشفير وحافة بين الحمض النووي الريبي الموقع P و E) ، وغياب أي منهما يرتبط ، بطريقة أو بأخرى ، بأوجه القصور الترجمي. في الخميرة في مهدها ، خافت 1, برعم 23، و trm112 الطفرات شديدة الحساسية للمضاد الحيوي باروموميسين أمينوغليكوزيد (لافونتين وآخرون.، 1998 فيجارو وآخرون.، 2012 Létoquart وآخرون.، 2014) ، ونقص تحفيزي خافت 1 يظهر متحولة ضعف الترجمة في المختبر (لافونتين وآخرون.، 1998). في البكتيريا ، كسجا الطفرات مقاومة للمضاد الحيوي أمينوغليكوزيد كاسوجامايسين (هيلسر وآخرون.، 1971). في المختبر ، يتم تنقية الوحدات الفرعية الصغيرة من كسجاتُظهر الخلايا الناقصة -methyltransferase- تقاربًا منخفضًا للوحدات الفرعية الكبيرة والبادئ tRNA ، بينما في الجسم الحي ، يتسبب غياب ثنائي ميثيل الرنا الريباسي 16S في حدوث أخطاء انتقالية أثناء البدء والاستطالة ، بما في ذلك القراءة المتزايدة للطفرات غير المنطقية وطفرات تغيير الإطارات (فان بول) وآخرون.، 1984 van Knippenberg، 1986 Rife، 2009). أخيرًا ، التركيب البلوري لـ ثيرموفيلوس 30S وحدات فرعية تفتقر يكشف أن التعديل يسهل تفاعل التعبئة بالقرب من موقع فك التشفير ، بين الحلزونات 44 و 45 (الشكل 1) ، من خلال تكوين شبكة ربط هيدروجين واسعة النطاق (Demirci وآخرون.، 2010). يؤدي فقدان تفاعل الحزم هذا إلى اضطراب بنية الرنا الريباسي في مواقع A و P المجاورة للريبوسوم (Demirci وآخرون.، 2010) ، مما قد يفسر عيوب ترجمة كسجا المسوخ.

نظرًا للحفظ الشديد للآلية والآليات المشاركة في تصنيع m 7 G و التعديلات الأساسية ، يبدو من غير المحتمل جدًا أنها لا تساهم بأي فائدة لوظيفة الريبوسوم ، إذا كان ذلك فقط في ظل ظروف معينة لم يتم تحديدها (على سبيل المثال ، تحت الضغط ، أثناء التطوير ، إلخ). من المفترض أن تساعدنا الاستراتيجيات التجريبية عالية الدقة والإنتاجية ، مثل التنميط الريبوسوم وقياس الطيف الكتلي الكمي ، في فهم ما تفعله هذه التعديلات بالضبط في الترجمة.

في الختام ، يقدم عملنا رؤى جديدة مهمة حول وظيفة اثنين من ميثيل ترانسفيرازات الرنا الريباسي البشري المحفوظة للغاية المطلوبة في مسارات تمايز الخلايا والمرتبطة بأمراض خطيرة ، بما في ذلك السرطان. على الرغم من الحفظ الشامل بين الخميرة والبشر ، فإننا نسلط الضوء على الاختلافات التي تؤكد أنه يجب إجراء البحوث الأساسية حول التكوين الحيوي للريبوسوم مباشرة على الخلايا البشرية للسماح باختيار أهداف علاجية واعدة حقًا قبل الشروع في برامج تطوير الأدوية المكلفة.


المؤلفون مدينون لإدواردو دياز (البنك التجاري الدولي ، مدريد) لمشاركة المواد القيمة بسخاء. تم تمويل هذا العمل من قبل مشروع SETH التابع لوزارة العلوم الإسبانية RTI 2018-095584-B-C42 ، مادونا (H2020-FET-OPEN-RIA-2017-1-766975) ، BioRoboost (H2020-NMBP-BIO-CSA- 2018) و SYNBIO4FLAV (H2020-NMBP / 0500) عقود الاتحاد الأوروبي ، S2017 / BMD-3691 InGEMICS-CM بتمويل من Comunidad de Madrid (الصناديق الهيكلية والاستثمارية الأوروبية) ومشروع SynBio3D للهندسة والعلوم الفيزيائية في المملكة المتحدة مجلس البحوث (EP / R019002 / 1).

صمم BC وأجرى التجارب الموضحة في هذا العمل. أجرت شركة AG-M نماذج حسابية وتشغيلها في الجسم الحي محاكاة وحدة الديجيتال. قدم VdL إشرافًا مباشرًا وفسر النتائج وساعد في تصميم هذا البحث. كتب BC و AG-M و VdL المخطوطة. كل الكتاب قراءة وافقت على المخطوط النهائي.


شاهد الفيديو: ماهوالبلازميد شرح plasmid (كانون الثاني 2022).