معلومة

هل توجد فروق في مستويات الكوليسترول في غشاء الخلية بين أنواع الخلايا؟


مع أنواع الخلايا ووظائف الخلايا المختلفة ، هل توجد مستويات مميزة من الكوليسترول في غشاء الخلية لكل نوع من الخلايا ، أم أن جميع أنواع الخلايا تحتوي على كمية مماثلة من الكوليسترول؟

أفترض أن أنواعًا معينة من الخلايا تتطلب مستويات مختلفة من استقرار غشاء الخلية ، وعلى هذا النحو ، مستويات مختلفة من الكوليسترول في غشاء الخلية هذا.


نعم ، هناك اختلافات في مستويات الكوليسترول في غشاء الخلية بين أنواع الخلايا البشرية المختلفة.

يوضح هذا الجدول من Alberts (2002) الاختلاف في تكوين الكوليسترول في خلية الكبد وخلايا الدم الحمراء وخلية Schwann / oligodendrocyte (المايلين):

طاولة: التركيبات التقريبية للدهون لأغشية الخلايا المختلفة

إلى جانب ذلك ، يوضح الجدول أن هناك اختلافًا في تكوين الكوليسترول بين الأغشية المختلفة في نفس الخلية (قارن غشاء بلازمي, ميتوكوندريا و ER). في الواقع ، هذا هو الاختلاف الأكثر شهرة ، الموضح في هذا الشكل من Lehninger (2000):

شكل: التركيب الدهني لغشاء البلازما والأغشية العضية لخلايا كبد الفئران. ينعكس التخصص الوظيفي لكل نوع من أنواع الغشاء في تركيبته الدهنية الفريدة. الكوليسترول بارز في أغشية البلازما ولكن بالكاد يمكن اكتشافه في أغشية الميتوكوندريا.

مصادر:

  • ألبرتس ، ب. (2002). البيولوجيا الجزيئية للخلية. نيويورك: جارلاند ساينس.
  • لينينجر ، أ. ، نيلسون ، د. ، كوكس ، م. (2000). مبادئ الكيمياء الحيوية. نيويورك: وورث.

أنت على حق ، الخلايا المختلفة لديها كميات مختلفة من الكوليسترول داخل الغشاء. على سبيل المثال ، تحتوي خلية الدم الحمراء على نسبة عالية من الكوليسترول في غشاءها مقارنة بالخلية الظهارية في الأمعاء الدقيقة. قد يكون هذا بسبب أن خلية الدم تطفو بحرية داخل الجسم بدلاً من الالتصاق جسديًا بشيء ما ، لذلك هناك حاجة إلى مستوى أكبر من الاستقرار. انها تعتمد فقط على وظيفة الخلايا.


اكتشاف الخلايا وهيكلها الإصدار السابق

في عام 1655 ، قام العالم الإنجليزي روبرت هوك بملاحظة من شأنها أن تغير النظرية البيولوجية الأساسية والبحوث إلى الأبد. أثناء فحص مقطع جاف من شجرة الفلين بمجهر ضوئي خام ، لاحظ غرفًا صغيرة وأطلق عليها اسم خلايا. في غضون عقد من الزمن ، قرر الباحثون أن الخلايا لم تكن فارغة ، بل كانت مليئة بمادة مائية تسمى السيتوبلازم.

على مدى 175 عامًا التالية ، أدى البحث إلى تشكيل نظرية الخلية ، التي اقترحها لأول مرة عالم النبات الألماني ماتياس جاكوب شلايدن وعالم الفسيولوجيا الألماني تيودور شوان في عام 1838 وصاغها الباحث الألماني رودولف فيرشو في عام 1858. تتكون النظرية من أربعة أجزاء أساسية:

  1. الخلية هي الوحدة الهيكلية والوظيفية الأساسية للحياة ، وتتكون جميع الكائنات الحية من خلايا.
  2. يتم إنتاج جميع الخلايا عن طريق تقسيم الخلايا الموجودة مسبقًا (بمعنى آخر ، من خلال التكاثر). تحتوي كل خلية على مادة وراثية يتم تمريرها خلال هذه العملية.
  3. يتم تنفيذ جميع الوظائف الكيميائية والفسيولوجية الأساسية - على سبيل المثال ، الإصلاح والنمو والحركة والمناعة والتواصل والهضم - داخل الخلايا.
  4. تعتمد أنشطة الخلايا على أنشطة الهياكل تحت الخلوية داخل الخلية (تشمل هذه الهياكل دون الخلوية العضيات ، وغشاء البلازما ، والنواة ، إن وجدت).

تؤدي نظرية الخلية إلى عاملين مهمين للغاية حول الخلايا والحياة ككل:

  1. الخلايا على قيد الحياة. تكون الخلايا الفردية لأعضائك "حية" مثلك تمامًا ، على الرغم من أنها لا تستطيع العيش بشكل مستقل. وهذا يعني أن الخلايا يمكنها أن تأخذ الطاقة (التي يمكن أن تكون على شكل ضوء أو سكر أو مركبات أخرى) ومواد بناء (بروتينات وكربوهيدرات ودهون) ، وتستخدمها لإصلاح نفسها وإنشاء أجيال جديدة. من الخلايا (تكاثر).
  2. خصائص واحتياجات الكائن الحي هي في الواقع خصائص واحتياجات الخلايا التي يتكون منها الكائن الحي. على سبيل المثال ، أنت بحاجة إلى الماء لأن خلاياك تحتاج إلى الماء.

المواد والأساليب

البلازميدات والطفرات

تم تحضير البلازميدات التي تحمل بدائل الألانين من pHXB2 (برنامج الكاشف المرجعي لبحوث الإيدز والمعاهد الوطنية للصحة ، رقم 526 (25)) و pJRFL ، والذي تم استنساخه ، من أجل مطابقة خلفية pHXB2 ، في بلازميد الخلفية pSV7D من pCAGGSJRFL هدية من pCAGGSJRFL جيمس إم بينلي (26). تم إجراء الطفرات باستخدام مجموعة الطفرات الموجهة من موقع Stratagene QuikChange II XL وتم التحقق من التغييرات عن طريق تسلسل الحمض النووي (مختبر تسلسل الحمض النووي لمعهد Roswell Park Cancer). كان التعبير عن البلازميد Rev pCMV-rev (pRev-1) (برنامج الكاشف المرجعي لبحوث الإيدز في المعاهد الوطنية للصحة رقم 1443 (27)) وكان البلازميد الذي يعبر عن Tat هو pCEP4-Tat (برنامج الكاشف المرجعي لبحوث الإيدز والمعاهد الوطنية للصحة Cat. رقم 4691 (28)

دمج الخلايا الخلوية

لفحص اندماج الخلية الخلوية ، تم نقل البلازميد المغلف pHXB2 أو pJRFL أو WT أو كل متحولة ، مع البلازميدات لكل من البروتينات الفيروسية Tat و Rev ، عن طريق ترسيب فوسفات الكالسيوم إلى خلايا 293T (ATCC) ، يتم الاحتفاظ بها في Dulbecco's Modified Eagle متوسطة (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 1٪ بنسلين ستربتومايسين. أربع وعشرون ساعة بعد تعداء الخلايا تمت إزالة الخلايا من اللوحة وحسابها ، ثم زرعها في 2 & # x000d7 10 & # x002c64 خلية / جيدًا مع 2 & # x000d7 10 & # x002c64 خلية / بئر من خط خلية المستقبل ، TZM- bl (برنامج الكاشف المرجعي لبحوث الإيدز والمعاهد الوطنية للصحة Cat. رقم 8129 (29)) ، في لوحة 96 بئر. تم تحضين الصفائح طوال الليل عند 37 & # x000b0C في 5 ٪ CO2 حاضنة. بعد 24 ساعة ، تم قياس مستويات الانصهار الغشائي بمقايسة لوسيفيراز (One-glo ، Promega) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة باستخدام قارئ لوحة Spectra Max M5 (الأجهزة الجزيئية) ، وتم تطبيع المستويات إلى مستويات اندماج WT. تم إجراء التجارب في ثلاث نسخ من خطوة تعداء إلى قياس نشاط لوسيفيراز ، وبالتالي ، فإن أوجه عدم اليقين تشمل جميع خطوات الإجراء التجريبي.

دخول الفيروس

لمقايسة دخول الفيروس ، تم نقل البلازميدات pHXB2 أو pJRFL و WT وكل متحولة و pNL4 & # x020133.HSA.RE- (برنامج الكاشف المرجعي لبحوث الإيدز والمعاهد الوطنية للصحة رقم 3417 (30)) بشكل مشترك عن طريق ترسيب فوسفات الكالسيوم إلى 293T من الخلايا ، والتي تم الحفاظ عليها في DMEM مع 10 ٪ FBS ، 1 ٪ بنسلين ستربتومايسين. ثمان وأربعون ساعة بعد تعداء العدوى ، تم حصاد الوسيط وتصفيته من خلال مرشح 0.45 & # x003bcM وطرده عند 55000 & # x000d7 جم لمدة ساعة واحدة لتكوين مخزون الفيروس. تم قياس العيار المعدية للفيروس من النوع البري (WT) بواسطة تلطيخ X-gal كما هو موضح سابقًا (31). تم إجراء فحص المناعة المناعي المرتبط بالإنزيم (HIV-1 p24) (برنامج HIV-1 p24 لفيروس السرطان ، NCI في Fredererick) لتحديد كميات مكافئة من الجسيمات الفيروسية المغلفة بالطفرة لفيروس WT في وزارة الداخلية 0.01. ثم تم استخدام كمية p24 عند تعدد العدوى (MOI) 0.01 من WT لتطبيع عدد الجسيمات الفيروسية وتم استخدام 100 نانوغرام / مل من تركيز p24 لكل فيروس متحور في جميع أنحاء الورقة. تم زرع خلايا المستقبل ، TZM-bl ، التي تم الحفاظ عليها في DMEM بنسبة 10 ٪ FBS ، و 1 ٪ بنسلين ستربتومايسين ، في 2 & # x000d7 10 & # x002c64 خلية / بئر في لوحة 96 بئر بحجم 100 ميكرولتر . في اليوم التالي ، تمت إزالة الوسيط وإضافة 100 ميكرولتر من مخزون الفيروس (MOI 0.01 ، 100 نانوغرام / مل من p24) إلى كل من الآبار. تم الطرد المركزي للألواح عند 3000 & # x000d7 جم لمدة ساعة واحدة ثم تم تحضينها عند 37 & # x000b0 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪2 حاضنة. بعد 48 ساعة ، تم قياس مستويات دخول الفيروس بمقايسة لوسيفيراز كما هو موصوف أعلاه لمقايسة اندماج الخلية الخلوية.

تحديد كمية البروتين

تم تحضير حبيبات الفيروس عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 55000 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة باستخدام دوار Beckman SW55Ti. تم إعادة تعليق الكريات في المخزن المؤقت للتحلل: 50 ملي مولار تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 ، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 5 ملي مولار EDTA ، و 0.5٪ Nonidet P-40 ، و 0.1٪ SDS. تم جمع محللات الخلية 293T باستخدام كاشف استخراج البروتين M-Per Mammalian (Thermo Scientific). تم تطبيع lysates الخلية وكريات الفيروس لتركيز البروتين الكلي باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA (بيرس).

تحليل لطخة غربية

بعد الرحلان الكهربائي والنقل والحظر ، تم فحص البقع باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لفيروس HIV-1 gp41 (Chessie 8 المعاهد الوطنية لأبحاث الإيدز الصحية وبرنامج الكاشف المرجعي Cat. رقم 526 (32)) ومضاد HIV-1 gp120 الجسم المضاد متعدد النسيلة (US Biological). للتأكد من احتواء مخزون الفيروس على كميات متساوية من جزيئات الفيروس ، تم إجراء التطبيع بناءً على البقع الغربية لمستويات p24 باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ HIV-1 p24 (المعهد الوطني لبحوث الإيدز الصحية وبرنامج الكاشف المرجعي). تم تحديد تركيز البروتين الكلي باستخدام اختبار BCA كما هو موضح أعلاه وتم تحميل 10 & # x003bcg من البروتين الكلي في كل ممر. كان الجسم المضاد الثانوي المستخدم عبارة عن IgG مترافق مع حمار IR800 لـ gp41 و p24 و IR-700 مترافق أرنب مضاد للماعز IgG لـ gp120 وتم مسح البقع وتحليلها باستخدام Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR).


مقدمة

العدلات ، والمعروفة أيضًا باسم الكريات البيض متعددة الأشكال (PMN) ، هي أكثر أنواع الخلايا وفرة في دم الإنسان. يتم إنتاجها في نخاع العظام بأعداد كبيرة ، & # x0007E10 11 خلية في اليوم. في ظل ظروف الاستتباب ، تدخل العدلات الدورة الدموية ، وتهاجر إلى الأنسجة ، حيث تكمل وظائفها ، وأخيراً يتم التخلص منها بواسطة الضامة ، كل ذلك في غضون يوم واحد. العدلات هي خلايا فاعلة مهمة في الذراع الفطرية لجهاز المناعة (Mayadas et al. ، 2014). يقومون بدوريات في الكائن الحي باستمرار بحثًا عن علامات العدوى الميكروبية ، وعندما يتم العثور عليها ، تستجيب هذه الخلايا بسرعة لاحتجاز مسببات الأمراض الغازية وقتلها. يتم التعرف على ثلاث وظائف رئيسية مضادة للميكروبات للعدلات: البلعمة ، والتحلل ، وإطلاق المواد النووية في شكل مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) (الشكل 1). كانت هذه الوظائف تعتبر ، حتى وقت قريب ، الغرض الوحيد من العدلات. ومع ذلك ، فقد كشفت الأبحاث الحالية التي أجراها الباحثون في العديد من مجالات بيولوجيا الخلية العدلات أن العدلات تمتلك ذخيرة متنوعة من الاستجابات الوظيفية التي تتجاوز مجرد قتل الكائنات الحية الدقيقة. تستجيب العدلات لإشارات متعددة وتستجيب عن طريق إنتاج العديد من السيتوكينات والعوامل الالتهابية الأخرى التي تؤثر على الالتهاب وتنظمه وكذلك الجهاز المناعي (Nauseef and Borregaard، 2014 Scapini and Cassatella، 2014). في الوقت الحاضر ، من المعروف أن العدلات عبارة عن خلايا معقدة نشطة نسبيًا (Ericson et al. ، 2014) تنتج السيتوكينات (Tecchio and Cassatella ، 2016) ، وتعديل أنشطة الخلايا المجاورة وتساهم في حل الالتهاب (Greenlee-Wacker ، 2016) ، ينظم الضامة للاستجابات المناعية طويلة المدى (Chen et al.، 2014) ، ويشارك بنشاط في العديد من الأمراض بما في ذلك السرطان (Uribe-Querol and Rosales ، 2015 Mishalian et al. ، 2017) ، بل وله دور في الذاكرة المناعية الفطرية (نيتيا وآخرون ، 2016).

شكل 1. آليات مضادات الميكروبات للعدلات. عندما تتعرف العدلات على مسببات الأمراض الميكروبية ، فإنها تنشر وظائف مختلفة لتدميرها. تتضمن عملية البلعمة ابتلاع الكائنات الحية الدقيقة في فجوة بلعمية تصبح عند النضج جسيمًا بلعميًا. في هذه العضية الجديدة ، يتم تدمير الكائنات الحية الدقيقة بفعل انخفاض درجة الحموضة ، والإنزيمات المهينة. تقوم العدلات أيضًا بإفراز حبيباتها وإطلاقها في بيئتها. عندما تكون الكائنات الحية الدقيقة كبيرة جدًا بحيث لا يمكن تناولها ، يمكن أن تنتج العدلات أيضًا مصائد خارج الخلية (NETs) تتكون من ألياف الحمض النووي والبروتينات من الحبيبات.

يتم إحداث العديد من الاستجابات الوظيفية للعدلات عن طريق التنشيط النسخي والتغييرات في التعبير عن جزيئات السطح أو النشاط. عادة ما يتم اكتشاف هذه التغييرات المظهرية في مجموعة فرعية فقط من العدلات ، مما يشير إلى وجود تباين كبير في العدلات (Beyrau et al. ، 2012). تُظهر العدلات أنماطًا ظاهرية مختلفة من الوقت الذي تغادر فيه نخاع العظام وتدخل الدورة الدموية (العدلات الجديدة) إلى الوقت الذي تختفي فيه من الدورة الدموية (العدلات القديمة). يُعرف هذا التحول في النمط الظاهري بالشيخوخة ، لأنه يحدث في غضون يوم واحد ، وينتج عنه العديد من العدلات ذات الخصائص المميزة (Adrover et al. ، 2016). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تحفز البيئة المكروية في الأنسجة المختلفة العدلات على اكتساب وظائف متخصصة. وبالتالي ، فإن حقيقة أن العدلات يمكن أن تظهر العديد من الأنماط الظاهرية الوظيفية تدعم أيضًا وجود العديد من المجموعات الفرعية للعدلات.

السرطان هو حالة خاصة ، حيث يزداد عدد العدلات في الدورة الدموية ، ويتغير النمط الظاهري لهذه الخلايا مع تطور الورم. في السرطان المتقدم ، تم وصف العديد من المجموعات السكانية الفرعية من العدلات المنتشرة مع خصائص مختلفة من النضج ، والسمية الخلوية للورم ، وقمع المناعة (Sagiv et al. ، 2015) ، بما في ذلك الخلايا الكابحة المشتقة من النخاع النخاعي المحبب (G-MDSC). ومع ذلك ، لم يتم تعريف هذه الأنواع المختلفة من الخلايا بوضوح ووجودها كمجموعات فرعية من العدلات الحسنة النية أو حتى نوع خلية مختلف تمامًا هو اليوم موضوع مثير للجدل. بالنسبة لمعظم الباحثين ، من الواضح أن الاختلافات في بروتينات غشاء البلازما والاستجابات الوظيفية للعدلات في ظروف متنوعة هي دليل قوي على اللدونة الرائعة للعدلات. ومع ذلك ، فإن عدم تجانس العدلات هذا غير مدعوم بمعايير إجماع يمكن من خلالها تحديد مجموعات العدلات في الدم والأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استقرار الأنماط الظاهرية المرصودة في هذه المجموعات السكانية الفرعية غير واضح. هل هذه المجموعات الفرعية للعدلات الحسنة النية أم مجرد مراحل تنشيط مختلفة يتم عرضها استجابةً لعوامل محلية؟

إن الغرض من هذه المراجعة هو تسليط الضوء على الاختلافات في الاستجابات الوظيفية للعدلات وأنواع الخلايا الأخرى ، مثل G-MDSC ، التي قد تكون أو لا تكون مجموعات سكانية فرعية من العدلات المنتشرة. نقدم خصائص أنواع العدلات المختلفة ، ووصف وظائفها ، ومناقشة العلاقات الممكنة فيما بينها.


مناقشة

تحدد الجينات المعبر عنها في كل نوع خلية وظيفتها واستجاباتها للإشارات الداخلية والخارجية. نحن هنا نبلغ عن استراتيجية قوية للتعبير الخاص بنوع الخلية والتنميط اللاجيني لدماغ الإنسان بعد الوفاة الذي يتضمن ميزات العديد من البروتوكولات السابقة لخلية واحدة أو دراسات قائمة على السكان لأنواع خلايا الجهاز العصبي المركزي. لقد أوضحنا أنه يمكن استخدام الأجسام المضادة ضد البروتينات الغشائية أو ER الخاصة بالخلية لفرز النوى المعزولة ، مما يزيد بشكل كبير من الأجسام المضادة المرشحة التي يمكن استخدامها لهذا الغرض. لقد أبلغنا عن تنميط دقيق وشامل للغاية للتعبير الجيني المحدد من نوع الخلية للخلايا العصبية والدبقية من أدمغة الفئران والجرذان والبشر. باستخدام هذه المنهجية ، نجد أنه حتى أنواع الخلايا المخيخية المحددة بشكل كلاسيكي تختلف بين الفأر والإنسان من خلال التعبير عن مئات الجينات المتعامدة. تم تأكيد التعبير الخاص بالأنواع من خلال تحليل بيانات نسخة النواة المفردة من نفس الفأر (Saunders et al. ، 2018) وأنواع الخلايا البشرية (Lake et al. ، 2018) ، ومن خلال فحوصات ATAC-seq التي توضح أن التعبير النشط يكون مصحوبًا تحسين إمكانية الوصول إلى الكروماتين. ومن المثير للاهتمام ، أن الجينات التي يتم التعبير عنها في الخلايا العصبية الحبيبية البشرية وليس الفئران يتم التعبير عنها بشكل متكرر في مناطق أخرى من دماغ الفأر. يكشف تحليل البيانات الخاصة بنوع الخلية من ستة عشر دماغًا بشريًا بعد الوفاة أن العواقب الجزيئية المحددة للشيخوخة تختلف بين أنواع الخلايا ، على الرغم من أنه في كل حالة ، يتضاءل التعبير عن الجينات المشاركة في تطوير المشبك وصيانته. أخيرًا ، أبلغنا عن تحريض استجابة جزيئية قوية ومحددة من نوع الخلية لمسببات غير معروفة في الخلايا الحبيبية من ثلاثة من ستة عشر متبرعًا. مجتمعة ، توثق التجارب التي نقدمها منهجية دقيقة للتحليل الشامل لأنواع الخلايا المحددة في أدمغة القوارض والبشر ، وتوضح أن هذا النهج يمكن أن يوفر وسيلة محسنة للتحقيق في الأحداث الجزيئية المرتبطة بوظيفة نوع الخلية البشرية والخلل الوظيفي.

التعبير الجيني للأنواع ونوع الخلية في دماغ الثدييات

على الرغم من أن تعريف نوع الخلية لم يظهر بعد بالنسبة للجهاز العصبي المركزي للثدييات ، فإن النموذج التطوري الحديث (Arendt ، 2008 Arendt et al. ، 2016) مفيد للنظر في البيانات التي أنشأناها هنا. وفقًا لهذا النموذج ، يمكن أن تختلف الخصائص المحددة لأنواع الخلايا المتجانسة طالما أنها تظل محددة بواسطة جهاز تنظيمي مميز ومشترك. على سبيل المثال ، يمكن أن تختلف ملفات تعريف التعبير الجيني للخلايا الحبيبية أو الخلايا النجمية بين الأنواع ، أو حتى في الخلايا الفردية من النوع ، دون فقدان هوية نوع الخلية. يمكن أن يستوعب هذا التعريف كلاً من التغييرات الوظيفية في أنواع الخلايا بين الأنواع والتعبير المتغير للجينات داخل نوع الخلية بسبب الطفرات في رابطة الدول المستقلة- التسلسلات التنظيمية. توثق بياناتنا اختلافات مهمة في التعبير عن الجينات المتعامدة في كل نوع خلية بين أدمغة القوارض والبشر. مئات من هذه الاختلافات خاصة بنوع الخلية ، وفي بعض الحالات ، يظل التعبير عن هذه الجينات في مناطق أخرى من الدماغ. نعتقد أن هذه البيانات مثيرة واستفزازية. لقد أظهروا أن الكيمياء الحيوية الدقيقة لأنواع خلايا الجهاز العصبي المركزي البشرية والفأرية المتماثلة من المرجح أن تختلف اختلافًا كبيرًا ، وهم يجادلون بقوة بأن الاختلافات في ملفات تعريف التعبير الجيني لا يمكن استخدامها كمعيار محدد لهوية نوع الخلية بين الأنواع.

تساهم النتائج المقدمة هنا بثلاث رؤى إضافية حول تطور دماغ الثدييات. أولاً ، في حين أنها تتفق مع الأمثلة السابقة المنشورة من رابطة الدول المستقلة- الاختلاف في التسلسل التنظيمي كآلية للتطور (Maricic et al. ، 2013 Prud'homme et al. ، 2006 Weyer and Pääbo ، 2016) ، وعدم وجود فئات GO عالية التخصيب لمعظم الأحداث الخاصة بالخلية التي قمنا بتوثيقها تشير إلى أن التغييرات في التسلسل التنظيمي هي الدوافع الرئيسية للاختلاف الظاهري بين أنواع الخلايا المتماثلة في أدمغة الثدييات. يتوافق هذا مع النموذج التطوري المقدم أعلاه ، لأنه يسمح بتطور كبير للخصائص الوظيفية للخلية مع الحفاظ على المركب التنظيمي الأساسي (CoRC) الذي يحدد نوعًا معينًا من الخلايا (Arendt et al. ، 2016). ثانيًا ، اختلافات التعبير التي وثقناها كبيرة ، وقد قصرنا تحليلنا على الجينات التقويمية عالية الثقة. وبالتالي ، فإن بياناتنا تكمل دراسة سابقة للخلايا السلفية التي أبلغت عن تغييرات جوهرية في التعبير عن الجينات البشرية التي تفتقر إلى أطباء تقويم الفأر (Florio et al. ، 2015). نجد أيضًا أن التغييرات في التعبير الجيني بين الأنواع مصحوبة بتغييرات في إمكانية الوصول إلى الكروماتين المحفز ، وأن تسلسل الحمض النووي في المناطق التنظيمية المفترضة حول الجينات المخصبة للأنواع أقل حفظًا من الجينات غير المتغيرة. بينما يتوافق عملنا مع الدراسات السابقة التي توضح أن تطور المروجين أبطأ من العناصر التنظيمية الأخرى (Bae et al.، 2015 De la Torre-Ubieta et al.، 2018 Villar et al.، 2015) ، تشير نتائجنا إلى ذلك يلعب تطور المروج أيضًا دورًا مهمًا في تنظيم التعبير الجيني الخاص بنوع الخلية. نلاحظ أنه في الجينات المعبر عنها بالخلايا الحبيبية المخصبة بالماوس ، التواجد التفضيلي لنماذج GATA في جسم الجين والتعبير الخاص بالماوس لعامل ربط GATA غير النمطي TRPS1 تشير أيضًا إلى أن تعبير عامل النسخ التفاضلي والمجالات التنظيمية داخل الجينات قد تساهم في النسخ المتباين بين الأنواع. مجتمعة ، تتنبأ مجموعات البيانات هذه بأن الاختلافات المعبر عنها بين الفئران وأنواع الخلايا البشرية واسعة النطاق ومحددة بنوع الخلية ومهمة من الناحية الظاهرية.

التنميط الظاهري الجزيئي لأنواع خلايا الجهاز العصبي المركزي البشرية

أدت التطورات الحديثة في تقنيات تسلسل الجينوم البشري وتحليله إلى زيادة مذهلة في معرفتنا بالأسباب الجينية المعقدة للأمراض النفسية والعصبية البشرية (Burguière et al.، 2015 Hinz and Geschwind، 2017 Vorstman et al.، 2017). في بعض الحالات ، أدى إعادة تكوين الطفرات المسببة في جينوم الفأر إلى نماذج تجريبية دقيقة بما يكفي للتحقيق في الأساس الجزيئي للاضطراب (Lombardi et al.، 2015 Lyst and Bird، 2015 Orr، 2012) ، ولديهم أدى إلى اكتشاف سمات غير متوقعة للمرض (Baker et al.، 2013 Guy et al.، 2007). في حالات أخرى ، تظل النماذج الحيوانية المفيدة بعيدة المنال (Lavin ، 2013) ، والتحقيق في الآليات الجزيئية للمرض صعب (Biton et al. ، 2008 Medina and Avila ، 2014). نقدم هنا بيانات لثلاثة أنواع من الخلايا المخيخية في ستة عشر عينة من دماغ الإنسان. تم الحصول على جميع العينات من الأشخاص غير المصابين الذين تلقوا تشخيصًا عصبيًا "لدماغ بالغ طبيعي". أشارت معاملات الارتباط بين العينات (r = 0.98-1.0) إلى أن البيانات قابلة للتكرار للغاية ، وأن تأثير PMD على ملف تعريف التعبير عن الحمض النووي الريبي النووي ضئيل. تعد المؤشرات الأولية التي تشير إلى أن الجنس والعمر يؤثران على التعبير الجيني بشكل مختلف في أنواع خلايا الجهاز العصبي المركزي مثيرة للاهتمام ، وتشير إلى أن التنميط النووي دقيق بما يكفي لإجراء تحقيق مفصل لكل من السلوكيات البشرية ثنائية الشكل وشيخوخة دوائر دماغية معينة. هناك احتمال مثير ، على سبيل المثال ، هو أن التحليل المقارن للأدمغة البشرية قد يوفر نظرة ثاقبة لتأثيرات الشيخوخة على أنواع الخلايا المعرضة بشكل انتقائي للاضطرابات البشرية المتأخرة الظهور.

واحدة من أكثر النتائج إثارة للاهتمام التي نقدمها هي أن الخلايا الحبيبية المخيخية من ثلاث عينات دماغية تظهر تحريضًا قويًا لمجموعة من 224 جينًا تحتوي على العديد من الجينات المبكرة الفورية ، وهذه المجموعة مُخصبة لفئات GO (طي البروتين / إعادة تشكيله ، موت الخلايا المبرمج ، استجابة نسخية للإجهاد ، والاستجابة للمنبهات الخارجية ، ونشاط ATPase ، وما إلى ذلك) التي تشير إلى استجابة مشتركة وحادة لحافز فسيولوجي غير معروف أو حدث غير متوقع وقوي يحدث أثناء معالجة العينة. كما هو مذكور أعلاه ، لا يوجد ارتباط مع PMD ولا يوجد تحريض للعلامات الدبقية التي تشير إلى السكتة الدماغية أو تلف الدماغ واضح في بياناتنا. على الرغم من أن تغييرات التعبير الجيني المعتمدة على النشاط قد تم تمييزها على نطاق واسع في خلايا حبيبات الفئران المستزرعة ، فإن الاستجابة المحددة في هذه العينات البشرية الثلاثة متداخلة ولكنها مميزة. على الرغم من أننا لا نرغب في التكهن بسبب هذه الاستجابة ، فإن بياناتنا توضح أن الدراسات المقارنة الدقيقة لمجموعات البيانات الخاصة بالخلايا من عينات التحكم هي ميزة مهمة في التصميم التجريبي للتحليل المقارن للأحداث الجزيئية المرتبطة بالاستجابات للأحداث الوراثية أو البيئية الضارة. .

أخيرًا ، تقدم بياناتنا أمثلة إضافية على أهمية رسم الخرائط اللاجينية في أنواع خلايا معينة كمكمل لتحليل التعبير الجيني. على وجه الخصوص ، يؤكد استخدام خرائط سلسلة ATAC (Buenrostro et al. ، 2015 Chen et al. ، 2016) للمجالات التنظيمية المفترضة لأنواع معينة من خلايا الجهاز العصبي المركزي أن الجينات المعبر عنها بنشاط تحتوي على مجالات كروماتين يمكن الوصول إليها. يُظهر عدم وجود هذه المجالات في الجين الذي لم يتم نسخه في نوع الخلية المتماثلة من نوع آخر أن نقص التعبير يعكس آليات معقدة تنشئ مجالًا مكبوتًا من الكروماتين القريب من الجين. على الرغم من أن بياناتنا لا تحدد المجالات التنظيمية المحددة المرتبطة بهذه التغييرات في التعبير ، إلا أن سابقة من دراسات تطور المُحسِّن (Villar et al. ، 2015) تشير إلى أن مزيدًا من التحقيق في الوصول التفاضلي لهذه الجينات يمكن أن يؤدي إلى فهم ميكانيكي لأنواع معينة التعبير الجيني.

ملاحظات ختامية

القوة الدافعة لتطوير طريقة غير وراثية دقيقة وفعالة لتوصيف الخصائص الجزيئية لأنواع خلايا CNS المحددة هي تمكين التحقيق المباشر في علم الأحياء البشري. نظرًا للانفجار الهائل في الدراسات التي تحدد الأسباب الجينية للأمراض البشرية والتظاهرات في كل من النماذج الحيوانية والبشر التي يمكن أن تشمل الآفات التي تنطوي على تغييرات بسيطة في جرعة الجينات ، فإن استكشاف تفاصيل أنواع الخلايا في الأدمغة الطبيعية والمتأثرة أمر ضروري. نعتقد أن التحليل المقارن لبيانات خاصة بنوع الخلية البشرية مع تلك التي تم الحصول عليها في الأنظمة التجريبية هو نهج مهم نحو تعزيز فهمنا لمجموعة كبيرة ومتنوعة من الاضطرابات البشرية التي تؤثر على دوائر الجهاز العصبي المركزي.


نتائج

Zym غير قادر على دعم التعايش في المرحلة السائلة المطلوبة / السائل المضطرب

من أجل التقييم المباشر لقدرة Zym على تحفيز التعايش بين المجالات السائلة / السائلة ، تم دمج Erg أو Zym في GUVs التي تحتوي على نسب متساوية من الدهون المشبعة DPPC والدهون غير المشبعة DOPC ، وتمت مقارنة سلوكياتهم مع سلوك DOPC / خليط ثنائي DPPC. تمت دراسة نظام DOPC / DPPC / Chol المسمى بنفس نظير الدهن الفلوري ، Rhod-DOPE ، بالتفصيل سابقًا (De Almeida et al. ، 2007). لقد ثبت أن هذا المسبار يقوم بتسمية السائل المختل بشكل تفضيلي (لد) المرحلة مقابل الهلام (De Almeida et al. ، 2007) ، المستحثة بالكول لا (De Almeida et al. ، 2005) ، و Erg-induced لا (باستوس وآخرون ، 2012).

بالنسبة لمزيج متساوي الأقطاب الثنائي من DPPC و DOPC ، أظهرت صور الفحص المجهري متحد البؤر توزيع Rhod-DOPE مع مجالات مشبعة غنية بالدهون غير مشبعة ومظلمة ومشبعة بالدهون (الشكل 1A). في هذا الخليط الثنائي ، المجالات التي تمت ملاحظتها تتوافق مع هلام (داكن) و لد التعايش الطوري (الساطع) ، مع المناطق النسبية بالاتفاق مع مخطط الطور لهذا الخليط (De Almeida et al. ، 2007). تتشكل المجالات بشكل غير منتظم ، كمميزات لتعايش الهلام / السوائل ، على عكس لد/لا التعايش الطوري الذي يؤدي إلى مجالات مستديرة الشكل (ديتريش وآخرون ، 2001). بالإضافة إلى ذلك ، إذا تمت إضافة Chol لتشكيل خليط ثلاثي 1: 1: 2 (نسبة مولارية) ، فإن الحويصلات تكون بالكامل في لا الحالة ، بينما بالنسبة لنسبة 1: 1: 1 متساوية المولي فمن المعروف ذلك لد/لا يحدث فصل الطور (الشكل التكميلي S1A) (Veatch and Keller ، 2003 De Almeida et al. ، 2007).

شكل 1. لا يشجع Zym تكوين التعايش لد/لا مراحل السائل. صور مجهرية متحد البؤر من GUVs من (أ) DOPC / DPPC (نسبة المولي 1: 1) ، (ب) DOPC / DPPC / Erg (نسبة المولي 1: 1: 1) ، (ج) DOPC / DPPC / Zym (نسبة 1: 1: 2 مولاري) عند 23 & # x00B0C ، المسمى بـ Rhod-DOPE (0.2 مول ٪). شريط المقياس = 5 & # x03BCm.

في حالة عرق ، تشير نتائجنا أيضًا إلى وضوح لد/لا التعايش الطوري لتكوين الدهون DOPC / DPPC / Erg (1: 1: 1 ، النسبة المولية) (الشكل 1B والشكل التكميلي S1B) ، كجولة مظلمة واحدة لا المجال. في الواقع ، تم الإبلاغ سابقًا عن أن GUVs ذات النسب المماثلة من DOPC / DPPC / Erg تقدم مظهرًا ساطعًا لد المرحلة ، غنية بالدهون غير المشبعة (DOPC) ، تتعايش مع الظلام لا غنية بالدهون المشبعة (DPPC) و Erg (Beattie et al. ، 2005).

بالنسبة إلى DOPC / DPPC / Zym (1: 1: 2 ، النسبة المولية) (الشكل 1C والشكل التكميلي S1D) ، لوحظت بوضوح مجالات طور الهلام غير المستديرة ، المشابهة لتلك الموجودة في حويصلات DOPC / DPPC (الشكل 1A) . يشير هذا إلى أن Zym ، على عكس Chol و Erg ، ليس لديه القدرة على تعزيز تكوين التعايش لد/لا من مراحل موجودة مسبقًا لد/ حالة هلام. نظرًا لأن تقدير جزء مساحة الهلام من الفحص البصري للعديد من GUVs لا يكشف عن اختلافات ملحوظة في جزء الهلام و لد مع أو بدون Zym ، يبدو أن تقسيم هذا الستيرول بين المرحلتين متشابه. تم الحصول على نتائج مماثلة لخلائط متساوية المولي (نسبة 1: 1: 1 مولار) من DOPC / DPPC / Zym (الشكل التكميلي S1C).

Zym غير قادر على التأثير على النفاذية السلبية للدهون ثنائية الطبقات

أحد الاختلافات الرئيسية بين هلام و لد المرحلة ذات الأهمية البيولوجية المباشرة والحيوية هي نفاذية الغشاء السلبية ، والتي يُعرف أنها يتم تعديلها بواسطة الستيرولات (Scheidt et al. ، 2013). وهكذا ، تمت دراسة النفاذية السلبية للماء (الملاحظة التكميلية 1 والشكل التكميلي S2) والأيونات (الملاحظة التكميلية 2 والشكل التكميلي S3) في الحويصلات الدهنية المكونة من الخلائط الثنائية والثلاثية التي تحتوي على كل من الستيرولات المرتبطة بعملية التمثيل الغذائي (DPPC / ستيرول 2 : 1 و DPPC / DOPC / ستيرول 1: 1: 1 نسبة مولارية ، على التوالي).

يتم التعبير عن نفاذية أعلى للماء كمعدل أعلى لزيادة حجم الدهون (الجدول 1). تُظهر DPPC و DPPC / DOPC (نسبة 1: 1 مولارية) سلوكًا معاكسًا: في حين أن DPPC عالي التنظيم (مرحلة الهلام) غير منفذة للماء تمامًا ، فإن وجود طور سائل غني بـ DOPC وعيوب التعبئة المصاحبة في الواجهة بين التعايش هلام و لد المجالات (Clerc and Thompson ، 1995) في خلائط DPPC / DOPC (نسبة 1: 1 مولية) في درجة حرارة الغرفة تؤدي إلى أعلى نفاذية لجميع MLVs المختبرة.

أدى دمج Erg أو Chol إلى زيادة نفاذية الماء للطبقة الثنائية DPPC (الشكل التكميلي S2A والجدول 1). تأثير Erg أقوى من Chol على نفاذية الطبقة الثنائية ، بينما Zym له تأثير ضئيل. يتم تعيين هذا السلوك النموذجي لـ Chol و Erg لتشكيل لا الطور الذي ، على الرغم من أنه مرتب ، يحتوي على سيولة أعلى من مرحلة الهلام ونفاذية سلبية أعلى (Bittman and Blau ، 1976).

لوحظ تأثير معاكس لمخاليط DPPC / DOPC & # x2013 ، فإن دمج نسبة متساوية من الستيرول يقلل من نفاذية الماء للطبقة الثنائية (الشكل التكميلي S2B والجدول 1). كان التأثير أعلى بالنسبة لـ Erg و Chol مقارنة بـ Zym. على الرغم من أنه بالنسبة للمخاليط الثنائية ، أصبحت نفاذية الكتلة الجوهرية للمرحلة الغنية بـ DPPC أعلى في وجود الستيرول ، وجدنا أن النفاذية بشكل عام انخفضت بشكل كبير بالنسبة لأغشية DPPC / DOPC التي تحتوي على Chol أو Erg. من خلال تمييع مجالات الهلام (الشكل 1) ، يتم تسهيل التفاعل بين الدهون في واجهة المجال وتقليل عدم التطابق بين المراحل المرتبة والمضطربة ، مما يؤدي إلى انخفاض نفاذية طبقة الدهون الثنائية نسبيًا للهلام /لد واجهات المجال (Cordeiro، 2018 Kirsch and B & # x00F6ckmann، 2019). وبشكل أكثر تحديدًا ، تتوافق نسبة متساوية من الكول في الطبقات الثنائية DPPC / DOPC مع أ لد/لا التعايش في الطور (De Almeida et al. ، 2007) والواجهة بين مرحلتين سائلتين أقل عرضة لعيوب التعبئة من تلك الموجودة بين الهلام و لد في حالة عدم وجود ستيرول. ينطبق نفس التفسير على ملاحظة تأثير مماثل على النفاذية عندما يكون Erg موجودًا في حويصلات DPPC / DOPC ويتوافق مع لد/لا التعايش في المرحلة لوحظ في GUVs (الشكل 1). وبالتالي ، فإن نفاذية واجهات المجال هي عامل حاسم في إجمالي النفاذية السلبية في الخلائط الثلاثية. التأثير الصغير لـ Zym ، لأنه غير قادر على تسييل طور الهلام من خلاله لا التكوين ، يدعم أنه يستوعب جيدًا بين الفسفوليبيدات المعبأة بإحكام ، على الأرجح من خلال اعتماد بنية مستوية للغاية.

وقد لوحظت نتائج مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها لنفاذية الماء بالنسبة لنفاذية الطبقة الثنائية للكاتيونات أحادية التكافؤ التي تم الإبلاغ عنها بواسطة حركية شدة التألق لمسبار البيرانين الحساس لدرجة الحموضة (الجدول 1 والشكل التكميلي S3). In DPPC/DOPC mixtures, the incorporation of an equimolar proportion of sterol reduced the K + /H + exchange rate, but the effect of the لا-promoting sterols, Chol and Erg, was much stronger when compared to Zym.

Overall, these results support that the formation of لا domains promoted by Erg and Chol is directly related to the control of membrane passive permeability in highly heterogeneous membranes. Additionally, our experiments highlight that لا domains, with properties halfway between لد and gel, are important for reducing passive permeability at the interfaces between membrane domains.

Erg, Chol and Zym Distinctly Affect the Dielectric Properties of Phospholipid Bilayers

Sterols, in particular Chol, are known to increase the membrane dipole potential when mixed with phospholipids (Haldar et al., 2012). Hence we tested the effect of each sterol on the membrane dipole potential and its connection to لا مرحلة. Due to its complex photophysics, di-4-ANEPPS is responsive to changes in polarity or membrane potential and hydration (Loew et al., 1992 Loew, 1996 Amaro et al., 2017). The well-established excitation ratiometric method (Haldar et al., 2012) with this dye was thus used to assess the membrane dipole potential in binary systems (Figure 2A). Representative excitation and emission spectra of di-4-ANEPPS incorporated into the different systems under study are shown in Supplementary Figure S4.

الشكل 2. The three sterols Erg, Chol, and Zym induce distinct biophysical changes in phospholipid bilayers. (أ) Fluorescence excitation ratio, Rالسابق, as a function of sterol mole fraction in POPC and DPPC MLVs. صالسابق is defined as the ratio of fluorescence emission intensity of di-4-ANEPPS arising from excitation at 420 nm divided by the one arising from excitation at 520 nm. (ب) Influence of Erg and Zym on the polarity at the membrane/water interface expressed as the sterol induced shift of the wavelength of maximum emission intensity of di-4-ANEPPS as a function of sterol mole fraction in POPC/sterol and DPPC/sterol binary mixtures. The values are the mean ± S.D. من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. Probe:lipid ratio 1:500.

When added to fluid POPC, neither Erg nor Zym had pronounced effects on the dipole potential, whereas Chol induced a modest but noticeable increase (Figure 2A). For Erg and Chol the results are in full agreement with a study performed using a similar probe, di-8-ANEPPS (Haldar et al., 2012). In the presence of a DPPC gel phase, Erg had the lowest effect on membrane dipole potential, whereas Chol affected it the most. Despite differing in the induced membrane potential, both Chol and Erg are consensual لا-forming/“raft-promoting” sterols. Thus, a very high membrane dipole potential is a particular feature of Chol-enriched domains but cannot be directly related to the لا phase forming ability of sterols.

Next, we analyzed the sterol-induced spectral shift of di-4-ANEPPS emission by Erg and Zym (Figure 2B), which relates to the hydration layer and the solvent relaxation in the vicinity of the lipid bilayer (Loew, 1996). For Chol, the spectral shifts obtained are much larger for saturated gel phase lipids, such as DPPC or sphingomyelin, than for unsaturated لد phase lipids, such as POPC or DOPC (Bastos et al., 2012). When comparing Erg and Zym in POPC/sterol mixtures, blue-shifts of emission are large even for low Zym, whereas for Erg, the blue-shift is small when لد phase still persists (Erg < 30 mol%), increasing more steeply when the system approaches the full لا state. This possibly derives from Zym’s homogeneous distribution throughout the membrane, affecting membrane properties globally, whereas the effect of Erg on membrane hydration depends on its concentration and hence the proportion of لد to لا. Although the sterol-induced spectral shift follows the same trend in DPPC mixtures with Erg and Zym, the difference between the shifts in a gel versus an لد PC bilayer is larger in the case of Erg. Moreover, the absolute magnitude of the emission blue-shift is generally larger for Chol- than for Erg-containing lipid bilayers (Bastos et al., 2012).

Zym Is Unable to Discriminate Gel and lد Phases

In a previous study (Bastos et al., 2012) we have shown that di-4-ANEPPS fluorescence properties respond specifically to sterol type and levels, as well as to sterol-phospholipid interactions. Similarly, the fluorescence lifetime of di-4-ANEPPDHQ, a probe of the same family, is considerably higher in lipid vesicles containing Chol (Amaro et al., 2017) and, in addition, the removal of Chol from the plasma membrane of mammalian cells with M𻋍 leads to the decrease of the lifetime of this probe (Owen et al., 2006). Moreover, these fluorescent probes can be very efficiently excited with visible light with absorption maximum close to the wavelength of common pulsed excitation lasers used in time-resolved fluorescence microscopy, in opposition to other polarity and sterol sensitive dyes e.g., of the family of Laurdan (Golfetto et al., 2013 Mazeres et al., 2017).

To ensure that di-4-ANEPPS mainly reports on sterol dependent properties, we analyzed its fluorescence intensity decays in LUVs made of binary mixtures comprising a PC, either the fully saturated 16:0 DPPC (gel phase forming) or the mono-unsaturated 16:0,18:1Δ 9 ج POPC (لد phase forming), and each sterol. The parameters obtained from the analysis of such decays are shown in Table 2. Notably, intensity-weighted mean fluorescence lifetime <τ> of di-4-ANEPPS in saturated lipid (DPPC) or unsaturated lipid (POPC) bilayers devoid of any sterol was similar (≈ 1.8 ns and 1.9 ns, respectively) [Figure 3 and Bastos et al. (2012)]. The results in Figure 3 show that all three sterols increase <τ> of di-4-ANEPPS. This indicates a higher quantum yield of the probe in sterol-enriched phases. Moreover, the membrane/water partition coefficient of di-4-ANEPPS previously determined for the POPC/Erg binary system was higher (∼ 2.1×) for an لا membrane than for an لد membrane (Bastos et al., 2012) and its quantum yield was found to be larger when incorporated in the لا phase (Khmelinskaia et al., 2014).

الجدول 2. The molecular environment reported by di-4-ANEPPS is comparable in living cell membranes and model systems containing the same major sterol in a similar fraction.

الشكل 3. ال لا-promoting sterols Erg and Chol induce clearly distinct changes in lipid properties in saturated (DPPC) versus unsaturated (POPC) phospholipids. Mean fluorescence lifetime <τ> of di-4-ANEPPS in binary mixtures of MLVs with Erg (أ), Zym (ب) or Chol (ج) and DPPC (open symbols) or POPC (solid symbols), as a function of sterol mole fraction, at 24ଌ. The values are the mean ± S.D. من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. Probe:lipid ratio 1:500.

In the presence of Chol and Zym, <τ> was longer than for the same Erg mole fractions, in agreement with the spectral emission blue-shifts previously discussed (Figure 2B). However, when comparing the results obtained for DPPC and POPC, it is obvious that Chol and Erg have a much stronger effect in the gel phase lipid, since <τ> of di-4-ANEPPS had a higher increase in vesicles with DPPC than with POPC. On the other hand, Zym showed a unique behavior since <τ> obtained in DPPC or POPC vesicles containing this sterol largely overlapped. This observation, in good agreement with the approximately equal surface area of each phase in DOPC:DPPC:Zym and DOPC/DPPC GUVs (Figure 1 and Supplementary Figure S1), suggests that Zym is not able to discriminate gel and لد phase phospholipids and seems to be equally well accommodated in both phases. The behavior of di-4-ANEPPS <τ> (Figure 3), regardless of the maximum value reached in each particular case, is similar for the Chol and Erg mixtures with DPPC, reaching a plateau slightly before the system is completely in لا phase (≈ 30 mol% sterol) (Sankaram and Thompson, 1991 Hsueh et al., 2005 Silva et al., 2006), which is consistent with a preference of the probe for the sterol-enriched لا مرحلة. In contrast, the trend of di-4-ANEPPS <τ> is approximately linear in the case of Zym, without reaching a clear plateau, indicating the absence of a phase separation and of لا phase formation. The linear trend up to 40/50 mol% Zym is indicative of the efficient incorporation of this sterol into the membrane, despite the lack of marked changes in domain organization and membrane permeability shown above. It should be noted that, in the case of Erg, the sterol solubility limit might have been transposed, particularly when mixed with POPC. Nonetheless, both DPH (1,6-diphenylhexatriene) fluorescence anisotropy in POPC/Erg liposomes (Silva et al., 2006) and the mean temperature of one broad endotherm component of DPPC/Erg mixtures (Mannock et al., 2010) increase up to 40 mol% of the sterol. Moreover, no Erg crystallites were detected at molar proportions as high as 50 mol% in the same DPPC/Erg mixtures (Mannock et al., 2010). The solubility of Chol in both saturated and monounsaturated phosphocholine bilayers, on the other hand, is unarguably higher than 50 mol% (Huang et al., 1999).

Sterol Type and Fraction Dictate the Molecular Environment Reported by di-4-ANEPPS in Living Cell Membranes

Finally, we analyzed living systems naturally containing different sterols in their plasma membrane: mammalian CHO-K1 cells (Chol-containing), بالوزن (Erg-containing) and erg6Δ (Zym-enriched in comparison to بالوزن no Erg) S. cerevisiae الخلايا. The single mutant erg6Δ was used instead of the double mutant erg6Δerg2Δ, with higher levels of Zym, since double mutants in the Erg biosynthetic pathway have a slower growth rate and exhibit a lower total sterol content than their progenitors (Barton et al., 1975). Cells were labeled with di-4-ANEPPS and FLIM experiments were conducted (Figure 4) to analyze both the plasma membrane and the intracellular membranes of individual cells (Supplementary Note 3, Supplementary Figures S5, S6 and Supplementary Table S1). Importantly, since Erg seems to preferentially localize in the inner leaflet (Solanko et al., 2018), di-4-ANNEPS is suitable to probe these Erg-enriched regions not only because, as di-4-ANEPPDHQ, its fluorescence properties are sensitive to medium polarity, membrane potential and hydration, but also because of its ability to flip flop and distribute across both membrane leaflets as a non-charged and short-chained probe, in comparison with the double positively charged di-4-ANEPPDHQ. As the cellular environment is highly complex, to better understand how sterol structure defines biophysical properties of the plasma membrane in eukaryotes, and what simple lipid mixtures may reflect sterol-dependent properties as reported by di-4-ANEPPS fluorescence intensity decay parameters, we compared the cellular results with those in model membranes.

الشكل 4. Mean fluorescence lifetime <τ> of di-4-ANEPPS unravels significant differences in lipid membrane organization between mammalian and yeast cells. FLIM images of mammalian (CHO-K1, أ), بالوزن (ب) و erg6Δ (ج) S. cerevisiae الخلايا. The inset color bars give the <τ> range in ns used in the respective image. Scale bar corresponds to 10 μm for (أ ، ب), 5 μm for (ج). Frequency histograms of <τ> (D𠄿) corresponding to the plasma membrane, PM (solid lines), or intracellular membrane, IM (dashed lines), for each cell type are shown. The corresponding regions of interest can be found in Supplementary Figure S5.

In CHO-K1 cells, a significant difference between the average fluorescence lifetime <τ> of di-4-ANEPPS in the plasma membrane (4.27 ± 0.09 ns) and intracellular membranes (3.72 ± 0.20 ns) was observed (Figures 4A,D and Supplementary Figures S5, S6A, S7D). As <τ> of di-4-ANEPPS is sensitive to sterol levels (see Supplementary Notes 4, 5), this difference of <τ> is most probably due to the lower content of Chol in intracellular membranes than in the plasma membrane, a general feature of mammalian cells (Simons and Vaz, 2004 Owen et al., 2006). These results are in perfect concordance with previous observations for di-4-ANEPPDHQ in HEK293 cells, where longer lifetimes were obtained in the plasma membrane in opposition to intracellular membranes (Owen et al., 2006). Similarly, the labeling of mammalian, ذبابة الفاكهة Kc and Dictyostelium AX2 cells with Laurdan probes also revealed a lower polarity of the plasma membrane lipid environment in contrast to intracellular membranes (Mazeres et al., 2017).

Interestingly, in CHO-K1 cells <τ> of di-4-ANEPPS was much longer (about 63%) than in wt S. cerevisiae plasma membrane (2.58 ± 0.07 ns), which is in very good agreement with the previously measured value in living بالوزن yeast cells in mid-exponential phase in suspension (2.55 ± 0.06 ns) (Santos et al., 2017 Figures 4B,E). This may be compared with our observations in model membranes, where it was shown that Erg had a smaller ability to increase di-4-ANEPPS <τ> than Chol (Table 2). Interestingly, membrane organization as judged from <τ> of di-4-ANEPPS in vesicles containing either saturated PC or palmitoylsphingomyelin (PSM)/Chol lipids resembled most that of CHO-K1 cells, while membrane organization in POPC/Erg vesicles resembled that of S. cerevisiae الخلايا. These results point to a fundamental difference in how to model sterol-enriched regions of mammalian and yeast cell membranes.

To study the influence of sterol profile on membrane properties reported by di-4-ANEPPS <τ>, S. cerevisiae erg6Δ cells were also analyzed, in which Erg is absent and the level of Zym is about four to seven-fold higher than in the بالوزن strain (Zinser et al., 1993 Pedroso et al., 2009 Dupont et al., 2011). Despite the fact that Erg is no longer present, and Zym becomes one of the major cellular sterols (Heese-Peck et al., 2002 Guan et al., 2009 Dupont et al., 2011), no significant differences have been found in the levels of other major membrane lipids (Guan et al., 2009). At a first glance, FLIM images (Figures 4B,C) suggest a similar di-4-ANEPPS fluorescence lifetime in both بالوزن و erg6Δ yeast strains. However, the frequency histograms (Figures 4E,F) point to a slightly longer <τ> of di-4-ANEPPS in erg6Δ cells (Supplementary Figure S4E see also Supplementary Figure S7). This slight increase may be related to the higher Zym content of the mutant cells’ plasma membrane, as mentioned above. This would mean that in the presence of the main sterol of the plasma membrane in this strain, the probe would present a <τ> value similar to the one in the presence of Erg. In fact, that sterol is cholesta-5,7,24-trienol, which was found to accumulate in membrane regions resistant to detergent extraction in Erg6p defective mutants, at levels identical to those of Erg in بالوزن cells (Eisenkolb et al., 2002).

The fluorescence intensity decays of di-4-ANEPPS contain more information than the average fluorescence lifetime <τ>, namely the pre-exponentials and the fluorescence lifetimes of the two exponential components that describe each fluorescence intensity decay. These parameters were collected from all analyzed cells and the average values are given in Table 2. A noticeable difference is found in the value of τ2 ما بين بالوزن و erg6Δ, despite the small difference between <τ> of the probe in those yeast strains – τ2بالوزن = 2.95 ns and τ2erg6Δ = 3.60 ns (Figure 5). The mutant strain value is more similar to the one obtained in model membranes containing Zym than Erg (Table 2). Comparing the lifetimes measured in yeast to those measured in CHO cells, both τ2 and <τ> were clearly longer in the mammalian cells, as in the model systems containing Chol compared to Erg and Zym.

الشكل 5. Long lifetime component τ2 of the fluorescence decay of di-4-ANEPPS is highly sensitive to changes in sterol-dependent properties of membranes. FLIM images of ROIs of the plasma membrane (PM) of CHO-K1 cells (أ), بالوزن (ب)، و erg6Δ S. cerevisiae الخلايا (ج). The inset color bars give the long lifetime component τ2 range in ns used in the respective image. Scale bar = 10 μm. (د) Frequency histograms of τ2 corresponding to the FLIM images shown.

Cell membranes are highly complex and dynamic, and their large number of components could conceivably influence di-4-ANEPPS measurements. Nevertheless, a good parallel could be drawn between the measured fluorescence lifetime components and amplitudes in mammalian and yeast cells of varied sterol profile and the model systems of closer sterol composition.


Observing diffusion

جهاز

  • 1 x ( ext<500>) ( ext) beaker
  • large funnel
  • plastic straw
  • potassium permanganate crystals

طريقة

  1. Fill a beaker with water and allow it to stand for a few minutes so that water movement stops.
  2. Place a large funnel into the water so that it touches the bottom of the beaker. Drop a few small potassium permanganate crystals through the straw. Remove the funnel carefully and slowly.
  3. Observe the size of the area that is coloured by the potassium permanganate at the beginning of the experiment, after 5 minutes and then after 20 minutes.

أسئلة

  1. What do you observe happening in the beaker?
  2. What can you conclude based on your observations?
  3. Explain how using hot water would affect the results of this experiment (remember that when you explain you need to give a reason for your answer).

Observing Diffusion

  1. What do you observe happening in the beaker?
  2. What can you conclude based on your observations?
  3. Explain how using hot water would affect the results of this experiment (remember that when you explain you need to give a reason for your answer).
  1. The purple colour slowly spreads (diffuses) throughout the entire beaker of water, until the colour is evenly spread out.
  2. The molecules of water and potassium permanganate must be constantly moving in order for the purple colour to diffuse throughout the water and spread out evenly.
  3. Using hot water would speed up the spreading process/ diffusion. The additional heat from the water gives the particles kinetic energy which enables them to move more quickly. The faster the particles move, the faster the colour spreads/ diffuses throughout the beaker.

When the concentration of solutes in solution is low, the water concentration is high, and we say there is a high water potential. Osmosis is the movement of water from a region of higher water potential to a region of lower water potential across a semi-permeable membrane that separates the two regions. Movement of water always occurs down a concentration gradient, i.e from higher water potential (dilute solution) to lower potential (concentrated solution). Osmosis is a passive process and does not require any input of energy. Cell membranes allow molecules of water to pass through, but they do not allow molecules of most dissolved substances, e.g. salt and sugar, to pass through. As water enters the cell via osmosis, it creates a pressure known as osmotic pressure.

Figure 2.14: Osmosis is the movement of water from an area of high water potential to an area of low water potential across a semi-permeable membrane.

Watch osmosis taking place by clicking on the following link.

In biological systems, osmosis is vital to plant and animal cell survival. Figure 2.15 demonstrates how osmosis affects red blood cells when they are placed in three different solutions with different concentrations.

Figure 2.15: The effect of hypertonic, isotonic and hypotonic solutions on red blood cells.

Hypertonic (concentrated)IsotonicHypotonic (dilute)
The medium is concentrated with a lower water potential than inside the cell, therefore the cell will lose water by osmosis.The water concentration inside and outside the cell is equal and there will be no nett water movement across the cell membrane. (Water will continue to move across the membrane, but water will enter and leave the cell at the same rate.)The medium has a higher water potential (more dilute) than the cell and water will move into the cell via osmosis, and could eventuality cause the cell to burst.

Plant cells use osmosis to absorb water from the soil and transport it to the leaves. Osmosis in the kidneys keeps the water and salt levels in the body and blood at the correct levels.


Cells as Building Blocks

A cell is the smallest unit of a living thing. A living thing, whether made of one cell (like bacteria) or many cells (like a human), is called an organism. Thus, cells are the basic building blocks of all organisms. Several cells of one kind that interconnect with each other and perform a shared function form tissues several tissues combine to form an organ (your stomach, heart, or brain) and several organs make up an organ system (such as the digestive system, circulatory system, or nervous system). Several systems that function together form an organism (like a human being). There are many types of cells all grouped into one of two broad categories: prokaryotic and eukaryotic. For example, both animal and plant cells are classified as eukaryotic cells, whereas bacterial cells are classified as prokaryotic.


How to Choose a Cell Health Assay

Choosing a cell health assay can be a challenging task. Here we provide a series of factors to consider when choosing cell-based assays for manual or automated systems.

What do you want to measure?

Which cells, viable or dead, do you want to detect at the end of an experiment? There are cell health assays available that specifically detect the number of living cells (viability assays), the number of dead cells (cytotoxicity assays) and for assessing the mechanism of cell death (apoptosis assays). If the information sought is simply to confirm whether there is a difference between “no treatment” negative controls and “toxin treatment” of experimental wells, the choice between measuring the number of viable cells or the number of dead cells may be irrelevant. However, if more detailed information on the mechanism of cell death is being sought, the duration of exposure to toxin, the concentration of the test compound, and the choice of the assay endpoint become critical (1). Explore the following considerations to help you determine what you want to measure and which assays can help you.

What is your model system?

The species of origin and cell types used in cell health studies are often dictated by specific project goals or the drug target that is being investigated. Regardless of the model system chosen, establishing a consistent and reproducible procedure for culturing cells and setting up assay plates is important. Variation in the number of cells per well or equilibration period prior to performing the assay may affect cellular physiology. Maintenance and handling of stock cell cultures at each step of the process should be standardized and validated for consistency. In addition, be sure to use known positive and negative controls throughout the course of the experiment to establish a general understanding of the physiological condition of the cells. Because the nature of the sample can vary depending on cell type and whether it is a 2D or 3D culture model, the assay procedure should be validated for each culture model system. A model system that requires use of smaller cell numbers, such as with primary cells or other limited cell types, will require an assay with increased sensitivity.

Are you using 2D or 3D cell cultures?

Cells in culture are only a model system and are different than cells in their normal in vivo environment. Many researchers are now using 3D cell cultures to more closely mimic in vivo conditions. Instead of growing in a monolayer on a plate surface, cells in 3D culture grow within a conformation that allows them to interact with each other, forming cell:cell connections. This added complexity can present challenges for experimental design when performing cell based assays because assay reagents may have difficulty reaching the center of large microtissues, and lytic assays may not be able to disrupt all cells within the 3D system. Assays may need to be optimized for 3D systems, by reformulating reagents with stronger detergents and incorporating mechanical disruption and longer incubation times. Colorimetric assays, such as MTT, are not optimal for use with 3D cell cultures because they have limited ability to penetrate multiple layers of cells.

The CellTiter-Glo ® 3D Cell Viability Assay (Cat.# G9681) is specifically designed for determining cell viability in 3D culture models. The assay reagent has increased lytic capacity—allowing better penetration of large spheroid samples resulting in more accurate determination of viability compared to other assay methods. The CellTiter-Glo ® 3D Assay Reagent measures ATP as an indicator of viability and generates a luminescent readout that is much more sensitive than colorimetric or fluorescence-based methods.

To measure cytotoxicity of a compound, the LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay (Cat.# J2380) is ideal for use with 3D culture models. Instead of relying on penetration of the cell membrane, the assay measures LDH release from dead cells into the medium. The assay requires only small volumes of medium (2–5µl) to be removed, allowing for repeated sampling over time. This conserves microtissues and maintains remaining viable cells, allowing you to use samples for additional downstream applications, with other assays, or for nucleic acid analysis to acquire more data using the same samples.

When is the right time to perform a cell health assay?

Matching the detected assay marker to the information you need is vital to choosing the appropriate cell health assay. A basic understanding of the changes that occur during different mechanisms of cell death will help you decide which assay to choose. Figure 9 shows a simplified example illustrating chronological changes occurring during apoptosis and necrosis and the results that would be expected using assays that measure different markers.

Figure 9. Mechanisms of cell death can be determined by measuring different markers of cell viability, cytotoxicity and apoptosis in vitro.

Cells undergoing necrosis typically undergo rapid swelling, lose membrane integrity, shut down metabolism and release their cytoplasmic contents into the surrounding culture medium. Cells undergoing rapid necrosis in vitro do not have sufficient time or energy to activate apoptotic machinery and will not express apoptotic markers.

Measuring Apoptosis and Necrosis

Cultured cells that are undergoing apoptosis in vitro eventually undergo secondary necrosis. After extended incubation, apoptotic cells ultimately shut down metabolism, activate caspases, flip phosphatidylserine (PS) to the outer membrane, lose membrane integrity and release their cytoplasmic contents into the culture medium. Markers of apoptosis such as caspase activity or PS exposure on the cell surface may be present only transiently. Therefore, to determine the primary mechanism of cell death, understanding the kinetics of the cell death process in your model system is critical. To avoid missing a critical time point, you may want to choose a nonlytic real-time assay, such as the RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay (Cat.#JA1011), that allows repeated readings from a single assay well over time.

Do you need to collect data from multiple time points?

Live-cell kinetic assays are detection reagents that allow the same sample well to be repeatedly measured over multiple time points. This saves you time and effort, enabling you to collect more informative data in real time. If you need to perform time and dose response experiments to determine the onset or mechanism of toxicity of a drug, you’ll likely benefit from a real-time assay. Especially if you are using limited or precious cell samples, it is critical to get as much data as possible out of your sample. Promega provides a portfolio of assays capable of live-cell kinetic cell health determination.

The RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay (Cat.# G9711) allows you to monitor cell viability continually in the same sample well out to 72 hours depending on cell number. The assay measures the reducing potential of viable cells and is ATP-independent, providing an orthogonal method for viability determination. The RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay (Cat.# JA1011) is a plate reader-based method that measures the real-time exposure of phosphatidylserine (PS) on the outer leaflet of cell membranes during the apoptotic process. The combination and timing of luminescent (apoptotic) and fluorescent (necrotic) signals is used to differentiate secondary necrosis from necrosis caused by other cytotoxic events. The CellTox™ Green Cytotoxicity Assay (Cat.# G8741) uses a dye that produces a fluorescent signal when bound to DNA in membrane-compromised cells. This assay can be applied directly to cells at seeding or when treating with a test compound at any incubation time point, allowing real-time kinetic measurement of the onset of cytotoxicity.

Because these assays are non-toxic and non-lytic, the remaining viable cells remain intact for additional downstream applications resulting in more data per sample.

Learn more about our portfolio of Live-Cell Kinetic Assays!

How many samples do you need to test?

If only one or a few samples need to be measured, manual counting of live or dead cells using a hemacytometer may be adequate. Imaging or flow cytometry methods are also useful for low sample numbers, but are less amenable to high-throughput applications. If large numbers of samples will be measured, homogeneous assays that do not require cell washes or centrifugation steps are the most efficient. In addition, time required for reagent preparation and incubation should be minimal. The stability of the absorbance, fluorescence or luminescence signal is another important factor that provides convenience and flexibility in recording data and minimizes variability when processing large batches of plates. For screening thousands of samples, it is beneficial to choose assays that are sensitive enough to allow miniaturization into high-density plate formats (384- or 1536-well plates).

Promega produces a broad portfolio of plate reader-based cell health assays that are fast, highly sensitive, simple and compatible with high-throughput measurement (2). While the general protocol for the majority of these "homogeneous" assays is add-mix-measure, some protocols may require transfer, incubation or agitation steps. We recommend fully reviewing the assay protocols to determine if the workflow meets your needs.

Find the Right Assay for Your Needs

Click below to compare the variety of Promega plate-based assays designed to measure cell viability, cytotoxicity and apoptosis.

What kind of sensitivity is required?

Another factor to consider when selecting an assay is sensitivity of detection. The sensitivity required is closely linked to the number of cells used per sample. In general, the luminescent assays are more sensitive than assays based on detecting fluorescence or absorbance because minimal background luminescence results in high signal-to-noise ratios. With fluorescence detection, inherent fluorescence from cells, compound fluorescence and spectral overlap between the excitation and emission wavelengths can result in reduced signal-to-noise ratios.

Detection sensitivity will vary with cell type if you choose to measure a metabolic marker, such as ATP level or MTS tetrazolium reduction. The signal-to-background ratios of some assays may be improved by increasing incubation time. The sensitivity of the detection reagent depends upon both parameters of the model system, such as the plate format and number of cells per well in addition to the parameter being evaluated, such as a decrease in cell viability. Assays that are designed to detect a change in viability in a population of 10,000 cells may not require the most sensitive assay technology. For example, a tetrazolium assay such as the CellTiter 96 ® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Cat.# G4000) should easily detect the difference between 10,000 and 8,000 viable cells. On the other hand, assay model systems that use low cell numbers in a high-density multiwell plate format may require maximum sensitivity of detection, such as that achieved with the CellTiter-Glo ® Luminescent Cell Viability Assay (Cat.# G7570) that can easily detect fewer than 100 cells.

How stable are the reagents?

For researchers using automated high-throughput screening platforms, the reagent stability and compatibility with robotic components is often a concern. The assay reagents must be stable at ambient temperature for an adequate period of time to complete dispensing into multiple plates. In addition, the signal generated by the assay should be stable for extended periods of time to allow flexibility for recording data either consecutively or in batch mode processing. The CellTiter-Glo® 2.0 Cell Viability Assay is formulated to allow storage at ambient temperature for multiple days, and generates a stable luminescent signal with a half-life that enables batch processing.

What instruments will you need?

In some cases the choice of assay may be dictated by the availability of instrumentation to detect absorbance, fluorescence or luminescence. Our portfolio of assays contains an optional detection format for each of the three major classes of cell health assays (viability, cytotoxicity or apoptosis). In addition, results from some assays such as the CellTiter-Glo ® Luminescent Cell Viability Assay (Cat.# G7570) can be recorded with more than one type of instrument (luminometer or CCD camera).

Discover the Instrument That Is Right For You

GloMax® Microplate Reader Instruments are easy-to-use, modular detection systems that offer greater flexibility when designing your plate-based assay experiments. These instruments work seamlessly with Promega assays by having preloaded protocols for easy and fast detection.

Which plates are appropriate to use?

When using our plate-based assays, choosing the right type of plate is dependent on your research needs. If microscopic observation of cells is desired, opaque clear-bottom plates are required.

In general, opaque black plates are used for reduced background for fluorescent assays, and opaque white plates are used for optimum light output for luminescent assays. However, the signal strength from most luminescent assays is adequate such that black plates can be used. Using black plates for luminescent assays provides the most flexibility for multiplexing fluorescent and luminescent assays from the same sample. Clear plates are acceptable for use with colorimetric assays, but should not be used with fluorescent or luminescent assays. Choosing the right instrument and plates can help you reduce crosstalk and other issues that might confound your data.

Do you want to perform more than one assay with your sample (multiplex)?

Multiplexing more than one assay is a versatile approach that can provide more information from a single sample. For example, you can simultaneously measure cell stress response pathway events and the mechanism of cell death in the same sample well, or measure cell viability with reporter response to normalize results to the number of live cells. Multiplexing requires compatibility of the assay chemistries being used and the ability to distinguish separate signals using different detection wavelengths or detecting different modalities such as fluorescence and luminescence. For compatible assay chemistries, multiplexing can be accomplished simultaneously in the same sample well. For some assay combinations, measurements must be done in a sequential manner. Still other multiplexing options can be enabled by separating a portion of the sample into a different container to overcome assay chemistry incompatibility, instrument requirements or plate format (e.g., clear vs. opaque plastic). For instance, the LDH-Glo&trade Cytotoxicity Assay (Cat.# J2380) offers the opportunity to gather multiple data points by removing small aliquots of culture supernatant to a white opaque assay plate, thus leaving the original assay plate containing cells available for other assays such as reporter gene analysis, image analysis, nucleic acid analysis, etc.

Multiplexing assays in the sample well eliminates the need for multiple parallel samples for different assays and can save you time, effort and cost as well as provide a statistical advantage compared to using parallel samples. Several of our homogeneous cytotoxicity, apoptosis and viability assays can be multiplexed without transferring media, allowing researchers to assay multiple parameters in the same sample well.

Example multiplexing protocols:

Is the assay reproducible?

Reproducibility of data is an important consideration when choosing a commercial assay. However, for most cell-based assays, the variation among replicate samples is more likely to be caused by the cells rather than the assay chemistry. Variations during plating of cells can be magnified by using cell lines that tend to form clumps rather than a suspension of individual cells. Extended incubation periods and edge effects in plates may also lead to decreased reproducibility among replicates and less desirable Z&rsquo-factor values (2). When choosing an assay, understanding the causes of variability in results is key.

What is the cost?

Usually there is a trade-off between the cost of the reagent and the quality of the assay or the convenience it provides to the user. Less costly reagents often have more complex procedures, limited sensitivity, or cause toxicity to cells in culture due to longer incubations and take longer to perform. Despite those general disadvantages, there may be many applications where less costly assays are suitable however, care should be taken to avoid reagents that are cytotoxic as they can affect the assay results or limit the ability to multiplex with other assays.

Commercially available quality-controlled reagents and assay kits are generally more expensive but often save time and cost in the long run by avoiding repeated experiments or nonreplicable results. For example, even though the reagent cost of an ATP cell viability assay may be higher than other assays, the speed (time savings), sensitivity (cell sample savings) and accuracy (confidence in data) may outweigh the initial cost. Assays with good detection sensitivity that are easier to scale down to 384- or 1536-well formats may result in savings of cell culture reagents and enable testing of very small quantities of expensive or rare test compounds and sample types, especially primary cells. Assays capable of real-time measurement can also reduce costs and save time by eliminating the need to replicate plates for time-course experiments.


DATA AVAILABILITY

All reported datasets used in this paper are publicly available with the associated accession numbers provided below. Tabula Muris mouse cell atlas scRNA-Seq data (Figure 2) was obtained from GSE109774 mouse bone marrow scRNA-Seq from GSE70245 and GSE77849 myocardial infarction and sham surgery mouse scRNA-Seq deposited to GSE136088 human Acute Myeloid Leukemia (AML) datasets from the 10x Genomics website (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets/1.1.0/aml027_pre_transplant, https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets/1.1.0/aml027_post_transplant) AML scRNA-Seq time-course from GSE116481 human bulk AML RNA-Seq data (GSE49642, GSE52656, GSE62190, GSE67040) and control cord-blood samples (GSE48846) Human HEK293T scRNA-Seq from the 10X Genomics website (http://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets/2.1.0/hgmm_12k) bulk RNA-Seq from T-cells and B-cells (GSE51984) single-cell RNA-Seq from human peripheral blood mononuclear cells from the 10x Genomics website (https://support.10xgenomics.com/single-cell-vdj/datasets). cellHarmony and AltAnalyze are open-source and provided in Github according to the Apache License 2.0.


شاهد الفيديو: كيفية رفع الكوليسترول الجيد وتقليل الكوليسترول الضار - د. ربى مشربش - تغذية (كانون الثاني 2022).