معلومة

ما معنى التسمية في الزراعة عالية الكثافة الخلوية لإنتاج البروتين؟


أود أن أعرف معنى هذه المصطلحات في دراسات HCDC لسلالة معدلة. الحد الأقصى للإنتاجية النوعية (mg / g DCW) الحد الأقصى لإنتاج الحجم الحجمي للمنتج (g / l) معدل تكوين المنتج المحدد Qp (mg / g DCW / h)


أقصى عائد محدد = مليغرام منتج لكل جرام من وزن الخلية الجافة (DCW). العائد الحجمي الأقصى = غرام المنتج لكل لتر ثقافة. معدل تكوين المنتج المحدد Qp = منتج مليغرام لكل جرام من وزن الخلية الجافة في الساعة.


ثقافة دفعة الاحتياطي الفيدرالي

ثقافة دفعة الاحتياطي الفيدرالي هي ، بالمعنى الأوسع ، تقنية تشغيلية في عمليات التكنولوجيا الحيوية حيث يتم تغذية (توريد) واحد أو أكثر من العناصر الغذائية (الركائز) إلى المفاعل الحيوي أثناء الزراعة والتي يبقى فيها المنتج (المنتجات) في المفاعل الحيوي حتى نهاية يركض. [1] هناك وصف بديل للطريقة وهو ذلك المستنبت الذي "يدعم الوسط الأساسي ثقافة الخلية الأولية ويضاف وسط تغذية لمنع استنفاد المغذيات". [2] وهو أيضًا نوع من ثقافة نصف دفعة. في بعض الحالات ، يتم إدخال جميع العناصر الغذائية في المفاعل الحيوي. تتمثل ميزة ثقافة الدُفعات الغذائية في أنه يمكن التحكم في تركيز الركيزة المغذية في سائل الاستزراع عند المستويات المرغوبة بشكل عشوائي (في كثير من الحالات ، عند مستويات منخفضة).

بشكل عام ، تتفوق مزرعة الدُفعات الغذائية على ثقافة الدُفعات التقليدية عندما يؤثر التحكم في تركيزات عنصر غذائي (أو مغذيات) على محصول أو إنتاجية المستقلب المطلوب.


خلفية

تستخدم مبيدات الآفات الكيميائية على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن الاستخدام المكثف لهذه المبيدات يؤثر أيضًا على الحشرات والحيوانات غير المستهدفة ، وبالتالي يضعف النظام البيئي ، ويحتمل أن يشكل خطرًا على صحة الإنسان ، ويسبب أمراضًا ، بما في ذلك السرطان ، والاضطرابات الإنجابية ، والاضطرابات العصبية ، والحساسية. لذلك ، هناك إجماع على الحد من استخدام مبيدات الآفات [1]. لحماية البيئة البيئية وصحة الإنسان بشكل أفضل ، وللحفاظ على التنمية الزراعية المستدامة ، من الضروري تطوير مبيدات الآفات "الخضراء" [2،3،4،5]. الفطريات هي المصدر الرئيسي لمبيدات الآفات البيولوجية [6،7،8]. مستقلباتها ، بما في ذلك البروتينات السامة والببتيدات ، لديها القدرة على استخدامها في المكافحة البيولوجية للآفات [9 ، 10 ، 11].

Ribotoxins التي تنتجها بعض الأنواع الفطرية ، مثل فطر الرشاشيات, هيرسوتيلا طومبسونى وغيرها من الفطريات الممرضة للحشرات ، لديها القدرة على استخدامها كمبيدات بيولوجية [10 ، 12 ، 13]. على وجه التحديد ، فإن سموم الريبوت الفطرية hirsutellin A (HtA) التي ينتجها مسببات الأمراض الفطرية اللافقارية H. تومبسونى يُظهر سمية خلوية خاصة بالحشرات وخصائص قوية للمبيدات الحشرية [14 ، 15]. Native HtA هو بروتين أحادي غير جليكوزيلاتي يشتمل على 130 من بقايا الأحماض الأمينية ويظهر ثباتًا حراريًا واستقرارًا للبروتياز. على سبيل المقارنة ، HtA هو 10-20 من الأحماض الأمينية أقصر من الريبوتوكسين منه فطر الرشاشيات، ولديهم تماثل منخفض معهم (25٪) ، وهو السبب الرئيسي الذي يؤدي إلى اختلافات كبيرة في وظائفهم البيولوجية [14 ، 16 ، 17]. أفادت دراسات سابقة أن HtA شديد السمية لعث وحشرات المن البالغة ، وقاتلة ليرقات العثة والذباب ، وتُظهر سمية فموية ليرقات حديثي الولادة من الزاعجة المصرية [14 ، 15]. ومع ذلك ، فإن محتوى HtA الأصلي منخفض ، حيث يتم عزل 35 ميكروغرام من HtA فقط من المادة الطافية لـ 1 جرام من الفطريات المجففة وأقل من 1 مجم HtA المنقى من 1 لتر من مرق التخمير [14]. على الرغم من أن HtA المؤتلف (rHtA) قد تم تحضيره بنجاح باستخدام الإشريكية القولونية (بكتريا قولونية) نظام التعبير ، يمكن تنقية أقل من 1 مجم rHtA من 1 لتر من وسط الثقافة باستخدام بروتوكول تنقية معقد [12]. وعلاوة على ذلك، بكتريا قولونية- RHtA المعبر عنه ليس البروتين الأصلي لـ N-terminal ، مما يؤدي إلى نشاط بيولوجي مختلف محتمل. بالإضافة إلى، بكتريا قولونية تنتج كميات كبيرة من السموم الداخلية ، والتي يجب إزالتها قبل تحليلات النشاط في الجسم الحي. أدى الفشل في تحضير كميات كبيرة من HtA إلى الحد بشكل خطير من زيادة تطوير إمكانات مبيدات الحشرات.

يتطلب التحقيق في النشاط الحيوي HtA ضد الآفات الحشرية كميات كبيرة من البروتين [14 ، 15]. على وجه الخصوص ، يتطلب تحديد نشاط المبيدات الحشرية عن طريق الفم لـ HtA ضد الآفات الزراعية وسلامتها البيولوجية للثدييات أيضًا كمية كبيرة من البروتين [14 ، 15]. لذلك ، من الضروري تطوير نظام تعبير البروتين غير المتجانسة وطريقة تنقية فعالة لإعداد كمية كبيرة من rHtA النشط. كنظام تعبير بروتيني حقيقي النواة عالي المستوى مستخدم على نطاق واسع ، بيتشيا باستوريس (P. باستوريس) لديه القدرة على إفراز البروتينات المؤتلفة [18]. بالإضافة إلى، P. باستوريس لديه القدرة على إنتاج كميات على مستوى الجرام من البروتين المؤتلف الإفرازي لكل لتر من ثقافة التخمير [19]. بالإضافة إلى، P. باستوريس لا ينتج الذيفان الداخلي. لذلك ، يمكن استخدام البروتينات المؤتلفة المنقاة مباشرة للتجارب في الجسم الحي.

في هذه الدراسة ، أبلغنا عن طريقة للتعبير الفعال وتنقية rHtA من P. باستوريس X33 عن طريق التخمير بنظام التغذية. أيضًا ، قمنا بتحليل النشاط الحيوي لـ rHtA.


مقدمة

Arbutin هو هيدروكينون جلوكوزيد يتم توزيعه على نطاق واسع في نباتات مختلفة من Ericaceae مثل Arctostaphylos uva-ursi و فاسينيوم النيابة. يثبط نشاط التيروزيناز في تخليق الميلانين عن طريق إطلاق المكون النشط ببطء ، الهيدروكينون ، من خلال التحلل المائي لمجموعة الجلوكوزيد [5 ، 8 ، 16]. إنه عامل آمن ومعتدل لعلاج اضطرابات فرط التصبغ مقارنة بالهيدروكينون وله إمكانات سوقية هائلة في صناعة مستحضرات التجميل. من الناحية الهيكلية ، فإن α-arbutin عبارة عن α-glucoside من hydroquinone وتوفر رابطة α-glucosidic ثباتًا وفعالية أعلى على الميلانوجينات مقارنة بالصيغة β. [5 ، 24 ، 25]. نظرًا لوضعه الأفضل في تثبيط التيروزيناز ، فقد تم فحص إنتاج α-arbutin من قبل العديد من الباحثين. يتم إنتاج α-Arbutin عن طريق الارتباط بالجلوكوز للهيدروكينون في وجود الإنزيمات المنقاة [13 ، 18] أو بواسطة الميكروبات الكاملة [14] أو التحفيز الحيوي للخلايا النباتية [9 ، 15 ، 27]. سيؤدي استخدام الإنزيمات عالية النقاء في عملية الإنتاج في النهاية إلى α-arbutin باهظ التكلفة ، ويؤدي استخدام الخلايا الكاملة إلى إنتاجية أقل بسبب قيود النقل الجماعي التي يفرضها الغشاء الخلوي.

يعد تطوير المحفزات الحيوية للخلية الكاملة التي تعرض الإنزيم المستهدف مباشرة على سطح الخلية إحدى طرق التغلب على حاجز نفاذ الركيزة وتحسين إنتاجية المنتج. على سبيل المثال ، باستخدام سيودوموناس سيرينجاي بروتين نواة الجليد (INP) كبروتين حامل ، تم عرض إنزيمات مثل ليفانسوكراز [10] وكاربوكسي ميثيل سلولاز [11] وهيدرولاز الفوسفور العضوي [23] بنجاح على الإشريكية القولونية السطح لاستخدامه كمحفزات حيوية للخلية الكاملة في التطبيقات ذات الصلة. في الدراسة السابقة [26] ، قمنا ببناء الهندسة بنجاح بكتريا قولونية عرض ترانسجلوكوزيداز على سطح الخلية باستخدام عزر التثبيت INP. تم استخدام الخلايا الكاملة التي تعبر عن ترانسجلوكوزيداز INPNC على السطح مع نشاط ترانسجلوكوزيلات عالي جدًا كمحفزات حيوية في الارتباط بالجلوكوز للهيدروكينون مع المالتوز كمانح للسكر ، وتم الحصول على عائد مرتفع من أربوتين [26].

في هذه الدراسة ، الإنتاج الفعال من حيث التكلفة لكمية كبيرة من الهندسة بكتريا قولونية تم توضيح الخلايا التي تثبت ترانسجلوكوزيداز المعروض على السطح من أجل التحول الأحيائي عن طريق تخمير دفعة التغذية. تم استخدام تركيز الخلية ونشاط تحويل الجلوكوز للمحفز الحيوي للخلية الكاملة لتخليق أربوتين كمعلمات لتحليل نتائج هذه الدراسة.


2. المواد والأساليب

2.1 سلالة الطحالب وظروف النمو

S. المؤنف تم عزل GT-2 من بحيرة جنوب قوانغتشو ، الصين. تم الحفاظ على خلايا الطحالب في وسط نمو إندو معدل ، يحتوي على 30 جم / لتر جلوكوز ، 3 جم / لتر KNO3، 1.2 جم / لتر KH2ص4، 1.2 جم / لتر MgSO4• 7H2O ، 0.2 جم / لتر سترات الصوديوم ، 0.016 جم / لتر FeSO4• 7H2O2.1 مجم / لتر EDTA-Na2، 0.03 جم / لتر كاكل2• 2H2O ، 2.86 مجم / لتر هيدروجين3بو3، 0.222 ملجم / لتر ZnSO4• 7H2O ، 1.81 مجم / لتر MnCl2• 4 ح2O، 0.021 مجم / لتر Na2MoO4، و 0.07 ملغم / لتر من CuSO4• 2H2O. لتحضير اللقاحات للتخمير ، مستعمرة واحدة س. مؤنف تم تلقيح GT-2 في 100 مل من وسط Endo المعدل في دورق Erlenmeyer سعة 250 مل ونمت عند 30 درجة مئوية لمدة 5-6 أيام في حاضنة اهتزاز بسرعة 180 دورة في الدقيقة ، والتي تم استخدامها بعد ذلك كقاح للتخمير.

تم إجراء تجارب التخمير على مقاعد البدلاء في مفاعل حيوي 7.5 لتر (BioFlo & CelliGen 310 نيو برونزويك) بحجم العمل الأولي 2.8 لتر. تم الحفاظ على الرقم الهيدروجيني تلقائيًا عن طريق إضافة 3 مولار هيدروكسيد الصوديوم أو 1 مولار من محلول حمض الهيدروكلوريك. تم الحفاظ على التهوية عند 1 vvm مع معدل تدفق الهواء 2.8 لتر / دقيقة. تم التحكم في الأكسجين المذاب (DO) تلقائيًا فوق 40٪ عن طريق الاقتران بسرعة التحريك. في وسط دفعة التخمير ، KNO3 تم استبداله بـ 0.84 جم / لتر من اليوريا. كان وسط التغذية المستخدم أثناء عملية التخمير عبارة عن وسط دفعي مركّز 25 ضعفًا ، يحتوي على 750 جم / لتر من الجلوكوز.

تم إجراء التخمير على نطاق تجريبي في مفاعل حيوي بخزان مقلوب سعة 1000 لتر (WKT 1000 L Yangzhong Weikete Biological Engineering Equipment Co.، Ltd. ، الصين) يحتوي على 300 لتر وسط. لتقصير فترة الاستزراع ، تم تلقيح التخمير على نطاق تجريبي 1000 لتر باستخدام 40 لترًا من الثقافة عالية الكثافة الخلوية (80 جم / لتر) من مفاعل حيوي 100 لتر بعد 4 أيام من الزراعة على دفعات التغذية ، والتي تم تلقيحها من جهاز تخمير على المقياس 7.5 لتر. كان تركيز الكتلة الحيوية الأولي في زراعة المخمر 1000 لتر حوالي 10 جم / لتر. بالنسبة للتخمير على نطاق تجريبي 1000 لتر ، تم ضبط معدل التهوية وسرعة التحريض مبدئيًا عند 20 م 3 ساعات -1 (1 فولت في الدقيقة) و 80 دورة في الدقيقة ، على التوالي. تم الحفاظ على ضغط المفاعل الحيوي الداخلي عند 0.035 ميجا باسكال.

بالنسبة للثقافة الضوئية ، تم استخدام وسيط النمو BG-11 (Rippka ، Deruelles ، Waterbury ، Herdman ، & Stanier ، 1979). نمت خلايا الطحالب في 750 مل BG-11 في عمود PBR سعة 800 مل (معرف 5 سم) تحت ضوء مستمر (250 ميكرولتر · م 2 · ثانية -1) عند 25 ± 2 درجة مئوية. تم توفير الخلط والتهوية بواسطة فقاعات هواء تحتوي على 2.0٪ (حجم / حجم) ثاني أكسيد الكربون2. تم توسيع ثقافة الخلية بالتتابع إلى لوحة PBR سعة 12 لترًا و PBR أنبوبي 380 لترًا متبوعًا بـ PBR أنبوبي 1300 لتر. كان حجم اللقاح خلال كل خطوة 10٪ (ت / ت) من الحجم الإجمالي لوسائل الثقافة.

2.2 تحريض إنتاج الدهون

أجريت تجارب إنتاج الدهون على نطاق تجريبي في PBR أنبوبي سعة 5،300 لتر (معرف 5 سم) في الهواء الطلق من يونيو إلى سبتمبر في عام 2016 (39 ° 97 ′ شمال 117 ° 06 شرقًا ، سانهي ، الصين). تم نقل خلايا الطحالب المزروعة في مخمر 7.5 لتر و 1300 لتر من PBR في الداخل إلى اثنين من PBR متوازيين 5،300 لتر وتحفيزها لإنتاج الدهون في وسط BG-11 المحدود N الذي يحتوي على 1.1 ملي نترات لمدة 13 يومًا. للتجارب في الهواء الطلق ، CO2 في المزرعة خلال ساعات النهار للحفاظ على الرقم الهيدروجيني في حدود 6.5 إلى 6.8. منع نظام التبريد درجة حرارة المزرعة من تجاوز 35 درجة مئوية. خلال الليل ، تم السماح لدرجة حرارة المزرعة بالتوازن مع الجو.

2.3 الإجراءات التحليلية

تمت مراقبة نمو الخلية عن طريق قياس وزن الكتلة الحيوية الجافة وفقًا لـ Chini Zittelli و Pastorelli و Tredici (2000). تم حساب رقم الخلية باستخدام مقياس الدم بعد التخفيف المناسب. تم تحديد تركيز الجلوكوز باستخدام نظام مراقبة الجلوكوز في الدم Safe-Accu UG (نموذج BGMS-1 Sinocare Inc. ، تشانغشا ، الصين). تم تحديد محتويات إجمالي الدهون وفقًا للطريقة الموضحة في دراسة سابقة (Jia et al. ، 2015).

2.4 التحليل الاقتصادي التقني

تمت مقارنة تكلفة الزراعة غيرية التغذية لإنتاج اللقاح بتكلفة أنماط الزراعة ذاتية التغذية التقليدية ، بما في ذلك أنظمة البركة المفتوحة وأنظمة PBR ، وكلاهما يستخدم على نطاق واسع في الصناعات الطحلبية ، وبالتالي تم استخدامهما كمراجع لتقييم الجدوى الاقتصادية للزراعة غيرية التغذية هنا . تم تلخيص افتراضات المدخلات الرئيسية لتحليل TE في الجدولين S1 و S2. لتقييم تأثير المقياس على تكلفة الإنتاج ، تم افتراض أن سعتين مختلفتين لإنتاج اللقاح تبلغ 1000 و 10000 طن سنويًا في 300 يوم تشغيل ، على التوالي. مجموعة مفاعل حيوي ضوئي أنبوبي لإنتاج إيموكولا هي 98 م 3 ، وحجم الاستزراع في البركة المفتوحة يفترض أن يكون 1000 م 3. وفقًا لنتائجنا التجريبية على نطاق تجريبي في جهاز التخمير 1000 لتر ، افترضنا أن متوسط ​​تركيز الكتلة الحيوية للحصاد في مخمر إنتاج اللقاح 120 م 3 هو 200 جم / لتر ، ويتم تحقيقه في غضون 10 أيام في دفعة من عملية الإنتاج. التركيزات الأولية للكتلة الحيوية في الأحواض المفتوحة والمفاعل الحيوي الضوئي الأنبوبي هي 0.1 و 0.2 جم / لتر ، وتركيزات الكتلة الحيوية للحصاد هي 0.8 و 2 جم / لتر ، على التوالي. تم افتراض معدل الانهيار الناتج عن التلوث الحيوي في التخمير غير المتجانسة ، البركة المفتوحة ، والمفاعلات الحيوية الضوئية الأنبوبية بنسبة 10٪ و 15٪ و 5٪ على التوالي. بالنسبة للافتراضات الاقتصادية ، تم تقدير جميع تكاليف رأس المال والتشغيل لكل من إنتاج اللقاح غير المتجانسة والتغذية الضوئية بناءً على عروض أسعار البائعين أو الدراسات السابقة أو التقديرات الهندسية القياسية. تم حساب تكلفة الكتلة الحيوية بناءً على النموذج الذي أبلغ عنه Tapie and Bernard (1988). يتضمن هيكل التكلفة المعلمتين الرئيسيتين التاليتين: تكاليف الاستثمار الرأسمالي وتكاليف التشغيل. تشمل تكاليف التشغيل التكاليف الثابتة (مثل العمالة والنفقات العامة والصيانة) والتكاليف المتغيرة (مثل العناصر الغذائية والطاقة وثاني أكسيد الكربون.2، و الماء). بالنسبة للثقافة غيرية التغذية والضوئية ، تبلغ النفقات العامة 60٪ و 2٪ من تكلفة المعدات المركبة للعمالة والصيانة ، على التوالي. تم افتراض أن عمر البركة المفتوحة والأنبوب PBR 10 و 15 سنة على التوالي. للثقافة الضوئية ، CO2 من المفترض أن يتم إمدادها من محطة توليد كهرباء قريبة. تم إعادة تدوير المياه في أنظمة الاستزراع ذات التغذية الضوئية ، وافترض أن معدل تبخر الماء في الأحواض المفتوحة 1 سم / يوم.

2.5 التحليل الإحصائي

يتم التعبير عن القيم على أنها تعني ± الانحراف المعياري. تم إجراء الاختبارات الإحصائية باستخدام تحليل أحادي الاتجاه للتباين في SPSS (الإصدار 19.0). تم النظر في فروق ذات دلالة إحصائية في ص & لتر .05.


3. النتائج والمناقشة

3.1 ضمور اللوسين وتأثيره المثبط

لإعداد عملية زراعة ل بكتريا قولونية K12 ER2507 تم تقدير تأثير الليوسين على نمو الخلايا. لذلك ، تهتز زراعة قارورة بكتريا قولونية تم إجراء K12 ER2507 بتركيزات ليوسين أولية مختلفة (0.0-3.0 جم / لتر) وتم قياس كثافة الخلية خلال أول 22 ساعة من النمو (الشكل 1 أ). وجدنا أن أعلى معدل نمو محدد تم الحصول عليه من أقل تركيز أولي ليسين 0.1 جم / لتر ، ولكن هذا التركيز لا يكفي لتحقيق أقصى كثافة للخلية ، والتي تتطلب 0.2 جم / لتر كحد أدنى. تم الانتهاء من التجربة بعد الفترة الزمنية المحددة مع الثقافات التي لا تزال تنمو والتي قد تصل إلى كثافة الخلايا النهائية الأعلى من المزيد من الليوسين. لوحظ نمو ضئيل جدًا إذا كان تركيز الليوسين أعلى من 3.0 جم / لتر -1 (الشكل 1 أ ، يتم إخفاء نقاط البيانات الثلاث الأولى خلف الآخرين). كما هو متوقع ، لم يتم تحديد أي نمو إذا لم يتم تطبيق مكملات الليوسين على الوسط (الشكل 1 أ ، البيانات الموضحة لمدة 16 ، 17 ، 18 ساعة تم اختبارها جيدًا في ثقافة ليلية ممتدة أكثر). السلالة المستخدمة تحمل أ ليو 6 الطفرة ، مما أدى إلى نقص نازعة هيدروجين الأيزوبروبيلمات ، وهو إنزيم يشارك في التخليق الحيوي لليوسين 9. اللوسين مطلوب كجزيء إشارة للبروتين التنظيمي المستجيب لليوسين ، والذي ينظم التعبير عن الجينات المشاركة في الوظائف الخلوية المختلفة. شيمادا وآخرون 12 وكذلك كالفو وماثيوز 13 ذكر أن هذا البروتين له تأثير قوي على استقلاب الخلية في بكتريا قولونية.

بناءً على كثافات الخلايا ، تم حساب معدلات النمو المحددة القصوى وعرضها في الشكل 1 ب. أعلى قيمة 0.43 ساعة -1 تقابل أقل تركيز ليوسين قدره 0.1 جم / لتر -1. ينتج عن الزراعة التي يتم إجراؤها باستخدام 3.0 جم من الليوسين معدل نمو محدد يبلغ 0.19 ساعة فقط. روثن وآخرون. 4 الإبلاغ عن هذا التأثير المثبط لليوسين أيضًا.

3.2 تحديد محصول الكتلة الحيوية من الليوسين

أظهرت نتائج التجارب الأولى الضرورة المتوقعة من الليوسين لنمو الخلايا بينما حتى التركيزات المنخفضة تقلل من معدل النمو المحدد للخلايا. لإعداد عملية التغذية على دفعات ، يعتبر معامل العائد للكتلة الحيوية من الليوسين معلمة أساسية. يمكن أن تؤدي إضافة الليوسين غير المتوازنة إلى تقييد النمو أو تثبيطه بسبب تراكم الليوسين ، كما هو موضح أعلاه.

للتحقيق في هذه العلاقات ، تم استخدام نهج عاملي كامل ، ثلاثة مستويات تصميم التجارب (DoE). ترد إعدادات العامل والنتائج في الجدول 1. تم اختيار تركيز الجلوكوز في نطاق من القيمة المنخفضة (2 جم / لتر) حتى القيمة الأولية النموذجية لمرحلة الدُفعات من HCDC ، بينما تم تقدير نطاق تركيز الليوسين من التجارب الموضحة في الشكل 1 ، تشير إلى وجود تأثير مثبط قوي أعلى من 0.6 جم / لتر -1.

نأنا جليو (ز / لتر) ججلك (ز / لتر) ميكرومترالأعلى (ح −1) (ز / ز)
ن1 0.10 2 0.44 19.4
ن2 0.35 2 0.40 15.9
ن3 0.60 2 0.36 16.6
ن4 0.10 16 0.41 17.4
ن5 0.35 16 0.40 18.2
ن6 0.60 16 0.37 10.5
ن7 0.10 30 0.39 16.0
ن8 0.35 30 0.38 12.4
ن9 0.60 30 0.35 6.6
ن10 0.35 16 0.38 14.6
ن11 0.35 16 0.38 15.5
ن12 0.35 16 0.38 16.8

تصور المخططات الكنتورية في الشكل 2 نتائج تباين تركيز الليوسين والجلوكوز ، على التوالي. يوضح الشكل 2 أ التأثير القوي لليوسين على معدل النمو المحدد ، بينما لوحظ تأثير معتدل للجلوكوز. يعرض الشكل 2 ب تأثيرًا تفاعليًا قويًا للجلوكوز والليوسين على معامل العائد ذX / ليو. روثن وآخرون. 4 تقرير عن بكتريا قولونية HB101 ، وهو مساعد للثيامين والبرولين والليوسين ، وهو انخفاض مماثل في معدل النمو ومعامل العائد. قاموا بالتحقيق في المتطلبات المتوسطة في الزراعة المستمرة وحددوا محصول الكتلة الحيوية (20 ± 1) جم CDM (جم ليسين) −1. في ظل افتراض انخفاض تركيز الجلوكوز في المزرعة ، فإن هذه القيمة تتوافق تمامًا مع قيمتنا.

(1) (2)

باستخدام المعادل. 1 ، يمكن الحصول على معامل العائد 19.8 جم CDM (g leucine) −1 للحدود الدنيا لمساحة التصميم ، 0.1 جم / لتر ليسين و 2 جم / لتر جلوكوز ، على التوالي.

3.3 استراتيجية تغذية الليوسين لزراعة الدُفعات الغذائية

بالنظر إلى التأثير المثبط لليوسين ، خاصة في وجود مستوى جلوكوز أعلى ، تم تطوير استراتيجية تغذية لتحقيق كثافة خلايا عالية. أشار نهج وزارة الطاقة إلى معدل النمو الأمثل ومعامل إنتاج الكتلة الحيوية في وجود تركيزات منخفضة من الليوسين والجلوكوز. ومع ذلك ، يجب تجنب قيود الليوسين بسبب نقص العرض.

في عملية HCDC التقليدية ، تكون تركيزات العديد من الركائز في وسيط البداية عالية إلى حد ما لتزويد الخلايا بالعناصر الغذائية المطلوبة على مدار مرحلة الدُفعات أو ، في حالة بعض العناصر الغذائية ، طوال العملية بأكملها. وسيط دفعي نموذجي وفقًا لـ Korz et al. 3 يحتوي على حوالي 25 جم / لتر جلوكوز ، وهو تركيز يظهر أنه يقلل بشكل كبير من معدل نمو الخلايا وكذلك إنتاج الخلايا من الليوسين (الشكل 1). وبالتالي ، بدلاً من عملية الدُفعات / الدُفعات التقليدية ، كانت زراعة كثافة الخلايا عالية المحسنة (iHCDC) ضرورية للتغلب على مشاكل التركيزات الأولية العالية من الجلوكوز والليوسين. لقد أزلنا مرحلة الدُفعات تمامًا عن طريق ملء المفاعل بوسط خالٍ من المصدر C ، وبدأنا مباشرة بتغذية الركيزة. تم الإبلاغ عن هذه الاستراتيجية لزيادة العملية لعملية التكاثر بدرجة عالية 14. استخدم المؤلفون معدل تغذية أسي يتوافق مع معدل نمو محدد ، والذي كان تقريبًا ثلاثة أرباع الحد الأقصى لمعدل النمو المحدد للحصول على نمو متحكم فيه ذاتيًا ينتج عنه تركيز ثابت للكتلة الحيوية ومعدل نمو محدد في وقت الحث.

تبدأ عمليتنا بوسط ليوسين منخفض التركيز خالٍ من الجلوكوز. نظرا لخفض ميكرومتريضع من الممكن الحفاظ على كلا التراكيز منخفضة للغاية. ميكرومتريضع تم اختيار معدل التغذية الأولي المتزايد بشكل أسي لينتج عنه ثلث معدل النمو الأقصى للخلية. تليها مرحلة ثانية بتغذية أسية منخفضة ولكن لا تزال متسارعة وبالتالي معدل نمو محدد أقل لتجنب قيود نقل الأكسجين عند الوصول إلى كثافة الخلايا التي تزيد عن 50 جم CDM L −1. تظهر الخلايا سريعة النمو ذات الكثافة العالية للخلايا معدلات امتصاص عالية جدًا للأكسجين ، والتي يجب أن تتحقق من خلال إمكانات نقل الأكسجين لنظام المفاعل. تم الانتهاء من مرحلة الدفعة الثالثة ، وهي مرحلة الإنتاج مع بيانات التغذية المحسنة لهذه الحالة ، عن طريق استنفاد العلف. تم تشغيل جميع خطوات الانتقال المؤتمتة (MFCS) من مرحلة دفعة واحدة إلى المرحلة التالية من خلال الوصول إلى كثافة بصرية محددة مسبقًا (إدخال القيم غير المتصلة) أو الوقت المحسوب للحصول على كثافة الخلية هذه خلال الفترات غير المراقبة دون أخذ العينات.

يُظهر Leucine قابلية ذوبان منخفضة عند درجة الحموضة المحايدة ، والتي تزداد مع زيادة الرقم الهيدروجيني 15. وهكذا ، تم تحقيق تغذية كمية كافية من الليوسين عن طريق إذابته في قاعدة الأمونيا. تتناسب إضافة القاعدة مع نمو الخلايا ، بسبب وظيفتها كمصدر للنيتروجين. أبلغ Reitzer 16 عن أن الأمونيا هي مصدر N لأعلى معدل نمو ومصدر نيتروجين مفضل لـ بكتريا قولونية زراعة. من الكتلة الحيوية من معامل إنتاج الليوسين تم حساب الكمية المطلوبة وتذويبها في 25٪ NH3 ، والذي تم استخدامه كمحلول أساسي وجرعاته بواسطة وحدة التحكم في الأس الهيدروجيني أثناء الزراعة.

تظهر زراعتان بكميات مختلفة من الليوسين المذاب في الأمونيا في التين. 3 و 4. تم تنفيذ كلاهما باستخدام نفس المعلمات ، ميكرومترمجموعة 0 = 0.17 ساعة -1 خلال مرحلة الدُفعة الأولى وبعد 23 ساعة بالتغيير إلى مرحلة الدُفعة الثانية و ميكرومترمجموعة 1 = 0.15 ساعة -1. تم تخفيض معدل النمو النهائي إلى ميكرومترمجموعة ، 2 = 0.12 ساعة −1 بعد 31.4 ساعة في الزراعة A و 29.9 ساعة في B.

تم اشتقاق معامل الغلة للزراعة الأولى (الشكلان 3 أ و 4 أ) من المعادلة. 1 لوسط خالٍ من الجلوكوز تقريبًا (0.1 جم جي إل سي لتر −1) وتركيز منخفض قدره 0.3 جم ليوسين لتر −1 مثل ذX / ليو = 19.3 جم CDM (جم ليسين) −1. تجدر الإشارة إلى أن مجموعة المعلمات هذه تمد مساحة التصميم قليلاً. من عند ذX / ليو تم حساب كمية الليوسين المطلوبة لمحلول تغذية 1.50 لتر ، يحتوي على 750 جم جلوكوز لتر -1 ، مما ينتج عنه ذX / جي إل سي 0.45 جم CDM (g glc) −1 في 52.5 جم ليسين (L 25٪ NH3) −1. بالإضافة إلى ذلك ، تم إذابة 0.3 جم من الليوسين L 1 في وسط بدء 3 لتر ، استخدم منه 0.5 لتر لتحضير الوسط الذي تم استخدامه لإنتاج اللقاح في قوارير الاهتزاز. تمت إعادة تعبئة هذا الحجم لاحقًا كلقاح في المفاعل الحيوي لتكوين وسط ملقح 3 لتر مع ما يقرب من 0.2 جم / لتر من الليوسين.

أثناء مرحلة الدُفعة الأولى بعد 28 ساعة ، زاد تركيز الأسيتات بشكل كبير وانخفض النمو بشكل غير متوقع بعد 30.5 ساعة ، قبل بدء مرحلة الإنتاج. خلال المرحلة الأخيرة من الزراعة ، أدت الزيادة الطفيفة في الكتلة الحيوية مع زيادة الحجم من التغذية إلى تركيز ثابت تقريبًا للخلية. تم الانتهاء من الزراعة بعد 33.5 ساعة بتركيز CDM نهائي قدره 74.9 جم / لتر. استند حساب تركيز الليوسين في 25٪ من الأمونيا على افتراض خاطئ بأن التعبئة الكاملة للزجاجة الأساسية ، 0.5 لتر ، ستتم إضافتها أثناء الزراعة. كان الحجم المستخدم ، الذي تم تناول جرعته بواسطة وحدة التحكم في الأس الهيدروجيني أقل بكثير ، مما أدى إلى نقص في المعروض من الليوسين مع تراكم الجلوكوز (لم يتم تحليله) والذي قد يفسر تكوين الأسيتات ، والمزيد من تقليل النمو 17 ، والجرعة الزائدة القاعدية الناتجة عن التحمض مما أدى إلى تركيز الأمونيا السام ، وأخيراً زيادة تركيز الليوسين. أعطى حساب معامل العائد الفعلي لفترة محدودة من الليوسين والجلوكوز حتى 30.5 ساعة 18.7 جم CDM (جم ليسين) −1 ، وهو أقل من القيمة من زراعة قارورة الاهتزاز وتقييم DoE. أكد هذا أيضًا استنتاجنا بشأن جرعة ناقصة من الليوسين أثناء مرحلة التغذية بالدفعة الأولى.

تم إجراء الزراعة الثانية (الشكلان 3 ب و 4 ب) بنفس الطريقة ولكن تمت زيادة تركيز الليوسين في القاعدة بنسبة 20٪ إلى 63.3 جم ليسين (L 25٪ NH3) −1. تم النظر في تركيز متوسط ​​البدء البالغ 0.5 جم ليسين L 1 وافترض الاستهلاك الأساسي البالغ 400 مل. أخيرًا ، تم استهلاك 1.5 لتر من العلف و 357 مل من محلول الليوسين / الأساسي لتشكيل 91.9 جم من مادة CDM L بتركيز نهائي منخفض قدره 0.68 جم أسيتات لتر -1 وبدون أي تراكم ليوسين.

أظهرت هذه الزراعة إستراتيجية ناجحة iHCDC. أكد تحليل HPLC أنه تم منع تراكم الليوسين والأحماض الكربونية المنخفضة. تعطي نسبة الكتلة الحيوية المشكلة إلى كتلة الليوسين المستخدمة عائدًا فعليًا قدره 18.15 جم من مادة CDM (جم ليوسين) −1 لاستراتيجية الزراعة هذه. هذه القيمة قريبة جدًا من العائد الأمثل من نموذج DoE وتشير إلى أن نهج DoE هو أداة ممتازة لتحديد هذه المعلمات.

3.4 بيان قابلية استخدام استراتيجية iHCDC من خلال إنتاج GFP من المؤتلف بكتريا قولونية

كان الدليل على مفهومنا الجديد هو إنتاج منتج جيني. تم إجراء زراعتين في ظل ظروف متطابقة تقريبًا. تم تقييم تركيز المنتج من SDS-PAGE كما هو موضح في الشكل 5. تم تحضير العينات لضمان إدخال البروتين من كمية متساوية من الكتلة الحيوية لكل ممر لتجنب التحميل الزائد. لذلك ، فإن زيادة كثافة نطاق المنتج عند 26.9 كيلو دالتون هي نتيجة لزيادة محتوى المنتج الخاص بالخلية. أثناء كثافة الخلية في مرحلة الإنتاج ، زادت آلية التنمية النظيفة وحمل المنتج الخاص بالخلية. محسوبة من الأخير ، وصلت كتلة المنتج في المزرعة إلى 6.05 جم (متوسط ​​من زراعتين) بمدى 1.10 جم. فيما يتعلق بتركيز المنتج النهائي أو كتلته ، تُظهر الزراعة إمكانية استنساخ محدودة ، على الأرجح بسبب تحليلات المنتج والقياس الكمي بواسطة SDS-PAGE.

كانت كتلة المنتج النهائية أقل بقليل من القيمة القصوى التي قد تشير إلى تدهور المنتج بواسطة البروتياز (الشكل 6). لسوء الحظ، ال بكتريا قولونية السلالة K12 ER2507 ليست ناقصة في البروتياز Lon و OmpT ، على عكس السلالات مثل BL21.

من متوسط ​​كلتا الزراعة ، استخلصنا متوسط ​​6.05 جم GFP في 438 جم CDM (المدى 3.9 جم) المقابل لـ 1.30 جم GFP L −1 (النطاق 0.22 جم / لتر). تتوافق الإنتاجية جيدًا مع الأدبيات الخاصة بسلالات الإنتاج الأخرى 18. مع بذل مزيد من الجهد لتحسين مرحلة الإنتاج فيما يتعلق بكثافة خلية الحث ، وتركيز المحرِّض ، ومعدل النمو الخاص بالخلية مدفوعًا بمعدل التغذية ، قد يزيد عائد المنتج بشكل كبير.


الاستنتاجات

في هذا العمل ، قمنا بتصميمنا وراثيًا بكتريا قولونية سلالة منتج MBE تحسن بنسبة 30.6٪ في العيار النهائي في مزارع الدُفعات. بعد ذلك ، تم تصميم وتحسين عملية التخمير الميكروبي على دفعات التغذية ، وتحقيق أقصى عائد 790.2 ± 6.9-mg MBE L −1 وإنتاجية حجمية 15.8 ± 1.1-mg MBE (L · h) −1. في ظل ظروف الزراعة هذه ، إضافة بروبيونات ، نتم إجراء - الأوكتانول وحمض الأوليك إلى وسط النمو. على الرغم من أن إضافة ركائز خارجية ليست مريحة من الناحية الاقتصادية ، فقد تم القيام بذلك للحصول على أقصى عائد من MBE. أخيرًا ، قمنا بتوسيع إنتاج MBE البكتيرية ، وطورنا طريقة تنقية ، وقاسنا الخصائص الفيزيائية والكيميائية المتعلقة بسلوكها الحراري.

DSC تيا و تCOM كشفت القيم ، بالإضافة إلى PP ، أن هذه الجزيئات تعرض نطاق عمل ممتد بدرجة أكبر في درجات حرارة منخفضة مقارنة بزيت الجوجوبا ، أي سيولة أفضل وأداء محسن في درجات الحرارة الباردة. في الوقت نفسه ، تقدم MBE T.ثور و تPK قيم قريبة من تلك المقابلة لزيت الجوجوبا ، مما يشير إلى أن خصائص الأكسدة الحرارية لكلا الزيوت قابلة للمقارنة.

تشجعنا هذه النتائج على زيادة توصيف زيت MBE من خلال تحديدات الخصائص الفيزيائية والكيميائية الشاملة ، مثل قياس مؤشر اللزوجة ومعامل الانكسار. سيعطينا هذا فكرة أكثر دقة حول تطبيقات MBE الملموسة ، بالإضافة إلى توليد فهم أكثر وضوحًا للمبادئ التي تكمن وراء العلاقة بين التركيب الكيميائي والاستخدامات الصناعية المحتملة للمواد الكيميائية الزيتية. أخيرًا ، نظرًا للتنوع الملحوظ لمركبات MBE التي يمكن تصنيعها في الجسم الحي ، فمن المحتمل أن ينتج عن نهج الهندسة الميكروبية المماثلة جودة عالية أو استرات "مختارة" من الهياكل المصممة المناسبة لتطبيقات محددة أو محددة.


مراجع

Schirmer، A.، Rude، MA، Li، X.، Popova، E. & amp del Cardayre، S.B. التخليق الحيوي الميكروبي للألكانات. علم 329, 559–562 (2010).

جرونينبيرج ، إل.إس. ، مارششي ، آر جيه. & amp Liao، J.C. هندسة الوقود الحيوي من الجيل التالي في بدائيات النوى. بالعملة. رأي. تشيم. بيول. 17, 462–471 (2013).

Woolston ، BM ، Edgar ، S. & amp Stephanopoulos ، G. الهندسة الأيضية: الماضي والمستقبل. Annu. القس كيم. بيومول. م. 4, 259–288 (2013).

Paddon، CJ & amp Keasling، J.D. مادة الأرتيميسينين شبه الاصطناعية: نموذج لاستخدام البيولوجيا التركيبية في التطوير الصيدلاني. نات. القس ميكروبيول. 12, 355–367 (2014).

كيم ، إي ، مور ، بي إس. & amp Yoon، Y.J. إعادة تنشيط التخليق الحيوي التجميعي للمنتج الطبيعي مع البيولوجيا التركيبية. نات. تشيم. بيول. 11, 649–659 (2015).

نيلسن ، جيه وآخرون. التآزر الهندسي في التكنولوجيا الحيوية. نات. تشيم. بيول. 10, 319–322 (2014).

نا ، د. وآخرون. هندسة التمثيل الغذائي الإشريكية القولونية باستخدام الحمض النووي الريبي التنظيمية الصغيرة الاصطناعية. نات. التكنولوجيا الحيوية. 31, 170–174 (2013).

ليدستروم ، M.E. & amp Konopka ، M. دور عدم التجانس الفسيولوجي في سلوك السكان الميكروبيين. نات. تشيم. بيول. 6, 705–712 (2010).

Müller ، S. ، Harms ، H. & amp Bley ، T. أصل وتحليل التباين الميكروبي في العمليات الحيوية. بالعملة. رأي. التكنولوجيا الحيوية. 21, 100–113 (2010).

تانيجوتشي ، واي وآخرون. التحديد بكتريا قولونية بروتيني و transcriptome مع حساسية أحادية الجزيء في الخلايا المفردة. علم 329, 533–538 (2010).

لي ، ج. & amp Xie و X.S. العقيدة المركزية على مستوى الجزيء المفرد في الخلايا الحية. طبيعة سجية 475, 308–315 (2011).

Guimaraes ، JC ، Rocha ، M. & amp Arkin ، A.P. مستوى النسخ ومحددات التسلسل لوفرة البروتين والضوضاء في الإشريكية القولونية. الدقة الأحماض النووية. 42, 4791–4799 (2014).

Zenobi، R. عمليات الأيض أحادية الخلية: منظورات تحليلية وبيولوجية. علم 342, 1243259 (2013).

Paige، J.S.، Nguyen-Duc، T.، Song، W. & amp Jaffrey، S.R. التصوير الفلوري للمستقلبات الخلوية مع الحمض النووي الريبي. علم 335, 1194 (2012).

Love ، K.R. ، Panagiotou ، V. ، Jiang ، B. ، Stadheim ، T.A. & amp الحب ، جي سي يظهر التحليل أحادي الخلية المتكامل بيتشيا باستوريس يفرز البروتين عشوائيا. التكنولوجيا الحيوية. بيونج. 106, 319–325 (2010).

Mustafi، N.، Grünberger، A.، Kohlheyer، D.، Bott، M. & amp Frunzke، J. تطوير وتطبيق مستشعر حيوي أحادي الخلية للكشف عن الأحماض الأمينية L -methionine والمتفرعة السلسلة. متعب. م. 14, 449–457 (2012).

Labhsetwar، P.، Cole، J.A.، Roberts، E.، Price، ND & amp Luthey-Schulten، Z.A. عدم التجانس في التعبير البروتيني يؤدي إلى التباين الأيضي في نموذج الإشريكية القولونية تعداد السكان. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 110, 14006–14011 (2013).

Delvigne، F.، Zune، Q.، Lara، A.R.، Al-Soud، W. & amp Sørensen، S.J. التباين الأيضي في المعالجة الحيوية: آثار عدم التجانس الظاهري الميكروبي. اتجاهات التكنولوجيا الحيوية. 32, 608–616 (2014).

Lu، X.، Vora، H. & amp Khosla، C. الإفراط في إنتاج الأحماض الدهنية الحرة في بكتريا قولونية: الآثار المترتبة على إنتاج وقود الديزل الحيوي. متعب. م. 10, 333–339 (2008).

شو ، بي وآخرون. التحسين المعياري للمسارات متعددة الجينات لإنتاج الأحماض الدهنية في بكتريا قولونية. نات. كومون. 4, 1409 (2013).

بلازيك ، جيه وآخرون. تسخير يارويا ليبوليتيكا تكوين الدهون لإنشاء منصة لإنتاج الدهون والوقود الحيوي. نات. كومون. 5, 3131 (2014).

Zhang، F.، Carothers، J.M. & amp Keasling، J.D. تصميم نظام مستشعر ديناميكي لإنتاج المواد الكيميائية والوقود المشتق من الأحماض الدهنية. نات. التكنولوجيا الحيوية. 30, 354–359 (2012).

لورانس ، إم إس ، فيليبس ، ك. & أمبير ليو ، د. يمكن أن تمنح البروتينات فائقة الشحن مرونة غير عادية. جيه. تشيم. شركة 129, 10110–10112 (2007).

Lütke-Eversloh ، T. ، Santos ، C.N. & amp Stephanopoulos ، G. وجهات نظر الإنتاج التكنولوجي الحيوي من L-tyrosine وتطبيقاته. تطبيق ميكروبيول. التكنولوجيا الحيوية. 77, 751–762 (2007).

بيتارد ، ج. ، كاماكاريس ، هـ. & أمبير يانغ ، جي. The TyrR regulon. مول. ميكروبيول. 55, 16–26 (2005).

ليو ، دي ، شياو ، واي ، إيفانز ، بي إس. & amp Zhang، F. تنظيم التغذية الراجعة السلبية لإنتاج الأحماض الدهنية على أساس مشغل حساس malonyl-CoA. موالفة ACS. بيول. 4, 132–140 (2015).

Doroshenko، V. et al. YddG من الإشريكية القولونية يروج لتصدير الأحماض الأمينية العطرية. FEMS ميكروبيول. بادئة رسالة. 275, 312–318 (2007).

Chou، H.H. & amp Keasling، J.D. برمجة التحكم التكيفي لتطوير زيادة إنتاج الأيض. نات. كومون. 4, 2595 (2013).

كونراد ، ت. وآخرون. تم العثور على طفرات بوليميريز الحمض النووي الريبي من خلال إعادة برمجة التطور التكيفي الإشريكية القولونية لتحقيق النمو الأمثل في الحد الأدنى من الوسائط. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 107, 20500–20505 (2010).

Nakata ، K. ، Koh ، M.M. ، Tsuchido ، T. & amp Matsumura ، Y. جميع الطفرات الجينومية في متحولة مقاومة الفاعل بالسطح المضادة للميكروبات ، الإشريكية القولونية OW66, are involved in cell resistance to surfactant. تطبيق ميكروبيول. التكنولوجيا الحيوية. 87, 1895–1905 (2010).

Foster, P.L. Stress-induced mutagenesis in bacteria. كريت. القس Biochem. مول. بيول. 42, 373–397 (2007).

Dietrich, J.A., Shis, D.L., Alikhani, A. & Keasling, J.D. Transcription factor-based screens and synthetic selections for microbial small-molecule biosynthesis. ACS Synth. بيول. 2, 47–58 (2013).

Raman, S., Rogers, J.K., Taylor, N.D. & Church, G.M. Evolution-guided optimization of biosynthetic pathways. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 111, 17803–17808 (2014).

Veening, J.W., Smits, W.K. & Kuipers, O.P. Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. القس ميكروبيول. 62, 193–210 (2008).

Jablonka, E. & Raz, G. Transgenerational epigenetic inheritance: prevalence, mechanisms, and implications for the study of heredity and evolution. س: القس بيول. 84, 131–176 (2009).

Kiviet, D.J. وآخرون. Stochasticity of metabolism and growth at the single-cell level. طبيعة سجية 514, 376–379 (2014).

Keasling, J.D. Manufacturing molecules through metabolic engineering. علم 330, 1355–1358 (2010).

Tanaka, A. & Nakajima, H. Application of immobilized growing cells. حال. بيوتشيم. م. التكنولوجيا الحيوية. 42, 97–131 (1990).

Barber, W.P. & Stuckey, D.C. The use of the anaerobic baffled reactor (ABR) for wastewater treatment: a review. Water Res. 33, 1559–1578 (1999).

Dahl, R.H. et al. Engineering dynamic pathway regulation using stress-response promoters. نات. التكنولوجيا الحيوية. 31, 1039–1046 (2013).

Zhang, F. & Keasling, J. Biosensors and their applications in microbial metabolic engineering. اتجاهات ميكروبيول. 19, 323–329 (2011).

Fernandes, R.L. et al. Experimental methods and modeling techniques for description of cell population heterogeneity. التكنولوجيا الحيوية. حال. 29, 575–599 (2011).

van Heerden, J.H. وآخرون. Lost in transition: start-up of glycolysis yields subpopulations of nongrowing cells. علم 343, 1245114 (2014).

Wang, B.L. وآخرون. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. نات. التكنولوجيا الحيوية. 32, 473–478 (2014).

Levine, E. & Hwa, T. Stochastic fluctuations in metabolic pathways. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 104, 9224–9229 (2007).

Oyarzún, D.A., Lugagne, J.B. & Stan, G.B. Noise propagation in synthetic gene circuits for metabolic control. ACS Synth. بيول. 4, 116–125 (2015).

Lee, T.S. وآخرون. BglBrick vectors and datasheets: a synthetic biology platform for gene expression. J. بيول. م. 5, 12 (2011).

Engler, C., Kandzia, R. & Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. بلوس واحد 3, e3647 (2008).

Kempe, K., Hsu, F.F., Bohrer, A. & Turk, J. Isotope dilution mass spectrometric measurements indicate that arachidonylethanolamide, the proposed endogenous ligand of the cannabinoid receptor, accumulates in rat brain tissue post mortem but is contained at low levels in or is absent from fresh tissue. J. بيول. تشيم. 271, 17287–17295 (1996).

Juminaga, D. et al. Modular engineering of L -tyrosine production in الإشريكية القولونية. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 78, 89–98 (2012).


Solving the Puzzle of Cell Culture Optimization

Manufacturing engineers formerly used complex media from animal-derived products, but the burgeoning, modern-day industry is quickly adopting chemically defined media wherever possible. [JVisentin/Getty Images]

Biologics have transformed the therapeutic landscape. Twenty years ago, the pharmaceutical industry could hardly have envisioned the growth and broad impact that biologics would have today, according to Kendra Hightower, Ph.D., senior study director at Metabolon: “Now, they’re not just part of the therapeutic landscape—they’ve become key defining components of most pharmaceutical pipelines.”

While reducing costs, increasing production, and meeting regulatory requirements have always driven biopharma to greater heights, the complexity of manufacturing biologically produced molecules has made these demands more mountainous than ever. “A bioprocess is a puzzle,” explained Dr. Hightower, “and this puzzle has thousands and thousands of pieces, and those pieces need to fit together correctly to make the final picture. If you change those pieces, either intentionally or unintentionally, that could alter the final picture.”

Assessing the activity of a living system using metabolomics requires robust, high-throughput analytical systems that can accurately identify metabolites, a comprehensive understanding of biochemical pathways, and expertise in analytics and biochemistry to successfully interpret and apply the results. [ReptileB488/Getty Images] In late August 2017, leaders in the bioprocessing industry gathered in Boston, MA, at Cambridge HealthTech Institute’s Bioprocessing Summit conference to discuss cost-effective strategies to ensure a picture-perfect product every time.S

Searching for Hidden Elements with Metabolomics

At the conference, Dr. Hightower illustrated how biopharmaceutical manufacturers can use a metabolomics approach to gain insight into the “active biology” of a bioprocess that can help minimize process variability. Dr. Hightower’s company, Metabolon, has specialized in metabolic profiling since 2000, and both Metabolon’s vast chemical reference library and their multiple points of matching strategy for metabolite identification enable highly accurate and comprehensive metabolite measurements.

Metabolomics expands on traditional methods that use 10 to 20 indicative biochemical molecules, like oxygen, carbon dioxide, and glucose, to track cell metabolism, growth, and productivity. While these metabolites “happen to be really useful,” said Kirk Beebe, Ph.D., senior director at Metabolon, “there are hidden elements of active biology where a precision metabolomics approach could add to the lactates, ammonias, and amino acid profiling that people currently do.”

These “hidden elements” can provide valuable knowledge about cell health and protein production. For example, glutathione can relay information about oxidative stress levels and the redox capacity of the cells—an important metric for recombinant protein production, which relies on redox potential for disulfide bond formation, proper protein folding, and protein secretion.

Assessing the activity of a living system using metabolomics requires robust, high-throughput analytical systems that can accurately identify metabolites, a comprehensive understanding of biochemical pathways, and expertise in analytics and biochemistry to successfully interpret and apply the results. However, the reduction in cost and time-to-consumer achieved by applying an extensive metabolomics approach to bioprocess development and monitoring makes these challenges worth overcoming.

While Metabolon builds understanding around the integral role different pieces play in creating a reliable process, companies such as Merck, Valitacell, Cell Culture Company (C3), and Roche have focused their efforts on the pieces themselves, with their respective work on media development, cell-line selection, bioreactor design, and continuous process monitoring.

Metabolomics can assess factors that influence the active biology of the cells in the bioprocess such as genetics, operational environments, and nutritional requirements. Metabolon’s technology provides a broad, informative assessment of biochemical space (i.e., active biology), expanding the avenues for optimizing production systems beyond conventional technologies.

Finding the Perfect (Cell Culture Media) Recipe through Systems Biology

Wai Lam Ling, Ph.D., Merck’s senior principal scientist and group leader of biologics upstream process and media development, provided GEN with an analogy that compared motorcycles to small-molecule drugs and jet planes to biologic therapies: like biologics, jet planes are complex to design and manufacture. Thus, to get their products off the ground, biomanufacturers need to select the right components—starting with cell culture media—to create a robust, reliable process from production cell lines.

Manufacturing engineers formerly used complex media from animal-derived products, but the burgeoning, modern-day industry is quickly adopting chemically defined media wherever possible. In contrast to complex media, chemically-defined media consists of individual, known components and is devoid of animal-derived materials and hydrolysates, which removes much of the mystery and variability inherent in complex media. However, with anywhere from 50 to 100 different components to balance, finding the perfect recipe for chemically defined media is still an industry headache.

Even well-planned design-of-experiment methodologies for media development can be both time- and resource-consuming. By using a systems biology approach that leverages the tools used in drug discovery, such as next-generation sequencing, shotgun proteomics, and metabolite profiling, Dr. Ling and her team can visualize how changing the selection, concentration, and chronology of different components affects cell productivity and product quality. Integrating the data with other important product attribute measurements, like glycosylation, allows the team to generate predictive models for media optimization and reduce the time and money spent finding the perfect formulation to complement their bioprocesses.

Identifying Clonal Instability Culprits through ChemStress Fingerprinting

While tailoring the media to the process can mitigate cellular stress caused by a bioreactor environment, starting out with a robust, stable cell line is essential to a successful process. Nutrient starvation, oxidative stress, toxicity, unfriendly pH or osmolarity levels, and other stressors can cause clonal instability, where productive cell lines become unproductive or produce errant proteins that require extensive purification.

To suss out instability, biopharmaceutical manufacturers often use subculturing studies that assess cell productivity over multiple (60 to 160) generations. However, these studies are both time- and resource-intensive, and, according to Terry McWade, CEO at Valitacell, they’re not always effective: “High numbers of cells are being brought to the last stage [of development], and then companies are finding that many of those cells are actually not stable.”

In 2014, Valitacell founders McWade and Jerry Clifford asked themselves if they could recreate the bioreactor environment by coating a 96-well plate with small-molecule chemicals that mimic different stressors, prompting the development of Valitacell’s latest product: ChemStress Fingerprinting.

Combined with a software platform that plots growth and product titer for each chemical challenge, ChemStress produces a fingerprint unique to the cell clone and culture media combination tested. Scientists can use changes in the fingerprint to detect clonal instability (Valita™STABILITY), as well as batch-to-batch variation in culture media (Valita™QC).

“The key exciting part of the [ChemStress] technology,” said McWade, “is the ability to determine much, much more quickly which cells are likely to be unstable.” While conventional subculturing studies can take 60 to 160 days, ChemStress Fingerprinting can detect clonal instability in 24 days.

Decreasing the time and money spent on cell line development can relieve some of the economic pressure biopharmaceutical companies face as newer, more targeted therapies emerge, requiring more projects, faster development, and more efficient processes. Not only has this pressure prompted innovative new solutions, but it has also provided incentive for manufacturers to re-evaluate established technologies. Some companies are even designing media specifically for continuous biomanufacturing operations.

Valitacell’s ChemStress technology can recreate the stressors experienced by cells in a bioreactor that can lead to clonal instability. After a three-day culture on the plate, cell growth and product titer are measured and plotted against the chemical challenge to produce a fingerprint unique to the cell clone and culture media combination. Changes in the fingerprint over time can be used to predict clonal instability.

Perfusion Hollow-Fiber Bioreactors: An Old Trick for New Processes

Patented in 1974 by Kruznak et al., perfusion hollow-fiber bioreactors (PHFB) consist of bundles of thousands of hollow fibers constructed from semipermeable membranes and enclosed in a cylindrical cartridge. Similar to capillaries within the body, the porous membrane structure of the fibers allows oxygen and nutrient transport to cells immobilized on the exterior of the fibers and removal of waste products. The fiber bundles also increase the surface area available for cell growth considerably, which promotes a higher, more tissue-like density (

108–9 cells/mL) than fed-batch bioreactors (

One of the greatest advantages of PHFBs, however, is the ability to maintain cells in culture for several months at a time. Scott Waniger, vice president of bioprocessing at C3, remarked, “biotechnology has kind of been lagging behind the rest of the industrial world when it comes to continuous manufacturing.” PHFBs could make a significant contribution to closing this gap, especially compared to the 14 – 21-day runs typical of fed-batch reactors. Continuous manufacturing strategies can significantly reduce costs, enabling the production of “difficult-to-express” proteins that fall below the standard production rate of 1 to 10 g/L, making them too costly to produce using conventional methods.

C3, a contract development and manufacturing organization (CDMO), has used perfusion technology since 1981. Their largest bioreactor, the Acusyst (automated cell culture system) Xcellerator, runs 20 single-use hollow-fiber cartridges in parallel to accommodate a 1,600-L volume. The refrigerator-sized bioreactor is modular and can be scaled out by adding more units to increase the volume for large-scale production. In addition to providing a linearly scalable system, the design also eliminates the need for seed trains, which can increase time to production and requires additional bioreactors to gradually grow the culture before inoculating the final full-capacity production tank.

Continuous Process Monitoring with a Virtual Sensor

Designing a successful process to produce a particular biologic depends not only on fitting together the right cell culture media, cell line, and bioreactor, but also on careful control and monitoring of the system.

One of the most relevant parameters used for bioprocess control and monitoring is cell growth. These measurements are typically obtained through manual sampling and off-line cell count or optical density measurements during cultivation. However, Wolfgang Paul, Ph.D., senior scientist and group leader at Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics, is developing a new approach to allow continuous monitoring of cell growth without manual sampling or the addition of bulky hardware.

The method involves a soft sensor, also referred to as a virtual sensor, that can calculate cell growth based on data already collected: oxygen input, carbon dioxide output, heating and cooling units, pH value, base addition, and agitation speed. The soft sensor uses multiple linear regression and artificial neural network models to relate these data to cell growth.

Loosely modeled after neural networks in the brain, artificial neural networks use interconnected nodes that imitate neurons to pass along information. According to Dr. Paul, the various nonlinear fitting abilities make this machine-learning approach a promising model for generating the type of accurate estimations needed for their application.

“We initiated the development of the soft sensor on small-scale bioreactors, because there are many vessels (mostly single-use bioreactors) in use with no space for additional hardware sensors,” said Dr. Paul. While their initial studies focused on smaller 250-L bioreactors, the soft sensor should, in theory, function independently of bioreactor size.

According to Dr. Paul the benefits of a non-invasive, continuous monitoring system that can reduce the need for manual sampling are “very prominent for the small-scale bioreactors,” which play an increasingly important role in process development and characterization for manufacturing large-molecule therapeutics.

Biologics have transformed the therapeutic landscape, and they continue to do so as the emergence of targeted and personalized therapies require even more innovation from the biomanufacturing industry. Manufacturers will need more flexible processes that can deliver consistent, high-quality products in less time and at lower cost than ever before to accommodate the growing needs of the industry and ensure process reliability.


This work was partially carried out in the Biotechnology Core Laboratory, NIH/NIDDK. We would like to thank Prof. Dr. Joseph Shiloach for his kind assistance. We also would like to thank the NIH Fellows Editorial Board (FEB) for editorial assistance.

AOX, alcohol oxidase DO, dissolved oxygen FDH, formate dehydrogenase FLD, formaldehyde dehydrogenase OD600, optical cell density at 600 nm صNPG, ص-nitrophenyl -β-D-glucopyranoside YPD, yeast extract peptone dextrose.


High cell density cultivation of the chemolithoautotrophic bacterium Nitrosomonas europaea

Nitrosomonas europaea is a chemolithoautotrophic nitrifier, a gram-negative bacterium that can obtain all energy required for growth from the oxidation of ammonia to nitrite, and this may be beneficial for various biotechnological and environmental applications. However, compared to other bacteria, growth of ammonia oxidizing bacteria is very slow. A prerequisite to produce high cell density N. europaea cultures is to minimize the concentrations of inhibitory metabolic by-products. During growth on ammonia nitrite accumulates, as a consequence, N. europaea cannot grow to high cell concentrations under conventional batch conditions. Here, we show that single-vessel dialysis membrane bioreactors can be used to obtain substantially increased N. europaea biomasses and substantially reduced nitrite levels in media initially containing high amounts of the substrate. Dialysis membrane bioreactor fermentations were run in batch as well as in continuous mode. Growth was monitored with cell concentration determinations, by assessing dry cell mass and by monitoring ammonium consumption as well as nitrite formation. In addition, metabolic activity was probed with in vivo acridine orange staining. Under continuous substrate feed, the maximal cell concentration (2.79 × 10 12 /L) and maximal dry cell mass (0.895 g/L) achieved more than doubled the highest values reported for N. europaea cultivations to date.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


شاهد الفيديو: Biomolecules Updated (كانون الثاني 2022).