معلومة

هل exosomes مفيدة كآلية تعداء أو آلية توصيل في تحرير الجينات؟


إن استخدام الفيروسات كعوامل تعداء أو توصيل لتحرير الجينات (CRISPR / cas9 ، إلخ) معروف جيدًا. ومع ذلك ، فإن إحدى مشكلات استخدام الفيروسات لإيصال الحمض النووي إلى الخلايا هي إمكانية إثارة استجابة مناعية معاكسة.

تستخدم الخلايا بالفعل exosomes لنقل البضائع المختلفة داخل وخارج الخلايا. هل تجعل هذه الخاصية exosomes مرشحين مثاليين لتسليم شحنة تحرير الجينات أيضًا؟

أيضًا ، هل هناك أي أمثلة أو دراسات معروفة تتضمن إعادة استخدام exosomes لتعديل الجينات؟ على وجه التحديد لتطبيقات CRISPER / cas9؟


توصيل الحمض النووي الريبي والحمض النووي بوساطة إكسوسوم إلى الخلايا المقاومة للترنسفكأيشن

أطقم المكوك EV
العمل مع الخلايا التي يصعب نقل العدوى؟ تستفيد مجموعة أدوات المكوك EV من القدرة الطبيعية للإكسوسومات ليتم استيعابها وتقديم جزيئات حيوية نشطة وظيفيًا مثل الأحماض النووية إلى الخلايا المتلقية. يمكن نقل exosomes الجاهزة للاستخدام المستمدة من خلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK 293) أو الخلايا التغصنية الفأرية (JAWS) باستخدام الأحماض النووية بما في ذلك siRNA و miRNAs و mRNAs بالإضافة إلى DNA البلازميد وإضافتها إلى مجموعة متنوعة من الصعب الوصول إليها. نقل الخلايا لتحسين التسليم الوظيفي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه التقنية لإنشاء خطوط خلوية مستقرة والتي تكون مفيدة بشكل خاص للخلايا المقاومة للترنسفكأيشن باستخدام نظام الترانسبوزون piggyBac. تقدم مكوكات EV أيضًا ميزة كبيرة على منهجية النقل المعتمد على الفيروسات لأنها غير فيروسية وسهلة التعامل وطريقة فعالة من حيث التكلفة لتوصيل الحمض النووي الريبي والحمض النووي إلى الخلايا المستهدفة.

بروتوكول تحميل مكوك exosome سهل

تحتوي مجموعات مكوك EV على عامل نقل جديد للحمض النووي (Exo-Fect) يتيح نقل الأحماض النووية مباشرة إلى exosomes المعزولة. يمكن بعد ذلك نقل جزيئات si / miRNA و mRNA وحتى DNA البلازميد المنقولة إلى الخلايا المستهدفة عبر حويصلات exosome المنقولة. ما عليك سوى الجمع بين exosomes المعزولة المتوفرة في المجموعة مع Exo-Fect (cat # EXFT10A-1-SBI) والحمض النووي الذي تختاره لتوليد مركبات توصيل exosome. تأتي المجموعات مع جميع الكواشف التي تحتاجها لتحميل الأحماض النووية في الإكسوسومات وتركيزها لتسليمها إلى الخلايا المستهدفة. يستغرق البروتوكول أقل من ساعة وهو فعال للغاية في تحميل الأحماض النووية في exosomes للنقل والتسليم.

بيانات تسليم المركبة الكهربائية
تنقل مكوكات الفأرة والمركبات الكهربائية البشرية بكفاءة سيرنا إلى الخلايا التي يصعب نقلها. تم إصابة exo-Fected Exosomes للخلايا الشجرية للماوس JAWS II باستخدام 100 pmol Texas-Red مترافق من siRNA (عنصر تحكم غير مستهدف متضمن في المجموعات). ثم تمت إضافة مكوكات EV المحملة بـ siRNA إلى خلايا البلاعم وحيدة الفأر الساذجة (RAWS 264.7) في الثقافة. تم تصوير الخلايا بعد 18 ساعة ولوحظ التسليم في أقرب وقت بعد 4 ساعات من إضافة مكوكات EV. أكثر من 80 ٪ من خلايا RAWS 264.7 المستقبلة استوعبت حمولة المكوك EV siRNA (الألواح اليسرى السفلية الموجودة على اليسار). تمت معالجة مكوكات Human HEK 293 EV باستخدام مجموعة Exo-Green الخاصة بـ SBI (القط # EXOG200A-1-SBI) والتي تصف البروتينات الخارجية الخارجية باللون الأخضر الفلوري. تمت إضافة مكوكات Human EV بعد ذلك إلى الخلايا الجذعية الجنينية للماوس وتم تصويرها لتسليم البضائع بعد 18 ساعة. كانت المكوكات البشرية EV جيدة التحمل وتم تناول المركبات الكهربائية بكفاءة بواسطة الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (مجموعة الألواح اليمنى السفلية اليسرى).


كيف تقارن مكوكات EV مع Lipfectamine® Transfection؟
تمت مقارنة بروتوكولات تعداء Lipofectamine® 2000 القياسية أيضًا مع مكوكات Human EV على خلايا RAWS 264.7 باستخدام نفس الكمية بالضبط من siRNA المسمى Texas-Red (100 pmol ، انظر بيانات المقارنة أدناه). تعد مكوكات EV أكثر كفاءة في تحويل siRNA إلى خلايا مقاومة تعداء في الثقافة.


تسليم سيرنا وظيفي EV
يمكن للمكوكات البشرية EV أن تقضي على جينات الفأر. تم تحميل مكوكات الإنسان HEK 293 EV إما بمضاد CD81 siRNA أو سيرنا غير مستهدف (NT) ثم تمت إضافته إلى خلايا Mouse RAWS 264.7. تم جمع المحللة الخلوية بعد 18 ساعة لتحليل اللطخة الغربية لضربة قاضية لبروتين CD81. يظهر على اليسار ، مكوكات Human EV التي تحمل المضاد لـ CD81 siRNA كانت قادرة على ضرب التعبير عن مستويات بروتين CD81 للخلية المستهدفة بنسبة 50٪ على الأقل عند مقارنتها بعنصر تحكم siRNA غير المستهدف (NT). تم قياس بيانات الصورة الغربية ورسمها في اللوحة المجاورة على اليمين.

اصنع خطوط خلايا مستقرة باستخدام مكوكات EV و piggyBac
إن transposon piggyBac (PB) هو عنصر وراثي متحرك ينتقل بكفاءة بين النواقل والكروموسومات عبر آلية "القص واللصق". أثناء التحويل ، يتعرف Super PB transposase على تسلسلات التكرار الطرفية المقلوبة الخاصة باللينقول (ITRs) الموجودة على طرفي ناقل الترانسبوزون وينقل المحتويات من المواقع الأصلية ويدمجها بكفاءة في مواقع الكروموسومات TTAA.

تم استخدام بلازميد تعبير Super PB transposase (5 ميكروغرام) و 5 ميكروغرام من علامات ترميز ناقل الترانزستور PB713B-1 PB لـ GFP وجين مقاومة Puromycin لمقارنة كفاءة التحويل باستخدام إما طرق Lipofectamine القياسية أو مكوكات HEK293 EV. بعد 72 ساعة من المعالجة المكوكية بعد EV ، بدأ اختيار البوروميسين عند 2 ميكروغرام / مل ثم زيادته إلى 5 ميكروغرام / مل لمدة 3 أيام أخرى. تم تصوير خلايا HEK293 المنقولة بوساطة المكوك EV (اللوحة العلوية) ومقارنتها بالخلايا التي تم نقلها مع نفس البلازميدات PB (اللوحة السفلية). كان تسليم ناقلات piggyBac بواسطة مكوكات EV أقل سمية من تعداء ، وكفاءة عالية في تكامل كروموسوم مضيف PB transposon ، وأدى إلى ما يقرب من 5 أضعاف المستعمرات.

Peterson MF ، Otoc N ، Sethi JK ، Gupta A ، Antes TJ. أنظمة متكاملة لفحص الجسيمات الخارجية. أساليب. 2015 أبريل 24. pii: S1046-2023 (15) 00161-9.

ماركوس لي ، ليونارد ج. FedExosomes: الجسيمات النانوية البيولوجية العلاجية الهندسية التي توفر حقًا. الأدوية (بازل). 20136 (5): 659-80.

Zomer A و Vendrig T و Hopmans ES و van Eijndhoven M و Middeldorp JM و Pegtel DM. Exosomes: يصلح لتوصيل الحمض النووي الريبي الصغير. Commun Integr Biol. 2010 3 سبتمبر (5): 447-50.

Pegtel DM ، Cosmopoulos K ، Thorley-Lawson DA ، van Eijndhoven MA ، Hopmans ES ، Lindenberg JL ، de Gruijl TD ، Wurdinger T ، Middeldorp JM. التوصيل الوظيفي لل miRNAs الفيروسية عبر exosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 أبريل 6107 (14): 6328-33.

Momen-Heravi F ، Bala S ، Bukong T ، Szabo G. التسليم بوساطة Exosome لمثبط miRNA-155 النشط وظيفيًا إلى الضامة. طب النانو. 2014 29 مارس pii: S1549-9634 (14) 00132-4.
روابط ذات علاقة


كيف تم التعرف على exosomes لأول مرة ككيانات متميزة؟

تم التعرف على وجود الحويصلات الغشائية خارج الخلايا لأول مرة منذ 50 عامًا ، على الرغم من أنه كان يُفترض في الأصل أنها نفايات تم إطلاقها عبر سفك غشاء البلازما. لم يأتِ التعرف على ما نسميه الآن exosomes حتى عام 1983 ، من الدراسات التي أجريت على فقدان الترانسفيرين أثناء نضوج الخلايا الشبكية إلى كريات الدم الحمراء [1]. أظهرت هذه الدراسات ، باتباع اتحادات الترانسفيرين والذهب من خلال النظام الداخلي ، أن ILVs المتولدة في MVBs يمكن إطلاقها إلى الفضاء خارج الخلية من خلال الاندماج مع غشاء البلازما [2] ، على الرغم من أنه لم يكن مصطلح "exosome" موجودًا حتى عام 1987 صاغ لهم [3].

حتى في ذلك الوقت ، ومع ذلك ، تم تجاهل هذه الحويصلات خارج الخلية أو نسيانها إلى حد كبير أو ، مرة أخرى ، تم رفضها باعتبارها وسيلة للتخلص من النفايات الخلوية. في العقد الماضي فقط ، انتشر الاهتمام بالإكسوسومات ، مع زيادة ما يقرب من عشرة أضعاف في المنشورات في سنوات عديدة (115 في عام 2006 ، و 1010 في عام 2015).


المواد والأساليب

تنقية ووضع العلامات على Exosome

تم الحصول على عينات الدم البشري المحيطي من مرضى الرجفان غير الأذيني في النظام الصحي بجامعة يونسي (سيول ، كوريا). يتوافق بروتوكول الدراسة مع المبادئ الموضحة في إعلان هلسنكي ، وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية (YUMC 4-2011-0872). تم الحصول على الموافقة المسبقة من جميع المرضى. فيما يلي اسم لجنة الأخلاقيات: مستشفى سيفيرانس.

تمت تنقية Exosomes باستخدام ExoQuick exosome kit (SBI System Bioscience ، Mountain View ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم خلط حجم 250 ميكرولتر من المصل البشري مع 63 ميكرولتر من محلول ExoQuick وحضنت طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي (1500ز لمدة 30 دقيقة) ، تم التخلص من المادة الطافية وتم طرد الأنابيب مرة أخرى (1500ز لمدة 5 دقائق). تم استنشاق جميع آثار السوائل ، ثم تم إعادة تعليق الكريات في محلول ملحي مخزّن بالفوسفات 200 ميكرولتر (PBS) [22].

بعد العلاج الخارجي للخلايا ، تم تقييم امتصاص exosomes بواسطة خلايا HEK 293 المستزرعة (خلايا الكلى البشرية) وخلايا H9C2 (خلايا عضلة القلب للجرذان) باستخدام مجهر متحد البؤر (LSM710 Carl Zeiss GmbH ، Jena ، ألمانيا). بالنسبة لهذا التقييم ، تم تصنيف exosomes المنقى باستخدام صبغة PKH26 (Sigma ، ألمانيا) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة ، كما هو موضح سابقًا [23]. باختصار ، تم تعليق exosomes في 1 مل مادة مخففة C تحتوي على 5 ميكرومتر من PKH26 وحضنت لمدة 5 دقائق. تم إيقاف إجراء وضع العلامات عن طريق الحضانة لمدة دقيقة واحدة بحجم متساوٍ من 1٪ ألبومين مصل بقري (بوفوجين ، ملبورن ، أستراليا). تم غسل exosomes مرتين باستخدام Amicon ultrafilter (قطع 10 KDa ، Millipore ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام PBS بارد. بعد ذلك ، تم تعليق exosomes في 200 ميكرولتر PBS.

خليط من exosomes و CaCl2

لتوصيل exosomes بكفاءة إلى الخلايا ، طريقة معدلة لـ CaCl2 تم تطوير تعداء. تم خلط exosomes المسمى PKH26 (50 ميكروغرام في PBS) مع CaCl2 محلول (0.2 م مخزون). تم تعديل الحجم النهائي إلى 150 ميكرولتر باستخدام برنامج تلفزيوني معقم. تم تحضين الخليط عند 37 درجة مئوية في شاكر لمدة 10 دقائق عند 25 دورة في الدقيقة ، ثم تم وضع الأنبوب على الفور على الجليد. تمت إضافة كاشف ExoQuick (30 ميكرولتر) ، وتم وضع الخليط على الجليد لمدة 30 دقيقة. تم الطرد المركزي للعينة لمدة 3 دقائق عند 13000 - 14000 دورة في الدقيقة في ميكروفوج. تمت إزالة المادة الطافية ، وأعيد تعليق حبيبات الخليط في 1 مل PBS. تم غسل الحبيبات باستخدام أنابيب Amicon Ultra مع PBS بارد. بعد ذلك ، تم تعليق exosomes في 200 ميكرولتر PBS.

تحليل لطخة غربية

تم إجراء تحليل لطخة غربية كما وصفنا سابقًا [16]. باختصار ، تم تحلل الكريات الخارجية فائقة الطرد المركزي باستخدام محلول ترسيب مناعي إشعاعي (ATTO ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) يحتوي على كوكتيل مثبط للبروتياز (ATTO). تم تحديد الكمية الإجمالية للبروتين باستخدام مقايسة بروتين 660 نانومتر (بيرس ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم حل كميات متساوية (20 ميكروغرام) من البروتينات الخارجية باستخدام دوديسيل كبريتات الصوديوم-بولي أكريلاميد الكهربائي ونقلها إلى أغشية بولي فينيلدين ديفلوريد. تم فحص البقع طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام Anti-Lamp2 (SC-18822 Santa Cruz Biotechnology ، سانتا كروز ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، أو anti-CD81 (SC-166029 ، Santa Cruz Biotechnology) ، أو مضاد Alix (SC-99010 ، سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية) ، كما هو محدد. تم بعد ذلك تعريض الأغشية إلى أجسام مضادة ثانوية مضادة للفأر مترافق مع الفجل الفجل بيروكسيديز (Santa Cruz Biotechnology) ، وتم تصور النتائج باستخدام اللمعان الكيميائي (Advansta ، مينلو بارك ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

المجهر الإلكتروني للإرسال

تم وضع شبكة مجهر إلكتروني مطلية بالكربون من Formvar مع وجود جانب formvar لأسفل أعلى انخفاض خارجي لمدة دقيقة واحدة تقريبًا. تمت إزالة الشبكة ، ومسحها بورق الترشيح ، ووضعها على قطرة من 2 ٪ أسيتات اليورانيل لمدة 15 ثانية. تمت إزالة أسيتات اليورانيل الزائدة ، وتم فحص شبكة المجهر الإلكتروني وتصويرها من أجل الفحص المجهري الإلكتروني (TEM). تمت ملاحظة جميع الأقسام الرقيقة تحت المجهر الإلكتروني للإرسال (JEM-1011 JEOL ، طوكيو ، اليابان) بجهد تسارع قدره 80 كيلو فولت. تم التقاط الصور بكاميرا Megaview III مثبتة على الجانب (Soft Imaging System ، مونستر ، ألمانيا) [24].

تحليل تتبع الجسيمات النانوية

تم تقييم عدد الجسيمات النانوية في exosomes المشتقة من المصل باستخدام نظام توصيف الجسيمات النانوية Nanosight LM10-HS (Nanosight Ltd. ، Amesbury ، المملكة المتحدة). تم إجراء ثلاثة تسجيلات لكل عينة. ثم تم استخدام برنامج Nanosight Tracking Analysis 3.2 لتحليل الفيديو ، ولتحديد تركيز الجسيمات وتوزيع حجم الجسيمات. تم تسجيل ثلاثة مقاطع فيديو مدتها 10 ثوانٍ لكل عينة.

زراعة الخلايا

تمت زراعة خلايا HEK 293 وخلايا H9C2 كما وصفنا سابقًا [16]. باختصار ، تم الحفاظ على خلايا HEK 293 (بنك Cell Line الكوري ، سيول ، كوريا) وخلايا H9C2 (American Type Culture Collection ، Manassas ، VA ، الولايات المتحدة الأمريكية) في وسط Dulbecco المعدّل Eagle (Welgene ، دايجو ، كوريا) يحتوي على 10 ٪ من مصل بقري جنيني (يونغ إن فرونتير ، سيول ، كوريا) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين (جيبكو ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت زراعة الخلايا في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2.

الكيمياء المناعية والفحص المجهري متحد البؤر

تم تنفيذ الكيمياء المناعية والفحص المجهري متحد البؤر كما وصفنا سابقا [16]. بعد معالجة خلايا HEK 293 و H9C2 مع أو بدون exosomes لمدة 24 ساعة ، تم إصلاح الخلايا بنسبة 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة وغسلها باستخدام PBS. كانت نوى الخلية ملطخة بـ 4′6 Diamidino 2 ‐ phenylindole (Santa Cruz Biotechnology). تم الحصول على صور مضان باستخدام مجهر متحد البؤر Zeiss LSM710 مع مرشحين إثارة (405 و 543 نانومتر). تم تسجيل البيانات كأقسام بصرية تسلسلية ، كل منها يتكون من 1024 × 1024 بكسل ، متراكبة للتمييز بين قنوات البث المنفصلة ، وحفظها كملفات TIFF (تنسيق ملف صورة مميز). تم إجراء القياس الكمي باستخدام برنامج Image J. تم قياس تعبير PKH26 وتعبير DAPI على التوالي باستخدام وظيفة RGB في الرسم البياني. تم حساب متوسط ​​نفس الشريحة بأخذ ثلاثة أجزاء مختلفة ، وكان عدد العينات ثلاثة.

فحص تكاثر الخلايا

تم تقييم الإمكانات السامة للخلايا من exosomes باستخدام MTS [3- (4،5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium] (Promega، Madison) ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية). عولجت خلايا HEK 293 مع exosomes في ثلاث نسخ في لوحة 96 بئر. تم تحديد بقاء الخلية باستخدام قارئ لوحة الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (الأجهزة الجزيئية ، مينلو بارك ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

تصوير الماوس و NIRF

تم شراء ذكور C57BL / 6 فئران (25 جم) من Orient Bio (سيول ، كوريا). تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها في كلية الطب بجامعة يونسي (سيول ، كوريا) ، وتم إجراؤها وفقًا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام حيوانات المختبر. قمنا بحقن 150 ميكروغرام من exosomes المسمى PKH26 لكل حيوان. بعد 24 ساعة ، تم حصاد القلب والكبد والطحال لكل فأر وتم استخدام نظام التصوير IVIS Spectrum (PerkinElmer ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) لالتقاط صور مضان الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIRF). تم التمييز بين إشارات التألق المتعلقة بـ PKH26 من إشارات التألق التلقائي باستخدام برنامج الصور الحية (PerkinElmer).

تحليل احصائي

تم إجراء تحليلات البيانات باستخدام اختبار الطالب t بين مجموعتين. اعتبرت القيمة الاحتمالية لـ & lt0.05 ذات دلالة إحصائية. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام الحزمة الإحصائية SPSS الإصدار 23.0 (SPSS Inc. ، شيكاغو ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية).


الطرق الهندسية لتغليف العوامل العلاجية ومجسات التصوير

تتكون Exosomes من هيكل ثنائي الطبقة من الغشاء الدهني يعبر عن الروابط السطحية والمستقبلات من الخلايا المصدر 24. يحيط الغشاء الدهني الخارجي ويحتوي على قلب محب للماء 24. يعد الفهم الشامل للهيكل الخارجي مفيدًا في معالجة وظيفة وتعبئة البضائع للإكسوسومات المعدلة. يتم دمج العوامل العلاجية في exosomes أو مقلدات exosome باستخدام طريقتين رئيسيتين: (I) تغليف نشط أو (II) سلبي. تؤدي هذه الأساليب إلى كفاءات تحميل مختلفة واستقرار الأدوية في الحويصلات الخارجية.

طرق التحميل السلبي للبضائع

هذه الطرق بسيطة نسبيًا ولا تتطلب إضافة مواد فعالة في النظام.

الحضانة مع exosomes

يتم تحضين الإكسوسومات بالأدوية ، وتنتشر الأدوية في الإكسوسومات على طول تدرج التركيز. تعتمد كفاءة التحميل على الكراهية للماء لجزيئات الدواء. يمكن أن تتفاعل الأدوية الكارهة للماء مع الطبقات الدهنية لغشاء الحويصلة 47. على سبيل المثال ، في إحدى الدراسات ، تم تحضين exosomes المشتقة من سرطان الغدد الليمفاوية بالماوس مع الكركمين في محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS) عند 22 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل التنقية بواسطة الطرد المركزي المتدرج 47. في دراسة أخرى ، هاني وآخرون لقد نجحت في تحميل إنزيم الكاتلاز ، وهو بروتين رباعي قيمته 250 كيلو دالتون ، في exosomes مستخرج من خلايا RAW264.7 في محلول PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 18 ساعة و 44. قد يكون العيب الرئيسي لهذه الطريقة هو قدرتها المنخفضة على التحميل.

الحضانة مع خلايا المتبرع

يتم علاج خلايا المتبرع بدواء ، ثم تفرز هذه الخلايا exosomes محملة بالدواء. باسكوتشي وآخرون عالجوا SR4987 خلايا سدى اللحمة المتوسطة بجرعة منخفضة من باكليتاكسيل لمدة 24 ساعة ، ثم غسلوا الخلايا وأعادوا زرعها في دورق جديد بوسط جديد 48. بعد 48 ساعة من المزرعة ، تم جمع الوسيط المكيف للخلية وعزل exosomes. كان للإكسوسومات المحملة بالباكليتاكسيل من الخلايا المعالجة أنشطة قوية ومضادة للتكاثر ضد خلايا البنكرياس البشرية CFPAC-1 في المختبر، بالمقارنة مع exosomes من الخلايا غير المعالجة. ومن المثير للاهتمام ، أن الإكسوسومات من خلايا SR4987 غير المعالجة أظهرت أيضًا بعض التأثير المضاد للتكاثر ، ربما نتيجة لوجود بعض البروتينات أو الأحماض النووية داخل الإكسوسومات التي يمكن أن تغير البيئة المكروية للورم 48.

طرق تحميل البضائع النشطة

صوتنة

يتم خلط Exosomes من خلايا المتبرع مع الأدوية أو البروتينات ومن ثم يتم صوتنتها باستخدام مسبار الخالط. تؤثر قوة القص الميكانيكية من مسبار السونيك على سلامة غشاء الإكسوسومات وتسمح للدواء بالانتشار في الإكسوسومات أثناء تشوه الغشاء هذا. كيم وآخرون لقد أثبتت أن اللزوجة الدقيقة لغشاء exosome تنخفض بشكل ملحوظ بعد صوتنة 49. ومع ذلك ، فإن عملية تشوه الغشاء هذه لا تؤثر بشكل كبير على البروتينات المرتبطة بالغشاء أو محتويات الدهون في الإكسوسومات. تم العثور على سلامة غشاء exosomes ليتم استعادتها في غضون ساعة عندما يتم تحضين exosomes عند 37 درجة مئوية 49. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، لا يتم تغليف الأدوية داخل الإكسوسومات فحسب ، بل يتم ربطها أيضًا بالطبقة الخارجية من الغشاء نتيجة لذلك ، يتم ملاحظة مرحلتين من إطلاق الدواء. تنتج مرحلة إطلاق الاندفاع الأولى عن إطلاق الدواء المرتبط بالطبقة الخارجية للأكسوسومات ، ويتبع ذلك الإطلاق البطيء للدواء المغلف داخل الحويصلات الخارجية 49.

النتوء

يتم خلط Exosomes من الخلايا المانحة مع دواء ، ويتم تحميل الخليط في آلة بثق الدهون القائمة على الحقن مع أغشية مسامية 100-400 نانومتر تحت درجة حرارة مضبوطة. أثناء البثق ، يتم تعطيل الغشاء الخارجي وخلطه بقوة مع الدواء. لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت القوة الميكانيكية القاسية المستخدمة في هذه الطريقة تغير خصائص الغشاء ، مثل إمكانات زيتا ، وهياكل بروتين الغشاء. فورمان وآخرون ذكرت أن تحميل exosomes المستخرجة من خلايا سرطان الثدي MDA-MB231 بالبورفيرين باستخدام طريقة البثق يغير إمكانات زيتا للإكسوسومات الأصلية ويسبب تسممًا للخلايا ، في حين أن الإكسوسومات المحملة بالبورفيرين المحضرة باستخدام طرق أخرى لا تظهر سمية خلوية كبيرة 50. قد تكون هذه الملاحظات ناتجة عن عملية البثق المكثفة (تم بثق الإكسوسومات 31 مرة) حولت تكوين الحويصلة 50. ومع ذلك ، تم العثور على الكاتلاز الذي تم تحميله في exosomes المشتقة من البلاعم RAW264.7 باستخدام 10 قذفات ليس لها سمية خلوية ولإثبات نشاط أعصاب أكبر من نشاط exosomes المحضرة بالتجميد / الذوبان أو طرق الحضانة البسيطة 44. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات التفصيلية حول هذه الطريقة.

دورات التجميد والذوبان

في هذا الإجراء ، يتم تحضين الأدوية مع exosomes في درجة حرارة الغرفة لفترة زمنية محددة ، وبعد ذلك ، يتم تجميد الخليط بسرعة عند -80 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل ويتم إذابته في درجة حرارة الغرفة. تتكرر هذه العملية لمدة 3 دورات على الأقل لضمان تغليف الدواء 51. ومع ذلك ، يمكن أن تحفز الطريقة على تجميع الإكسوسومات ، مما يؤدي إلى توزيع واسع الحجم للإكسوسومات المحملة بالعقاقير. تكون قدرة تحميل الدواء لطريقة التجميد / الذوبان بشكل عام أقل من تلك الخاصة بالطرق الصوتية أو البثق. ومن المثير للاهتمام ، أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لدمج الغشاء بين exosomes والجسيمات الشحمية ، وقد تم استخدامها لإنشاء جزيئات exosome-mimetic ، وفقًا لما أفاد به ساتو. وآخرون 51 ، الذين قاموا بعزل exosomes من RAW264.7 الضامة ودمجوا exosomes مع عدة أنواع من الجسيمات الشحمية القائمة على الفسفوليبيد. تم تمييز الجسيمات الشحمية الخارجية المنصهرة باستخدام مقايسة نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) ، ووجد أن عدد دورات التجميد / الذوبان يؤثر على نسب تخفيف الدهون ، مما يؤدي إلى تغييرات في شدة التألق.

التفريد الكهربي

تخلق هذه التقنية مسامًا صغيرة في الغشاء الخارجي من خلال تطبيق مجال كهربائي على exosomes معلق في محلول موصل. يزعج التيار الكهربائي طبقة ثنائية الفسفوليبيد من exosomes ، مما يؤدي إلى تكوين مسام مؤقتة. يمكن للأدوية أو النيوكليوتيدات أن تنتشر لاحقًا في داخل الإكسوسومات عبر المسام. يتم بعد ذلك استعادة سلامة الغشاء الخارجي بعد عملية تحميل الدواء. تُستخدم هذه الطريقة على نطاق واسع لتحميل siRNA أو miRNA في exosomes ، لأن هذه النيوكليوتيدات كبيرة نسبيًا ولا يمكن أن تنتشر في الإكسوسوم تلقائيًا ، كما تفعل الجزيئات الصغيرة الكارهة للماء. يؤدي Electroporation إلى تحميل متفوق لـ siRNA على تعداء كيميائي 52. ومع ذلك ، قد يتسبب التثقيب الكهربائي في تراكم الحمض النووي الريبي وعدم استقرار الجسيمات الخارجية ، مما يؤدي إلى قدرة تحميل منخفضة. جونسن وآخرون ذكرت أن التثقيب الكهربائي في المخزن المؤقت الأمثل مثل ثنائي السكاريد طرهالوز يمكن أن يساعد في الحفاظ على السلامة الهيكلية ويمكن أن يمنع تراكم الإكسوسومات المستخرجة من الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون. لا يعزز Electroporation تحميل الحمض النووي الريبي في exosomes فحسب ، بل يزيد أيضًا من تحميل الجزيء الصغير المحب للماء في exosomes ، على سبيل المثال ، 5،10،15،20-tetrakis (1-methyl-4-pyridinio) بورفيرين رباعي (ص-toluenesulfonate) أو TMP ، والذي يستخدم للتأثيرات الضوئية.

الحضانة مع نفاذية الغشاء

Saponin هو جزيء خافض للتوتر السطحي يمكن أن يشكل معقدات مع الكوليسترول في أغشية الخلايا ويولد مسامًا ، مما يؤدي إلى زيادة نفاذية الأغشية 54. يعزز Saponin قدرة تحميل الكاتلاز إلى exosomes ، مقارنة بطريقة الحضانة البسيطة. على الرغم من أن السابونين عامل نشط سطحيًا ، إلا أنه لا يحلل الكاتلاز ، الذي يتم الحفاظ على نشاطه 44. يمكن أن يساعد الصابونين أيضًا في تحميل الجزيئات المحبة للماء في exosomes. أظهرت دراسة أن احتضان جزيء صغير محب للماء مع الصابونين يزيد من تحميل الدواء في exosomes 11 ضعفًا مقارنة بالتحميل السلبي بدون سابونين 50. ومع ذلك ، هناك مخاوف بشأن النشاط الانحلالي في الجسم الحي للسابونين عند استخدام هذا المركب. لذلك ، يجب أن يكون تركيز الصابونين المستخدم في تحميل الدواء محدودًا ، ويجب تنقية exosomes بعد الحضانة باستخدام الصابونين.

انقر فوق طريقة الكيمياء للاقتران المباشر

يمكن أيضًا استخدام طرق الكيمياء لربط الجزيئات مباشرة بأسطح exosomes عبر الروابط التساهمية. يُعد cycloaddition أزيد ألكين المحفز بالنحاس ، والمعروف باسم كيمياء النقر ، مثاليًا للاقتران الحيوي للجزيئات الصغيرة والجزيئات الكبيرة مع أسطح exosomes 11. تتفاعل مجموعة كيميائية ألكين ومجموعة كيميائية أزيد لتشكيل رابط تريازول. يكون التفاعل سريعًا وفعالًا ، مقارنةً بتفاعلات الارتباط العرضي التقليدية ، مثل اقتران مالييميد-ثيول ، ويوفر تحكمًا أفضل في موقع الاقتران. كما أنها مناسبة لتعديل الجزيئات البيولوجية الكبيرة ، لأنها يمكن أن تحدث في الوسط المائي 55. سميث وآخرون أبلغت أنه يمكن اقتران exosome متصالبًا مع مجموعات alkyne باستخدام كيمياء carbodiimide إلى نموذج azide ، azide-fluor 545 56. هذا الاقتران ليس له أي تأثير على حجم واستيعاب exosomes ، مما يشير إلى أن التفاعل معتدل ولا يؤثر على بنية أو وظيفة exosome.

جسم مضاد ضد البروتينات الخارجية

أشارت الدراسات الحديثة إلى أن الإكسوسومات تحمل المحتويات الجينية والبروتينية لخلاياها الأم. يمكن للفلوروفور والميكروبيدات المقترنة بأجسام مضادة محددة للغاية أن تربط مستضدًا معينًا على سطح الخلية. هيجينبوثام وآخرون أثبتت جدوى استخدام فرز الحويصلة التي تنشط بالفلور لتحليل وفرز exosomes الفردية المعزولة من خلايا DiFi 57. تم استخدام EGFR والعلامة الخارجية CD9 لربط Alexa-647 بأسطح exosomes للكشف. نظرًا لأن الإكسوسومات تحمل مستضدات الخلايا الأم ، فمن المنطقي أن نفترض أنه يمكن استخدام ميكروبيدات محددة مقترنة بمستضد لعزل وتتبع الجسيمات الخارجية في الجسم الحي.

الأساليب المختلفة المستخدمة لتحميل الشحنات في exosomes لكل منها قدرات تحميل مختلفة ، والتي تعتمد على خصائص الشحنة مثل المحبة للماء ، والكره للماء ، والوزن الجزيئي. هاني وآخرون أبلغت عن أن الصوتنة والبثق يوفران أعلى تحميل للكتلاز في exosomes ، مقارنة بدورات التجميد / الذوبان والحضانة السلبية ، والتي تنتج أقل كفاءة في تحميل الدواء. ومع ذلك ، فإن كفاءة التحميل ليست العامل الوحيد الذي يجب مراعاته. سلامة واستقرار الغشاء الخارجي مهمان أيضًا في توصيل الدواء. كما ذكرنا سابقًا ، على الرغم من أن تحميل الكاتلاز في exosomes باستخدام الصوتنة والبثق يؤدي إلى نشاط إنزيمي جيد ، فقد وجدت دراسات أخرى أن سلامة الغشاء معرضة للخطر ، وقد يتغير هيكل البروتين المرتبط بالغشاء ، مما يؤثر على التأثير العلاجي للإكسوسومات المحملة بالدواء . لذلك ، من الضروري إجراء مزيد من التحقيق.

الإكسوسومات الهندسية لتوصيل الجزيئات العلاجية والتشخيصية

تسلط الاستراتيجيات الموصوفة سابقًا للهندسة exosomes مزيدًا من الضوء على المزايا الفريدة للمنصات النانوية القائمة على exosome لتسليم البضائع. يتم تقديم سلسلة من الأمثلة الجيدة لهذه الاستراتيجيات التي تم تطبيقها بنجاح من أجل توصيل الجزيئات الوظيفية بوساطة exosome في الجدول 1.

توصيل الجزيئات العلاجية الصغيرة

تم دمج العديد من الجزيئات الصغيرة ، سواء كانت كارهة للماء أو محبة للماء ، في exosomes باستخدام الطرق المختلفة المذكورة في القسم أعلاه (الشكل 2 أ ، 2 ب). في معظم الحالات ، يؤدي التوصيل الخارجي إلى زيادة تراكم الأدوية في الخلايا المستهدفة وتحسين استقرار الجزيئات الصغيرة ووقت الدورة الدموية ، وبالتالي تحسين فاعلية الأدوية الجزيئية الصغيرة وتقليل IC50. موناغالا وآخرون استخدموا exosomes معزولة من حليب الأبقار لتغليف عوامل العلاج الكيميائي والوقاية الكيميائية ، مثل باكليتاكسيل ، ودوكسوروبيسين ، وويثافرين ، عن طريق التحميل السلبي 58. يتم إطلاق هذه الأدوية ببطء من exosomes بطريقة تعتمد على الوقت. أظهر الباحثون أن الإكسوسومات المحملة بالفيرين والإكسوسومات المحملة بالباكليتاكسيل لها IC أقل.50 من الأدوية المجانية للأنشطة المضادة للتكاثر ضد خلايا سرطان الرئة A549. كما أكدوا الفعالية المضادة للورم في الجسم الحي باستخدام نموذج الماوس الحامل للورم. تُظهر exosomes المحملة بـ Withaferin تأثيرًا مثبطًا أكبر بشكل ملحوظ على الأورام مقارنةً بعناصر التحكم بعد الحقن داخل الصفاق بجرعة دون المستوى الأمثل. الشمس وآخرون أثبتت أن exosomes المحملة بالكركمين والمعزولة من خط خلية سرطان الغدد الليمفاوية في الماوس EL-4 تُظهر استقرارًا أفضل في الكركمين في المختبر وارتفاع تركيز الدم في الجسم الحي 47. نتيجة لذلك ، يزداد مستوى الكركمين في الخلايا المستهدفة CD11b + Gr-1 + ، وقد تم تحقيق قمع كبير للسيتوكينات الالتهابية مثل IL-6 و TNF-α في نموذج من الصدمة الإنتانية التي يسببها عديدات السكاريد الدهنية في الفئران ذات الكفاءة المناعية 47. أفاد كيم أن exosomes المشتقة من البلاعم المحملة بالباكليتاكسيل ، مقارنة مع الجسيمات الشحمية المحملة بالباكليتاكسيل ، يزيد بشكل كبير من الامتصاص الخلوي في خط خلايا سرطان الرئة 3LL-M227 في الفئران لويس 59. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم العثور على exosomes محملة بالباكليتاكسيل للتغلب على مشكلة مقاومة الأدوية في خلايا MDCK MDR1. IC50s من exosomes المحملة بالباكليتاكسيل أقل بكثير من تلك الموجودة في باكليتاكسيل وتاكسول 59. وبالتالي ، يمكن أن يتجاوز توصيل الجسيمات الخارجية نظام تدفق الدواء من بروتين P-glycoprotein (P-gp). ومع ذلك ، فإن exosomes نفسها لا تمنع P-gp ، ولا تزال الآلية التي تتغلب بها على مقاومة الأدوية غير واضحة.

تمثيل تخطيطي لأنواع مختلفة من أنظمة توصيل الأدوية exosomes. تتكون Exosomes من طبقة ثنائية للدهون يمكن أن تتكون من الدهون ، والتي تحيط بقلب مائي. يمكن أن تشتمل كل من الطبقة الدهنية الثنائية والفضاء المائي على مركبات كارهة للماء (أ) أو مركبات محبة للماء (ب) ، على التوالي. (C) يمكن استخدام Exosomes لتوصيل DNA و RNA والبروتين. (د) يمكن إرفاق تحقيقات العلاج أو التصوير ، الروابط الاستهدافية المحددة والربط التساهمي بسطح الإكسوسوم.

تسليم الحمض النووي الريبي العلاجي

الحمض النووي الريبي هو جزيء كبير ويصعب توصيله في الجسم الحي. تم استكشاف العديد من الطرق ، مثل استخدام الجسيمات الشحمية الموجبة 60،61 ، المتشعبات 62 ، والجزيئات القائمة على البوليمر الموجبة 63. ومع ذلك ، فإن هذه الناقلات ليست مناسبة للاستخدام في الممارسة السريرية ، بسبب السلامة والاستقرار والمشاكل خارج الهدف 64. الأسلوب الأكثر شيوعًا لدمج siRNA أو miRNA في exosomes هو التثقيب الكهربائي ، لأن هذه الطريقة تزعزع استقرار غشاء الحويصلة وتسمح لـ siRNA أو miRNA باختراق الحويصلات. ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ سابقًا عن تجميع exosomes و RNA أثناء electroporation ، كما تمت مناقشته أعلاه. ألفاريز إرفيتي وآخرون لقد استخدموا exosomes شجيري مشتق ذاتيًا من الفئران المستهدفة ببروتين Lamp2b لتوصيل GADPH siRNA و BACE1 siRNA عبر الحاجز الدموي الدماغي في الفئران. تُظهر البيانات أن جينات التدبير المنزلي ، GADPH ، و BACE1 المحملة بالتأثيرات الخارجية تثبط بشدة تعبير mRNA و amyloid في أدمغة الفئران البرية بعد الحقن في الوريد ، مقارنةً بـ Lipofectamine و siRNA-RVG-9R 65. وولجرين وآخرون أظهر أن siRNA المحمّل في exosomes المعزولة من البلازما البشرية يستهدف بنجاح الخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية وبالتالي إسكات الجين MAPK1. أظهرت البيانات أيضًا أن الإكسوسومات المحملة بـ siRNA تتمركز في السيتوبلازم للخلايا المتلقية. ومع ذلك ، فقط في المختبر تم إجراء دراسات ، حيث تمت زراعة الإكسوسومات بشكل مشترك مع الخلايا المتلقية نتيجة لذلك ، حيث تمتص هذه الخلايا المتلقية الإكسوسومات بسهولة أكبر مما لو كانت في في الجسم الحي الوضع 52. أوهنو وآخرون أبلغت عن تسليم exosomes مستهدفة GE11 تحتوي على let-7a miRNA إلى عامل نمو البشرة (EGFR) - أكثر من التعبير عن خلايا سرطان الثدي في نموذج طعم أجنبي للفأر. GE11-targeted exosomes show higher tumor accumulation than do controls. Moreover, the exosomes isolated from donor cells previously transfected with let-7a miRNA inhibit tumor growth in mice 66 . These examples suggest that exosomes are a promising method for gene delivery with better safety profiles than those of viral vectors, cationic lipids, or polymer based particles.

Delivery of therapeutic proteins

Utilizing exosomes is one of the most promising methods for delivering macromolecular proteins (Figure 2C). Proteins can be loaded into exosomes through genetic engineering of the donor cells or through direct loaded into the exosomes. In the first method, donor cells are transfected with a plasmid carrying the gene of interest. Consequently, the cells synthesize the protein encoded by the inserted gene, and these proteins are subsequently secreted into the extracellular vesicles. At this stage, the extracellular vesicles can be isolated by collecting the cell culture supernatant and then purified. In the second method, proteins are directly loaded into exosomes as mentioned in the previous section. Catalase, a redox enzyme, loaded in exosomes extracted from macrophages has neuroprotective effects against oxidative stress in mice with acute brain inflammation. Catalase-loaded exosomes significantly decreases microgliosis and astrocytosis in the mouse brain and decreases rotation after apomorphine induction. These data suggest that exosomes are able to preserve catalase function and deliver catalase to the mouse brain after intranasal administration 44 .

Delivery of imaging molecules

Currently, a number of reports demonstrating post-isolation strategies to modify exosome surface structures have described methods to more effectively track exosomes في المختبر أو في الجسم الحي (الشكل 2 د). Lai وآخرون have engineered human embryonic kidney 293T exosomes expressing a membrane-bound Gaussian luciferase fused to a biotin receptor domain and then complexed the biotin expressed on the exosomes with fluorescent Alexa Fluor 680-streptavidin 67 , thus allowing the exosomes to be tracked في الجسم الحي either by bioluminescence or fluorescence. In addition, Wilna وآخرون have used fluorophore-conjugated antibodies against the exosomal proteins CD24 and aquaporin 2 (AQP2) to identify a subpopulation of CD24- and AQP2-positive exosomes by using nanoparticle tracking analysis (NTA) في المختبر 68. Wang وآخرون have used anti-CD63 antibody-conjugated microbeads and secondary antibody-conjugated Q-dots to track endothelial cell exosomes by using NTA 69 . Exosomes are initially formed during the inward budding of late endosomes and are subsequently stored inside of multi-vesicular bodies (MVBs) before being released into the extracellular space. Thus, it is not surprising that some endosomal forming and sorting proteins (Rab5, Rab27 and Rab35), heat-shock proteins, and tetraspanins (CD9, CD63 and CD81) are enriched in exosomes. Because of this enrichment, and the presence of other donor cell-derived factors within exosomes, the selection of source cells has a great impact on the function and distribution of exosomes and must be considered carefully.


The Lenti-X and Lenti-X Tet-On 3G CRISPR/Cas9 systems are complete systems for lentiviral-mediated CRISPR/Cas9 genome editing.

Takara Bio USA، Inc.
الولايات المتحدة / كندا: +1.800.662.2566 & bull Asia Pacific: +1.650.919.7300 & Bull Europe: +33. (0) 1.3904.6880 & bull Japan: +81. (0) 77.565.6999
لأغراض البحث فقط. ليس للاستخدام في إجراءات التشخيص. & نسخ 2021 Takara Bio Inc. جميع الحقوق محفوظة. جميع العلامات التجارية مملوكة لشركة Takara Bio Inc. أو الشركات التابعة لها في الولايات المتحدة و / أو البلدان الأخرى أو أصحابها المعنيين. قد لا يتم تسجيل بعض العلامات التجارية في جميع الولايات القضائية. يتوفر المنتج الإضافي والملكية الفكرية ومعلومات الاستخدام المقيد على takarabio.com.

Takara Bio Europe عضو في Takara Bio Group ، وهي شركة رائدة في علوم الحياة ملتزمة بتحسين حالة الإنسان من خلال التكنولوجيا الحيوية. من خلال علاماتنا التجارية Takara و Clontech و Cellartis ، تتمثل مهمتنا في تطوير أدوات وخدمات مبتكرة عالية الجودة لتسريع الاكتشاف.


استنتاج

The strong prediction of in vivo exosome function from in vitro analyses represents a step toward producing patient‐specific exosome therapeutics. These studies can identify optimal donors and stem cell manipulations predicted to improve exosome function before performing in vivo experiments. Combinations of high‐performing donor cell exosomes or stem cell manipulations can produce maximally functional exosome therapies. Further studies may use exosome miRNA data in combination with patient characteristics to predict clinical outcomes in patients. Although our approach does not identify causative mechanisms, the unbiased and quantitative selection of cues and signals allows for improved understanding of CPC exosome effects and has the potential to be extended to predict exosome function for similar outcomes in other diseases.


Exo Ldlr treatment reduces liver steatosis and atherosclerosis in Ldlr -/- mice

We systemically analyzed the therapeutic effects of Exo Ldlr . ال Ldlr -/- mice were fed with a high-fat diet for 8 weeks, followed by an injection of indicated exosomes once a week for 8 weeks (Figure 5A). Oil Red O staining of liver sections showed that Exo Ldlr treatment significantly reduced the accumulation of lipid droplets in the hepatocytes (Figure 5B-C). Plasma AST and ALT activities were much lower in Exo Ldlr treated mice (Figure 5D-E). Moreover, the qPCR analysis revealed that Exo Ldlr treatment significantly reduced the expression of fibrogenic and inflammatory genes (Figure 5F-H). HE staining of the liver section and other organs further confirmed that exosome treatment did not cause any noticeable toxic effects in these organs (Figure S7).

Exo Ldlr efficiently delivers functional Ldlr مرنا في المختبر. A. Schematic illustration of the exosome-mediated Ldlr mRNA delivery into the recipient cells, where the mRNA is translated into the functional protein. B. Fluorescence microscopy images showing the endocytosis of exosomes in the recipient cells. The intracellular distribution of DiI-labeled exosomes was analyzed by fluorescence microscopy. Nuclei were counterstained with Hoechst. PBS served as the negative control. Scale bar=5 μm. C. qPCR analysis of Ldlr mRNA expression in HEK 293T cells treated as indicated. Data are expressed as mean ± SEM of three independent experiments. *, p< 0.05 by one-way ANOVA. D. Western blot analysis of LDLR protein expression in HEK 293T cells treated as indicated. GAPDH served as the loading control. Representative data from three independent experiments.

(Click on the image to enlarge.)

In vivo distribution of Exo Ldlr after tail vein injection. A. Representative IVIS images of mice injected with 100 μL PBS, 100 μg (in 100 μL) DiR labeled Exo empty or Exo Ldlr via the tail vein. IVIS imaging was performed 4 h after injection. ب. السابق فيفو fluorescence imaging analysis of the distribution of the DiR-labeled exosomes in different organs, including the liver, spleen, heart, kidney, and lung. C. Quantification of the fluorescence signal intensity in Fig 3B. n=4, ns, no significance. D. Representative fluorescence microscopic images of the localization of DiI-labeled exosomes. Mice were injected with 100 μL DiI-labeled Exo empty or Exo Ldlr via tail vein and sacrificed 4 h after injection. Scale bar = 20 μm. E. Representative images of localization of the exosomes, immune cells, and the epithelial cells in the liver or lung sections. Scale bar = 10 μm.

(Click on the image to enlarge.)

Consistent with the phenotype change in the liver, a striking difference in the appearance of serum was seen after Exo Ldlr treatment. In the control mice receiving PBS treatment, the sera were milky and white. The milky sera were slightly changed after Exo empty treatment. In contrast, the sera were nearly transparent in Exo Ldlr -treated mice (Figure 6B). Similarly, Exo Ldlr treatment dramatically decreased total cholesterol, triglyceride, and LDL-C levels (Figure 6C-E). In contrast, no significant change in HDL-C was observed after Exo Ldlr treatment (Figure 6F). Exo empty treatment also reduced the LDL-C level, though to a much smaller extent (Figure 6E). The LDL-C and HDL-C were examined using chemistry analyzer Chemray-800 and not by FPLC that provides more accurate detection of the lipid distribution.

Given the causal role of non-HDL cholesterol in atherosclerosis, we next examined whether Exo Ldlr treatment had any effect on the progression of atherosclerosis lesions. Treatment of control or Exo Ldlr had no noticeable toxic effects on the liver, lung, kidney, heart, and spleen, as determined by HE staining (Figure S7). Notably, the fatty liver was significantly alleviated after the Exo Ldlr treatment (Figure S7). Besides, fewer and smaller atherosclerosis plaques could be observed in Exo Ldlr -treated mice (Figure 7A-B and S8A). Furthermore, Oil Red O staining of both aortic tree and aortas root showed that the atherosclerotic plaque burden, especially the lipid core, was much less in the Exo Ldlr group than in the control group (Figure 7C-E), which was further confirmed by the cross-sectional view of the aortic roots (Figure 7D-F).

Besides the reduced lipid core, inflammation and collagen content were also examined in the plaques after Exo Ldlr treatment by CD68 immunostaining and Masson's trichrome staining (Figure S8). There were abundant CD68+ cells in the plaques of the control mice, while the macrophage infiltration was dramatically decreased by the Exo Ldlr treatment (Figure S8B and S8D). Notably, no differences were observed in the collagen content between Exo Ldlr -treated and control mice (Figure S8C and S8E).

In summary, we found that LDLR deficiency in Ldlr -/- mice resulted in abnormal lipid metabolism and atherosclerosis. However, exosome-mediated Ldlr mRNA delivery could robustly restore the expression of LDLR and thus reverse the phenotype, such as steatosis, high LDL-C, and atherosclerosis (Figure 8). Our study has provided a new therapeutic approach for the treatment of FH patients. Significantly, it also shed light on the management of atherosclerosis and other genetic diseases associated with liver abnormity.

Exo Ldlr effectively delivers Ldlr mRNA into the liver in vivo. A. Schematic illustration of the experimental procedure. Ldlr -/- mice were fed with a high-fat diet for 8 weeks, followed by the injection of indicated exosomes. The expression of Ldlr at both mRNA and protein levels in the liver was examined 3 days after injection. B. Semi-quantitative PCR analysis of Ldlr mRNA expression in livers from mice treated as indicated. Lane 1 is DNA ladder. The lower 289 bp band represents the endogenous truncated Ldlr from knockout mice and the 371 bp band represents the exogenous wild-type Ldlr. Data shown are representative of 4 independent experiments. C. Quantitative data of Figure 4B. Data are expressed as mean ± SEM. *, p < 0.05 by one-way ANOVA. D. qPCR analysis of the wild-type Ldlr mRNA in livers from mice treated as indicated. n=4. Data are expressed as mean ± SEM. *, p < 0.05 by one-way ANOVA. E. Western blot analysis of the LDLR expression at the protein level in livers from mice treated as indicated. Notably, there was no endogenous LDLR protein expression in the Ldlr -/- mice with PBS treatment. F. Quantification of Western blot bands by densitometry. Data are expressed as mean ± SEM. *, p < 0.05 by one-way ANOVA.

(Click on the image to enlarge.)

Exo Ldlr effectively reduces liver steatosis in Ldlr -/- الفئران. A. Schematic illustration of the experimental procedure. Ldlr -/- mice were fed with a high-fat diet for 8 weeks, followed by the injection of indicated exosomes once a week for 8 weeks. At the end of the experiment, lipid deposition in the liver and liver function were examined. B. Representative images of Oil Red O staining of the liver samples from indicated groups. C. Percentage of Oil Red O positive area in livers from indicated groups. (D-E) Plasma ALT (D) and AST (E) levels in Ldlr -/- mice treated as indicated. (F-H) qPCR analysis of the expression of Tnfα (F), Mcp1 (G), and Col1a1 (H) in Ldlr -/- mice treated as indicated. Data are expressed as mean ± SEM. *, p < 0.05 by one-way ANOVA. ALT, Alanine aminotransferase AST, Aspartate aminotransferase.

(Click on the image to enlarge.)


Exosomes: nanoshuttles to the future of BioMedicine

Exosomes are membrane-bound vesi-cles (50� nm) that are assembled and released by possibly all eukaryotic cells. 1 Their morpho-structural features and specific membrane protein profiles have been exploited to distinguish them from other vesicles. 1 Besides mRNAs, proteins and lipids, exosomes molecular cargoes also comprise non-coding RNAs (ncRNAs) as miRNAs: intercellular transfer of exosomes would determine their horizontal transfer as well. 2 Recently, researchers from Italy, Germany, Sweden reported that في المختبر treatment of CRC cells with Cetuximab (an anti-EGFR antibody, which competes with physiological EGFR ligands and blocks downstream proliferative signaling) significantly increased the steady-state asimmetry of miRNAs and proteins distribution between whole CRC cells and their exosomes. 3 Exosomes from untreated CRC cells were highly enriched in miRNAs and proteins involved in blocking proliferation and immune escape: this was confirmed by functional data, which showed decreased proliferation of Caco-2 cells after transfection with exosomes from HCT-116 cells and viceversa ( Fig 1 , left panel). 3 On the contrary, exosomes from Cetuximab-treated CRC cells were enriched in miRNAs and proteins involved in immune response, inflammation activation, cancer progression: in fact, viability of CRC cells increased after incubation with exosomes from treated cells (Fig. 1, left panel). To explain these data, we propose that selection and targeting of exosomal cargo (RNAs and proteins) is performed by a cellular machinery, which is comprised of proteins and ncRNAs regulating their expression activity of this apparatus is regulated by Cetuximab (and possibly other drugs). 3 This Exosomal Cargo Selecting and Transporting Apparatus (ECSTA) could comprise the following components or their functional analogs: (i) proteins from ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport) and others functionally associated, as Alix and TSC101 4 (ii) Rab family members and other proteins involved in membrane trafficking, as GAPs و GEFs 5 (iii) sortilin and functionally associated proteins, as TrkB and EGFR 6 (iv) exosomal RNA-binding proteins (RBPs) 4 (v) miRNAs, long non-coding RNAs (lncRNAs), competing endogenous RNAs (ceRNAs), and other ncRNAs, 7 regulating synthesis, expression and activity of ECSTA protein members. Our data highlight questions that deserve to be experimentally explored. (a) Is Cetuximab-induced asimmetry also observed in vivo in laboratory animals and patients following treatment with Cetuximab ? If so, it should be possible to imagine ways to exploit this phenomenon for clinical therapy and biotechnological applications: for instance, procedures for exosomes removal could be developed and added to traditional drug treatments in CRC patients, when appropriate. (b) Do exosomes carry other ncRNAs, as lncRNAs, circular RNAs (circRNAs), and competing endogenous RNAs (ceRNAs)? (c) Does Cetuximab-induced asimmetry affect them as well? (d) What are the molecular mechanisms through which Cetuximab alters exosomal cargoes? (e) Beyond Cetuximab, are there other molecules capable of producing analogous effects and potentially useful for therapeutic and biotechnological applications? (f) How much does the biomolecular structure of exosomes (membranes and cargoes) depend on the specific phenotype of cells and their physiological state, including ECSTA activity? How much heterogeneous can be structure and cargoes of exosomes synthesized by the same cell type, when exposed to different cues in different biological niches? Incidentally, these 2 latter questions suggest that exosomal cargoes should be exploited with caution for diagnostic purposes. For translational applications, it will be important to improve our knowledge on the mechanics of exosomes interaction with target cells and its biomolecular effects. Exosomes-based drug delivery provides several attractive advantages: (a) low immunogenicity, when self-derived exosomes are used (b) exosomes great stability in blood (c) specific cargoes delivery to target cells (Fig. 1, right panel). RNAs and proteins with therapeutic properties can be engineered to be incorporated into natural exosomes: (1) RNA molecules can be modified by adding short sequence motifs, which would target them to exosomes (2) proteins may be modified by adding domains from known exosomal proteins (e.g., the C1C2 domain of lactadherin). By engineering donor cells to express transmembrane domains of exosomal proteins fused to specific peptides (e.g., ligands of specific membrane receptors), it should be possible to address therapeutic exosomes to specific target cells. Finally, our present knowledge on nanovesicle molecular biology can be effectively exploited for developing artificial exosomes starting by liposomes. Liposome composition (i.e., sphingomyelins, cholesterol, proteins) can be modified ad hoc to mimic exosomal features, which could enhance uptake and delivery of cargo molecules to target cells. Switching to a wider scientific horizon, it will be interesting to verify whether exosomes could be used to horizontally transfer important biologic features among phenotypically different cells from the same organism, the same kingdom, or even across different life kingdoms. A final warning: for the exosome field to hold to the great expectations surrounding it, it will be critically important to homogenize technological methodology and nomenclature.

Exosomes in cancer: biological role and therapeutic applications. (Left panel) Exosomes from CRC cancer cells deliver metastatic signals to other cells and affect immune system. (Right panel) Therapeutic exosomes (both natural and mimetic exosomes) can be loaded with therapeutic molecules and injected into the blood as specific nanovectors of anticancer signals.


Exosome Engineering Approaches

The functional molecule can be either loaded into the lumen or displayed on the surface of exosomes for a therapeutic purpose (Fig. 1a). The two major strategies, including parental cell-based and direct exosome engineering, are routinely employed for loading and displaying functional molecules, and mainly differ in the level of engineering applied for their development. In the parental cell-based approach, the starting material is the cells that are the source of the exosomes, and engineering occurs before exosome isolation from cells. In contrast, in the second approach, exosomes are the direct starting material for engineering, and the engineering procedure occurs after exosome isolation. The next two subsections separately discuss different methods employed in the two main exosome engineering approaches (Fig. 1b).

Parental Cell-Based Exosome Engineering

The parental cell-based approach of exosome engineering, which was first used for discovering the biology of exosomes and not for the purpose of manipulation, consists of genetically engineering cells to produce specifically fabricated exosomes (Fig. 1a). Here, the basics of this approach are discussed via previously published examples, to demonstrate how a functional molecule can be directed to either exosome lumen (loaded) or surface (displayed) using genetic engineering of the parental cells.

Exosomal Surface Display Using Parental Cell-Based Approach

Using the parental cell-based approach of exosome engineering, the most common method for directing a protein to the surface of exosomes uses a exosomal signal peptide. For example, lysosome-associated membrane protein 2b (Lamp2b) is an exosomal surface protein with an exosomal signal peptide. Fusion of a protein of interest to Lamp2b is very common for displaying the protein on the surface of exosomes as a targeting moiety, ligand, or receptor. A Lamp2b-based fusion protein can be used to display rabies viral glycoprotein (RVG), a neuron-specific targeting peptide, on the surface. Expression of Lamp2b-RVG fusion proteins in dendritic cells (DCs) displays RVG on the surface of DC-derived exosomes (Fig. 2a). When these exosomes are systemically administered, surface displayed RVG leads to the accumulation of these exosomes in the neurons and brain of mice [43]. Removal of the signal peptide from Lamp2b-RVG significantly reduces surface display of RVG on the engineered exosomes. Altogether, the signal peptide of Lamp2b can be used to display any fusion protein on the surface of exosomes. In addition, introduction of a glycosylation motif into Lamp2b-RVG fusion proteins could further enhance exosome delivery to the neurons and glial cells by protecting the surface-displayed fusion protein from enzymatic degradation. Therefore, this method allows simultaneous glyco-engineering and display of a protein on the surface of exosomes [52, 53].

Parental cell-based exosome engineering for loading proteins into the lumen of exosomes or displaying them on their surface. أ Surface display of a POI using different sorting modules. The fusion protein composed of the POI and the sorting module is directed to the surface of exosomes by an exosomal signal peptide. ب Use of WW tag and Ndfip1 for loading Cre enzyme into the exosomes. Ndfip1 recognizes the WW tag and activates the E3 ubiquitin ligases, leading to the ubiquitination of Cre and its subsequent loading into the exosomes. ج The EXPLOR method for loading mCherry reporter protein into the exosomes. Blue light-assisted PPI between CRY2 and CIBN results in the formation of a complex between two modules. Sorting of the whole complex into the exosomes is assisted by the CD9 sorting module. After elimination of the blue light, the two parts of the complex separate and mCherry-CRY2 is released to the lumen of exosomes. CRY2 photoreceptor cryptochrome 2, EGFP enhanced green fluorescent protein, EXPLOR exosomes for protein loading via optically reversible protein-protein interactions, Lamp2 lysosome-associated membrane protein 2, mCh mCherry, POI protein of interest, PPI protein–protein interaction, VSVG vesicular stomatitis virus glycoprotein

Other commonly used molecules for exosomal surface display of fusion proteins include tetraspanins (CD63, CD9, CD81) [54], glycosylphosphatidylinositol (GPI) [55], platelet-derived growth factor receptors (PDGFRs) [56], and lactadherin (C1C2 domain) [57]. In a very similar method to Lamp2b fusion proteins, the NH2-terminal of CD63 can be fused to a protein of interest for the same purpose [58].

Other non-cellular and exosomal proteins such as vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) have also been used for surface display of proteins on exosomes. VSVG is a key protein involved in virus envelope formation during microdomain budding from the surface of the plasma membrane. Since a similar domain to VSVG participates in the formation of endosomes and exosomes in the cell, researchers used VSVG to express proteins on the exosomal surface. VSVG contains ectoplasmic, transmembrane, and cytoplasmic domains [59]. Replacement of the ecto- and cytoplasmic domains of VSVG with another protein (e.g., green and red fluorescent proteins [GFPs and RFPs] or luciferase), without any alteration in the signal peptide and the transmembrane domain, results in proper exosomal surface display of the protein. Improved protein surface display and improved exosome uptake to the target cells are two advantages of using VSVG fusion proteins for exosomal surface display [60]. The stated methods allow proper display of a protein on the surface of exosomes, while some parental cell-based exosome engineering techniques have been developed recently for loading proteins and RNAs into the lumen of exosomes. These methods are discussed in the next subsection.

Loading Proteins into the Lumen of Exosomes Using Parental Cell-Based Engineering

The loading of therapeutic molecules is a common requirement for the production of therapeutic exosomes. The methods of parental cell-based engineering for loading molecules into the lumen of exosomes were developed very recently. These methods recruit the molecule sorting modules (MSMs) for sorting of proteins and RNAs into the lumen. These modules are able to bind to the protein or RNA of interest and direct them to exosomes. However, different MSMs or other modules have been used in different methods.

Two new methods for loading of proteins into the exosomes mimic the natural protein sorting system of cells based on ubiquitination. In the first method, an engineered ubiquitin tag (the last two glycine residues in the C-terminal are removed) has been developed. Removal of the two glycine residues results in enhanced ubiquitinated protein half-life. Fusion of this ub-tag to the proteins of interest, such as Ag85B and ESAT6 (السل الفطري proteins) or enhanced green fluorescent protein (EGFP) and nHer2 (tumor antigens), leads to the loading of the proteins into the lumen of exosomes in human embryonic kidney (HEK293) cells. A recent study showed that the ubiquitin tag acts as a sorting sequence, resulting in efficient loading of proteins into exosomes [61]. In the second method, a short tag (WW tag) with the ability to bind specifically to the L-domain motif of Ndfip1 (which activates HECT domain-containing E3 ubiquitin-protein ligases) is used. The WW tag method is another system that uses ubiquitination for the loading of proteins into exosomes. Fusion of Cre recombinase (as a protein of interest) to the WW tag and simultaneous expression with Ndfip1 leads to recognition of the WW tag by Ndfip1 and activation of E3 ubiquitin ligases and ubiquitination of Cre. Subsequently, the ubiquitinated Cre-WW are loaded into the exosomes. Ndfip1 protein induces the molecular switch for ubiquitination and helps with the exosomal packaging of the Cre-WW fusion protein (Fig. 2b). The validation results of the mentioned method showed that when engineered exosomes containing the Cre-WW fusion protein are taken up by the target cells, Cre-WW is capable of DNA recombination [62].

Another method was recently used for the loading of specific proteins into the exosomes by a non-functional mutant of the HIV-I Nef protein. This engineered mutant of Nef (Nef mut ) lacks the enzymatic activity and most functions of the intact Nef protein. The Nef protein is associated with lipid-raft microdomains of the plasma membrane [63] and exosomes. Similar to Lamp2b, CD63, and VSVG fusion proteins, Nef mut is developed for sorting of proteins to the exosomes [64]. Nef mut -GFP fusion protein was successfully loaded into exosomes for monitoring transfection and loading efficiency [65]. Moreover, fusing Nef mut to antigens of several pathogens, including Ebola virus VP24, VP40, and NP, influenza virus NP, Crimean-Congo hemorrhagic fever NP, West Nile virus NS3, and hepatitis C virus NS3, resulted in the expression of stable fusion proteins and their efficient loading into exosomes [66].

A recent attempt to load proteins into the lumen of exosomes was reported by Yim et al. [67]. They employed optically reversible protein–protein interaction (PPI) for the development of EXPLORs (exosomes for protein loading via optically reversible PPIs) using photoreceptor cryptochrome 2 (CRY2) and CIBN PPI modules. This method depends on intracellular delivery of proteins by reversible PPIs and their co-localization into exosomes by irradiation with a blue light. In the first step, a reporter protein was fused to CRY2 and CIBN protein was fused to the exosomal membrane CD9 protein (a representative marker of exosomes) to obtain two fusion proteins (CIBN-EGFP-CD9 and mCherry-CRY2). Blue light induced reversible PPI between CIBN and CRY2 indicates the reporter fusion protein (mCherry-CRY2) direction to the inner surface of exosomes through interaction with CIBN in the CIBN-EGFP-CD9 complex (Fig. 2c). The results of the study showed that protein-loaded EXPLORs increased intracellular levels of reporter proteins in the recipient cells [67].

Loading of RNAs into Exosomes Using Parental Cell-Based Engineering

In addition to the parental cell-based exosome engineering methods and devices developed for loading of proteins into exosomes, similar methods have been developed for loading of RNAs. Recently, a novel parental cell-based strategy was established for loading mRNAs, called the EXOtic (Exosomal Transfer Into Cells) device. In the EXOtic device, in addition to the RNA packaging system (CD63-L7Ae, an archaeal ribosomal protein, which can bind to the C/Dbox in the 3′ untranslated region [UTR] of any RNA structure), two other devices known as cytosolic delivery helper (Cx43 S368A, a mutated connexin 43) and targeting module (RVG-Lamp2b) also contribute, which together provide a new method for loading therapeutic mRNAs into exosomes. Using this device, the mRNA of a catalase enzyme carrying a C/Dbox sequence on its 3′ UTR was loaded into exosomes, which are simultaneously targeted to brain tissue by the Lamp2b-RVG targeting module. Briefly, as we discussed earlier, since CD63 is an exosomal surface protein, the binding of CD63-L7Ae to the C/Dbox of catalase mRNA (through the L7Ae protein) directs the whole complex (CD63-L7Ae-mRNA) to exosomes. This system loads catalase mRNA into exosomes. The validation of this method showed that Lamp2b-RVG on the surface of these exosomes targets them to brain tissue and subsequently reduces neuroinflammation and neurotoxicity in the mouse model of Parkinson’s disease [68]. This is one of the most complex reports on parental cell-based exosome engineering that displays a neuron-targeting protein (RVG) on exosomes and loads a therapeutic mRNA into their lumen simultaneously (Fig. 3a).

Parental cell-based exosome engineering for loading RNAs into the lumen of exosomes. أ The different modules of the EXOtic device for loading catalase mRNA into the lumen of exosomes using the CD63-L7Ae sorting module. Connexin is a packaging helper module, and Lamp2b-RVG is a targeting module. ب Loading of miR-199a into exosomes using TAT–TAR interaction. Interaction of Lamp2a-TAT as the sorting module with the TAR sequence fused to miR-199a results in the loading of miR-199a into the exosomes. EXOtic EXOsomal Transfer Into Cells, Lamp2 lysosome-associated membrane protein 2, RVG rabies viral glycoprotein, TAR trans-activating response element, TAT trans-activator of transcription

Sutaria et al. [69] designed a system for loading miR-199a into exosomes. They fused a modified miR-199a composed of pre-miR-199a, to a trans-activating response element (TAR) sequence (trans-activation response RNA loop) and separately fused a trans-activator of transcription (TAT) peptide (transcription activator peptide of HIV-1) to Lamp2a (Lamp2a-TAT). When expressed in HEK293 cells, miR-199a-TAR binds to Lamp2a-TAT, and the interaction on the luminal C-terminal of Lamp2a leads to the effective loading of miR-199a into the lumen of exosomes (Fig. 3b). This TAT-TAR protein–RNA interaction strategy can be an efficient tool for loading any therapeutic microRNAs (miRNAs) into exosomes and microvesicles [69].

In this context, using of RNA binding modules seems to be an efficient method for loading RNA into exosomes. Similar to TAT and L7Ae, HuR is an RNA binding protein that binds strongly to miR-155. In this regard, HuR protein was used as an RNA sorting module for exosome engineering. In one study, HuR was fused to the C-terminal of CD9 in order to be localized in the exosomal lumen. Binding to miR-155 and simultaneous localization of the HuR module inside the exosomes results in the loading of miR-155 into the exosomes. HuR can also bind to adenylate uridylate-rich elements of engineered RNAs [70].

Besides the specific loading of molecules into exosomes by means of MSMs, one approach for nonspecific enrichment of exosomes with a molecule is based on the transfection of parental cells with a gene of interest without any other modules for packaging and sorting. Expression of this gene in the cells results in a general enrichment of the molecules in the exosomes. For instance, when cells are transfected with miRNA mimics, after expression of these miRNAs, they are significantly enriched in both MSCs and their derived EVs [9].

Direct or Post-Isolation Exosome Engineering Approach

Small nucleic acid molecules (e.g., miRNAs and short interfering RNAs [siRNAs]) and therapeutic molecules such as anti-cancer drugs can be encapsulated in exosomes by direct exosome engineering. This common type of exosome engineering is technically less complex compared with the parental cell-based methods, and has been widely employed for the application of exosomes as drug delivery or gene delivery vehicles in the last 2 decades. In this approach, common manipulation methods of electroporation [20, 71], extrusion, sonication, incubation, freeze-thaw, bio-conjugation, click chemistry, and cloaking [55, 61] can be used for direct engineering of exosomes after isolation from cells. Given that these methods do not provide a continuous source of engineered exosomes, in contrast to the parental cell-based engineering methods, concise protocols for frequent engineering procedures are warranted for clinical applications. Several informative review articles have been published that describe direct exosome engineering thus, we refer the readers to these reviews for more information [72,73,74]. However, a brief review of these methods is presented here in the next sections and in Table 1.


Are exosomes useful as a transfection or delivery mechanism in gene editing? - مادة الاحياء

a NOVA Medical School, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa, 1169-056 Lisboa, Portugal
بريد الالكتروني: [email protected]

b Centre for Toxicogenomics and Human Health (ToxOmics), Genetics, Oncology and Human Toxicology, NOVA Medical School, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa, 1169-056 Lisboa, Portugal

c Intelligent Polymer Research Institute, ARC Centre of Excellence for Electromaterials Science, AIIM Facility, University of Wollongong, NSW 2522, Australia

d Illawarra Health and Medical Research Institute, University of Wollongong, Wollongong, NSW 2522, Australia

e CNC – Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 3004-517 Coimbra, Portugal
بريد الالكتروني: [email protected]

f Faculty of Medicine, University of Coimbra, 3030-789 Coimbra, Portugal

الملخص

Neurodegenerative disorders, ischemic brain diseases, and brain tumors are debilitating diseases that severely impact a person's life and could possibly lead to their demise if left untreated. Many of these diseases do not respond to small molecule therapeutics and have no effective long-term therapy. Gene therapy offers the promise of treatment or even a cure for both genetic and acquired brain diseases, mediated by either silencing or editing disease-specific genes. Indeed, in the last 5 years, significant progress has been made in the delivery of non-coding RNAs as well as gene-editing formulations to the brain. Unfortunately, the delivery is a major limiting factor for the success of gene therapies. Both viral and non-viral vectors have been used to deliver genetic information into a target cell, but they have limitations. Viral vectors provide excellent transduction efficiency but are associated with toxic effects and have limited packaging capacity however, non-viral vectors are less toxic and show a high packaging capacity at the price of low transfection efficiency. Herein, we review the progress made in the field of brain gene therapy, particularly in the design of non-toxic and trackable non-viral vectors, capable of controlled release of genes in response to internal/external triggers, and in the delivery of formulations for gene editing. The application of these systems in the context of various brain diseases in pre-clinical and clinical tests will be discussed. Such promising approaches could potentially pave the way for clinical realization of brain gene therapies.


شاهد الفيديو: كيف نقوم بفحص الحمض النووي DNA. معرفة الجينات الوراثية. كشف الأمراض الوراثية (كانون الثاني 2022).