معلومة

هل تستطيع البكتيريا البقاء على قيد الحياة بدون بروتين GroEL؟


في بدائيات النوى ، بروتين GroEL (مع GroES) ضروري لطي البروتين.

السؤال: هل يمكن للبكتيريا أن تعيش بدون بروتين GroEL؟


في E. coli ، وجد أن GroEL / GroES يتفاعل مع حوالي 10٪ من جميع البروتينات القابلة للذوبان (Kerner et al. Cell 2005) وهو المُرافق الوحيد الضروري للبكتيريا تحت جميع الظروف المختبرة (Horwich et al. Cell 1993).


لا يبدو أن هناك ضربة قاضية لها في مجموعة Keio (لقد أزالوا بشكل منهجي الجينات في الإشريكية القولونية لتقييم الضرورة ، عن طريق إعادة التركيب).

إذا لم يتمكنوا من القضاء عليه ، فهذا يشير بقوة إلى أنه جين أساسي ولا يمكن للكائن الحي أن يعيش بدونه.

http://cgsc.biology.yale.edu/KeioList.php

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1681482/


مسارات طي البروتين بوساطة تشابيرون في العصارة الخلوية

في العصارة الخلوية بدائيات النوى وحقيقيات النوى ، يمكن لشبكات المرافق الجزيئية أن تساعد عديد الببتيدات في جميع مراحل الطي.

يتم الحفاظ على آلية المرافقة الأساسية - بروتينات الصدمة الحرارية 70 كيلو دالتون (Hsp70) والمرافقين - من بدائيات النوى إلى حقيقيات النوى ، على الرغم من توسيع شبكة المرافق في حقيقيات النوى.

للمساعدة في طي عديد الببتيدات الوليدة ، فإن عامل الزناد Chaperone و peptidyl-prolyl isomerase ، الذي يرسو على الريبوسوم البكتيري ، يربطهم عند خروجهم من موقع خروج الريبوسوم.

تربط مرافقات Hsp70 حقيقية النواة السلاسل الناشئة أثناء خروجها من الريبوسومات. في خميرة الخميرةيقوم المركب المرتبط بالريبوسوم بتجنيد مرافقي Ssb Hsp70 في السلاسل الوليدة.

DnaK ، وهو ملف الإشريكية القولونية Hsp70 ، يعمل مع chaperonin GroEL لطي البروتينات المصنعة حديثًا يمكن نقل polypeptides بين هذه المرافق.

في حقيقيات النوى ، يمكن لمرافقي Hsp70 التعاون مع مجمع حلقة chaperonin TCP1 (TRiC) لطي البولي ببتيدات المركبة حديثًا أثناء الترجمة وبعدها (على سبيل المثال ، بعض بروتينات WD40 المتكررة).

يمكن للمرافق حقيقية النواة GimC / prefoldin ربط السلاسل الناشئة والعمل مع TRiC لطي الأكتين والتوبيولين.

يتم تمرير بعض عديد الببتيدات حقيقية النواة من بروتين Hsp70 HSC70 (بروتين مشابه للصدمة الحرارية 70 كيلو دالتون) إلى مرافقي عائلة Hsp90 (بروتين الصدمة الحرارية 90 كيلو دالتون) ، والتي يمكن أن تعمل مع العديد من المرافقين للمساعدة في طي خاص البروتينات.

تُستخدم المرافقات المشاركة لـ HSC70 و HSP90 أيضًا لفرز البولي ببتيدات لاستهداف الميتوكوندريا أو لاستهدافها للتحلل بواسطة البروتيازوم.


الملخص

تساهم التكافل الميكروبي بشكل كبير في الكائنات الحية المتنوعة ، حيث تميل الارتباطات طويلة الأمد إلى تآكل الجينوم المتعايش ، وعدم القابلية للزراعة ، والانقراض ، والاستبدال. كيف يمكن تسخير مثل هذا التعايش المتدهور بطبيعته في شراكة مستقرة هو مصلحة تطورية عامة. هنا ، نُبلغ عن اكتشاف بروتين مضيف ضروري لاستدامة التعايش. تستضيف البق النتن Plataspid بشكل إلزامي متعايشًا معويًا غير قابل للزراعة ومخفض الجينوم ، إيشيكاويلا. عند وضع البيض ، تودع الإناث "كبسولات" لتسليمها المتعايش إلى النسل. داخل الكبسولات ، تنجو البكتيريا التكافلية الهشة من الظروف القاسية خارج المضيف حتى تكتسبها الحوريات حديثي الولادة لتأسيس انتقال عمودي. حددنا بروتينًا واحدًا يهيمن على محتوى الكبسولة ، والذي يتم إفرازه بشكل كبير بواسطة أعضاء معوية خاصة بالإناث ، ويدمج الخلايا المتكافلة ، ويتم تعبئتها في الكبسولات. أدت ضربة قاضية للبروتين إلى انحلال التعايش ، وتوقف إنتاج الكبسولة ، وفشل انتقال التعايش ، وتأخر نمو الحوريات ، وكشف النقاب عن وظيفته الأساسية لضمان بقاء المتعايش والانتقال الرأسي. نشأ البروتين من سلالة من عائلة متعددة الجينات تشبه البروتين ، مما يلقي الضوء على أصل الحداثة التطورية فيما يتعلق بالتعايش. أدى القمع التجريبي لإنتاج الكبسولات إلى إطالة عمر الأنثى ، وكشف النقاب عن تكلفة كبيرة للحفاظ على التعايش. بالإضافة إلى البروتين الحارس للمضيف ، تم إنتاج المرافقة الجزيئية الخاصة بالمتعايش ، GroEL ، بشكل مفرط في الكبسولات ، مما يسلط الضوء على أن وظيفة التآكل في المتعايش يتم تعويضها عن طريق جزيئات المثبت لأصول المضيف والمتعايش. توفر النتائج التي توصلنا إليها نظرة ثاقبة حول كيفية الحفاظ على الارتباطات الحميمة بين المضيف والمتعايش على مدار فترة التطور على الرغم من إمكانية تعرض المتعايشين للانحطاط والخلل الوظيفي.

توجد التكافل الميكروبي في كل مكان في الطبيعة ، وتتشابك بشكل معقد في التكيف ، والبيئة ، وتطور جميع أشكال الحياة تقريبًا (1 ، 2). في الحيوانات المتنوعة التي تشمل اللافقاريات والفقاريات ، توجد كائنات دقيقة محددة على سطح أجسامها ، في القناة الهضمية ، داخل تجويف أجسامها ، أو حتى داخل خلاياها (3). في جمعيات مضيفة متكافئة ملزمة وطويلة الأمد ، غالبًا ما تظهر الجينوم المتعايش انخفاضًا حادًا في الحجم وخسائر جينية هائلة ، والتي تُعزى إلى الانتقاء الطبيعي المريح الذي يعمل على العديد من الجينات المتعايشة غير الضرورية لحياة المضيف بالإضافة إلى الطفرات الضارة المتراكمة بشكل لا رجعة فيه بسبب إلى عنق الزجاجة السكاني القوي والمقتنيات المقيدة للجينات الأفقية التي يفرضها الانتقال الرأسي المستمر (4 ، 5). بسبب الحمل الجيني المتراكم ، يجب أن يعاني هؤلاء المتعايشون التنكسي من خلل خلوي وعدم استقرار ، مما سيؤدي في النهاية إلى تآكل الجينوم المتعايش ، وعدم القابلية للزراعة ، والانقراض ، و / أو الاستبدال (4 ⇓ –7). في هذا السياق ، من المتوقع أن يطور كل من المضيف والمتعايش بعض الآليات الجزيئية لتثبيت الارتباط التكافلي الذي هو بطبيعته عرضة للانحطاط والخلل الوظيفي. بالنسبة للجانب المتعايش ، تم الإبلاغ عن العديد من البكتيريا التكافلية الجينية المختزلة في الجينوم لإنتاج المكثفات الجزيئية مثل بروتينات الصدمة الحرارية والمرافق الجزيئية ، وبالتالي تثبيت التركيب الجزيئي وعمل الخلايا البكتيرية التنكسية (8 10). بالنسبة للجانب المضيف ، على النقيض من ذلك ، لم يُعرف الكثير عن مثل هذه الآليات الجزيئية التي تدعم استقرار التعايش. هنا ، نُبلغ عن اكتشاف مثل هذا الجزيء الأساسي الضروري للحفاظ على التعايش.


تشابرونين

العمارة Chaperonin

منذ البداية ، كان يُنظر إلى جميع المرافقين (cpn60) ، بغض النظر عن أصلهم الخلوي أو دون الخلوي ، على أنهم تورويدات مزدوجة في المجهر الإلكتروني (13 ، 14). أصبحت الحاجة إلى هذه البنية الآن مفهومة بشكل أفضل وتتم مناقشتها بشكل كامل أدناه. يتم مساعدة المرافقات البكتيرية والعضوية بواسطة كوشابيرونين أحادي الحلقة (cpn10) (15 ، 16). ال بكتريا قولونية cochaperonin ، GroES ، مرتبط كغطاء في أحد طرفي GroEL لتشكيل هيكل شبيه بالرصاص (17 ، 18 ، 19) أو ، في بعض الأحيان ، في كلا الطرفين لتشكيل هيكل يشبه كرة القدم (20 ، 21). كما هو مبين في الشكل 1 (مقابل الصفحة 586) ، تمثل الرموز النقطية غير المتماثلة حالات محددة جيدًا ويمكن الوصول إليها كيميائيًا في دورة الطي. من المحتمل أن تكون هياكل كرة القدم عبارة عن حالات عابرة يمكن إثراء وجودها بواسطة نظائر أيونات المغنيسيوم غير الطبيعية مثل Mn 2+ أو ظروف أخرى (22 ، 23) ولكنها ليست مشاركًا إلزاميًا في تفاعلات الطي المنتجة (22). ما إذا كانت تشكل شكلاً وسيطًا يحدث في الجسم الحي يظل غير واضح.

أظهرت دراسات المجهر الإلكتروني المبكر (EM) لكل من polypeptides غير المصنفة (18) والذهبية (24) عديد ببتيد غير محلي مرتبط في القناة المركزية للحلق المزدوج. تم تأكيد هذا الاكتشاف من خلال إعادة بناء الارتباط الأحادي للجسيمات المجهرية للإلكترون البارد (25) ومنحنيات تشتت النيوترونات منخفضة الزاوية (26). يشير الأخير إلى أن الببتيد المربوط يوزع نفسه على شكل فلين شمبانيا يلتصق ويبرز من نهاية التجويف المركزي.

يعتمد تناسق مجموعة chaperonin على عدد وتفرد الوحدات الفرعية التي تتألف منها الحلقات. تتكون المرافق البكتيرية (GroEL) والميتوكوندريا (Hsp60) من نوع واحد فقط من الوحدات الفرعية. ومن ثم ، يمكن اعتبار الحلقتين متطابقتين ، واستقراءًا من الدراسات البلورية لـ GroEL (وبالتوافق مع دراسات EM السابقة) ، يتم تكديسهما جميعًا متتاليين مع تناظر دوراني مزدوج. يختلف عدد الوحدات الفرعية في كل حلقة. تحتوي تلك الموجودة في البكتيريا eubacteria والميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء على سبعة. يمتلك أعضاء Archaeal من عائلة TF55 / CCT ثمانية (27) أو تسعة (28) من الثيرموسوم البدائي المكون من ثمانية أعضاء يحتوي على نوعين من الوحدات الفرعية التي تتناوب داخل حلقة لإعطاء تناظر دوراني رباعي (27). أخيرًا ، تحتوي حلقات كابيرونين العصاري الخلوي حقيقية النواة على ثمانية منتجات جينية مختلفة ، والتي أشارت دراسات الارتباط المتبادل إلى أنها مرتبة في تبديل صريح (29). على عكس المرافقات البكتيرية ونظيراتها في العضيات التكافلية الداخلية ، يبدو أن المرافقات البدائية والعصبية الخلوية حقيقية النواة تعمل بدون كوتشابيرونين (30 ، 31 ، 32). ويرد أدناه وصف هيكلي محتمل لهذا.

هياكل GroEL و GroES

في عام 1994 ، تم تحديد أول هيكل عالي الدقة لـ GroEL عند 2.8 (33). الهيكل عبارة عن أسطوانة مسامية ذات جدران سميكة أطول قليلاً من عرضها وتحتوي على تجويف مركزي كبير أو قناة (الشكل 1). كما يتضح من المجهر الإلكتروني ، فهو يتكون من حلقتين من سبع وحدات فرعية مرتبة تقريبًا مع تناظر دوراني سبعة أضعاف. يتم ترتيب الحلقات من الخلف إلى الخلف ، وتتصل ببعضها البعض من خلال واجهة استوائية ممتدة ، لكنها مسطحة بشكل ملحوظ ، تحتوي على سبعة أزواج جزيئية (دقيقة لدرجة أن إحداها تتطابق مع ثنائية بلورية).

يتم طي الوحدة الفرعية لـ GroEL (547 من الأحماض الأمينية) إلى ثلاثة مجالات مميزة (الشكل 2):

مجال "استوائي" منظم جيدًا وذو α- حلزوني للغاية يشكل أساسًا متينًا حول وسط التجميع. بالإضافة إلى توفير معظم جهات الاتصال بين الوحدات الفرعية كما هو موضح أعلاه ، يساهم المجال الاستوائي في معظم المخلفات التي تشكل موقع ATPase.

مجال "قمي" يحيط بالفتحة في نهايات القناة المركزية. النطاق القمي أقل ترتيبًا جيدًا ويظهر مرونة محلية داخل المجال بالإضافة إلى حركات الكتلة حول المفصل الذي يربطه بالمجال الوسيط.

مجال "وسيط" صغير نحيف على محيط الأسطوانة يربط المجال الاستوائي بالمجال القمي.

الهياكل البلورية لـ GroES المعزولة (هيبتامر من 10 كيلو دالتون وحدات فرعية) عند 2.8 Å (34) و cpn10 من المتفطرة الجذامية عند 3.5 (35) تظهر بنية متناظرة دورانيًا بسبعة أضعاف ، وقطرها حوالي 75 Å وارتفاعها 30. كل من الوحدات الفرعية السبع لها هيكل أساسي من البرميل (الشكل 2ج) مع حلقتين من دبوس الشعر. ينحني أحدهما إلى الأعلى وإلى الداخل من الجانب العلوي ، ويشكل مجتمعًا قمة القبة. الآخر ، في الجانب الجانبي السفلي ، يحتوي على بنية غير مرتبة في جميع الوحدات الفرعية باستثناء واحدة ، حيث يتم تثبيتها بواسطة ملامسات بلورية. أشارت دراسات الرنين المغناطيسي النووي (NMR) السابقة للبروتون إلى أن هذه الحلقة (Glu16 إلى Ala32) كانت متحركة (ومن هنا جاء مصطلح الحلقة المتنقلة) ولكنها أصبحت مرتبة بشكل أفضل عند التفاعل مع GroEL (36). تم تأكيد هذه النتائج في GroEL-GroES- (ADP)7 معقدة (انظر أدناه).

دورة تفاعل تشبيرونين

كما هو مذكور أعلاه ، فإن وظيفة نظام GroEL-GroES chaperonin كمحفز بيولوجي هي تسهيل طي البروتينات داخل البيئة الخلوية - وهي بيئة تجد فيها مجموعة متنوعة من البروتينات المهمة ، أو على الأقل بعض موادها الوسيطة القابلة للطي ، عدائية أثناء رحلتهم إلى الدولة الأم. في أبسط صوره ، يتكون تفاعل الكابتن من الارتباط الدوري والإفراج عن polypeptides الهدف. عندما يفكر المرء في الارتباك المحتمل المتشابك والمجمع الذي قد تجد فيه البولي ببتيدات القابلة للطي نفسها ، يبدو من اللافت للنظر أن مثل هذه الآلية البسيطة يمكن أن تكون فعالة للغاية. ومع ذلك ، يمكن لـ GroEL-GroES بشكل روتيني إنقاذ أكثر من 80 ٪ من مجموعة البروتين المشوه التي لا تولد أكثر من بضعة في المائة من الجزيئات الأصلية بدون chaperonin (37). نظرًا لأن الشيطان دائمًا ما يكون في التفاصيل ، فإن الأسرار وراء نجاح هذه الآلية البسيطة المخادعة تكمن في الهيكل الرائع لمركب البروتين GroEL-GroES ، وكيف يتغير أثناء دورة التفاعل التي تستهلك ATP ، وما هي بالضبط تأثيرات الحالات المطابقة من chaperonin لديها على طاقة الهدف polypeptides. بشكل أساسي ، يعدل GroEL تقاربه في طي الوسائط من خلال الارتباط والتحلل المائي لـ ATP. يصبح الفعل المنسق للغاية المتمثل في الارتباط والإفراج عن بروتينات الركيزة كافياً لدفع رد فعل قابل للطي في نهاية المطاف على طول الطريق إلى الحالة الأصلية. يمكن تقسيم دورة التفاعل هذه من الناحية التشغيلية إلى أربع مراحل (الشكل 3): (أ) ربط بولي ببتيد بواسطة GroEL (غير موضح) (ب) إطلاق البولي ببتيد في الغرفة المركزية وبدء الطي ، ويتم ذلك عن طريق ربط GroES و ATP لتكوين الطاقة العالية رابطة الدول المستقلة- الحالة النشطة (الشكل 3أ) (ج) اضمحلال الطاقة العالية رابطة الدول المستقلة الحالة عن طريق التحلل المائي لـ ATP ، فتيلة لـ رابطة الدول المستقلة التجميع لإطلاق الببتيد المرتبط ، و GroES ، و ADP (الشكل 3ب) و (د) ربط ATP بـ عبر حلقة ، توفر الزناد لتفريغ GroES و polypeptide المحاصر من الجانب الآخر (الشكل 3ج).

المرحلة الأولى: ربط عديد الببتيد

تعمل القناة المركزية لـ GroEL كتجويفين منفصلين ، واحد في كل حلقة ، مفصولين عن بعضهما البعض عن طريق التقاء المقاطع الطرفية C المكونة من 24 حامض أميني من الوحدات الفرعية السبعة. في الصور المجهرية الإلكترونية وبواسطة تشتت النيوترونات صغير الزاوية ، يبدو أن هذه الأجزاء تتحد وتحجب القناة المركزية على مستوى المجال الاستوائي (26 ، 38). نظرًا لأن ركائز البولي ببتيد لا يمكنها الهروب من خلال الأجزاء الاستوائية لطفرات GroEL ذات الحلقة الواحدة والتي تكون مؤهلة في إعادة تشكيل التفاعلات (39 ، 40) ، فإن زوج التجاويف في الحلقة المزدوجة GroEL لا يبدو قادرًا على تبادل الركيزة عبر المستوى الاستوائي. يُقاس الحجم الإجمالي لكل تجويف في التركيب البلوري ليكون 85000 3 ، وهو كبير بما يكفي لبروتين أصلي بحجم جزيئي 70 كيلو دالتون ، بافتراض أنه مناسب تمامًا. سيكون حجم البولي ببتيد غير الأصلي المعبأ بشكل غير محكم والذي يمكن أن يتناسب تمامًا داخل التجويف أصغر بكثير. ومع ذلك ، نظرًا لأن القناة مفتوحة في هذه المرحلة من الارتباط ، يمكن أن تبرز عديد الببتيدات قليلاً من التجويف ، كما أظهرت دراسات cryo-EM ودراسات تشتت النيوترونات ذات الزاوية الصغيرة.

تم تحديد تسعة بقايا (موجودة على الحلزونات H و I وحلقة بين الجدائل 6 و 7) من المجالات القمية بواسطة الطفرات باعتبارها مهمة للربط متعدد الببتيد (41). هذه البقايا ، التي تحتوي ثمانية منها على سلاسل جانبية غير قطبية (التاسعة هي سيرين) ، تواجه التجويف المركزي في هيكل GroEL غير المرتبط (33 ، 41) ، والتي تتطابق بشكل وثيق مع موضع البولي ببتيدات المرتبطة التي شوهدت في صور EM للمجمعات الثنائية ذات الركيزة GroEL. وهكذا ، في حالة متقبل متعدد الببتيد ، تقدم GroEL حلقة من سطح ربط كاره للماء على طول الحافة الداخلية لتجويفها القمي ، تستعد للتفاعل مع السطح الزائد للماء الذي يتم تقديمه عادةً بواسطة مواد وسيطة قابلة للطي. تم فحص هذه المساهمة القوية الكارهة للماء في ارتباط عديد ببتيدات الركيزة بواسطة GroEL وتأكيدها بعدد من الركائز (42 ، 43) ، على الرغم من أن المساهمات القطبية والأيونية قد تلعب أيضًا دورًا (44 ، 45).

على الرغم من هذه الخصائص العامة لتفاعل الركيزة مع GroEL ، لم يتم تمييز الكيمياء الفراغية الدقيقة لربط الركيزة بشكل جيد. نظرًا لأن GroEL تطورت لتتفاعل مع مجموعة متنوعة من الوسائط القابلة للطي التي تشمل مجموعة كبيرة ومتنوعة من معلومات التسلسل ، فقد يبدو أن اختلاطها يحول دون تفاعل ارتباط محدد وعالمي. على سبيل المثال ، لوحظ ارتباط كل من الهياكل الثانوية الحلزونية والممتدة مع المرافقة. في دراسات الرنين المغناطيسي النووي ، شكل ببتيد رودانيز بنية حلزونية ألفا عند ارتباطه بـ GroEL (46). من ناحية أخرى ، أظهر التركيب البلوري الأخير لمجال قمي GroEL المعزول الذي يحتوي على علامة N-terminal المكونة من 17 وحدة بنائية تفاعلًا جيدًا بين هذا الجزء N-terminal ، في تشكل ممتد ، وسطح الربط القمي لأحد الجيران في شعرية الكريستال (47). تم العثور على سبعة من أصل تسعة من بقايا GroEL المتورطة في حدوث طفرات ملامسة لجزء الببتيد ، كما هو الحال مع العديد من المخلفات الأخرى الكارهة للماء ، والتي يوجد معظمها على الحلزونات H و I. من الشبكة البلورية ، قد تختلف عن تلك الخاصة ببروتينات الركيزة غير الأصلية لأن ارتباط الأخير بحلقة من سبعة مجالات قمي يخضع لقيود لا تنطبق على الببتيدات الصغيرة. وبالتالي ، من الصعب الاستقراء من المعلومات الهيكلية الحالية إلى نموذج عام لتفاعل الركيزة GroEL ، إذا كان موجودًا بالفعل.

كما هو مذكور أعلاه ، يمكن أن تؤدي المساحة المطابقة الشاسعة المتاحة لبولي ببتيد قابل للطي إلى حدود دنيا محلية كبيرة للطاقة ، خارج الحد الأدنى العالمي (أو شبه العالمي) الذي يبحث عنه البروتين. يمكن أن تمثل هذه المصائد الحركية ترتيبات خاطئة خارج المسار للسلسلة الفردية (اختلال في التشكيل) أو تفاعلات غير منتجة لا رجعة فيها بين السلاسل (التجميع). نظرًا لأن GroEL يجب أن يتفاعل مع الوسائط الفردية القابلة للطي وأن يعزز بشكل منتج الحركة على طول مسار الطي نحو الحالة الأصلية ، يجب أن يكون جانب واحد أو أكثر من جوانب التفاعل قادرًا على إخراج مادة البولي ببتيد الركيزة من هذه المصائد الحركية. تتمثل إحدى طرق GroEL في تحقيق هذا الهدف من خلال الكشف ، إما عالميًا أو محليًا ، عن البولي ببتيد الذي يرتبط به (48). إن الطبيعة التعاونية المحتملة لربط وسيط قابل للطي بالمواقع القمية المتعددة المجاورة لحلقة GroEL تجعل هذه الآلية جذابة بشكل خاص. بمجرد الارتباط ، يمكن أن يتكشف البولي ببتيد بشكل أكبر من خلال حركات الرفع والالتواء اللاحقة للنطاقات القمية التي تحدث عند ربط النوكليوتيدات و GroES وتؤدي في النهاية إلى إطلاقها في التجويف المركزي (49). وبالتالي ، يمكن أن تأتي الطاقة المطلوبة للتكشف من أحد المصدرين أو كليهما ، أي الطاقة الناتجة عن التفاعل بين البولي ببتيد ووجه القناة الكارهة للماء والطاقة الناتجة عن ربط ATP و GroES لتشكيل رابطة الدول المستقلة مجمع قابل للطي.

تم فحص اقتران ارتباط الركيزة بالركيزة التي تتكشف على GroEL في عدد من الدراسات ، إما عن طريق تحديد النقطة التي يتفاعل فيها GroEL مع بولي ببتيد على طول مسار الطي الخاص به أو عن طريق فحص معدلات تبادل الهيدروجين والديوتيريوم للركائز المرتبطة.بشكل عام ، يبدو أنه في غياب GroES و ATP ، يتفاعل GroEL بسرعة (10 6-10 7 M −1 s 1) مع وسيطة قابلة للطي مبكرة نسبيًا (48 MS Goldberg ، نتائج غير منشورة). علاوة على ذلك ، فإن GroEL قادر على تحويل التوازن الطبيعي بين الحالة الأصلية والحالة غير المطوية للعديد من البروتينات نحو الحالة غير المطوية من خلال الارتباط الثابت فقط بالبروتين غير المطوي (50 ، 51 ، 52). هذه النتائج في حد ذاتها لا تشكل دليلا على أن الأسباب الملزمة تتكشف. كانت الأدلة على المشاركة المباشرة لـ GroEL في كشف عديد الببتيد أكثر اختلاطًا. يبدو أن الدراسات التي أجريت على بروتين صغير ، بارناز ، تشير إلى أن الانكشاف العالمي لهذا البولي ببتيد يحدث بالتزامن مع الارتباط (48). تم التوصل إلى استنتاجات مماثلة ، ولكن أقل تأكيدًا ، من خلال فحص السيكلوفيلين المرتبط بـ GroEL (53). من ناحية أخرى ، أظهرت تجارب تبادل الديوتيريوم مع وسيط ثلاثي كبريتيد ألفا لاكتالبومين مرتبط بـ GroEL درجة منخفضة من الحماية الشاملة ، بما يتوافق مع الاحتفاظ ببعض الهياكل الثانوية (54). علاوة على ذلك ، فإن زوجًا من الدراسات الحديثة التي أجريت على اختزال ثنائي هيدروفولات (DHFR) ، باستخدام تحليل الرنين المغناطيسي النووي لتبادل الهيدروجين والديوتيريوم (55) وقياس الطيف الكتلي (56) ، لم يعثر على أي دليل على انتشار عالمي واسع النطاق لوسائط DHFR المرتبطة بثبات. في الواقع ، كانت الحماية الممنوحة ضد تبادل الهيدروجين والديوتيريوم متسقة مع شكل منظم للغاية وشبيه بالأصل ، وإن كان غير مستقر ، من DHFR المرتبط بـ GroEL.

يجب استدعاء الكشف النشط لبروتين الركيزة بواسطة GroEL فقط إذا كانت المصائد الحركية تعمل على مستوى الاختلال داخل سلاسل البولي ببتيد الفردية. رد الفعل البديل خارج المسار الذي يمكن أن يمنع اكتساب الحالة الأصلية هو التجميع ، والذي قد يكون مهيمنًا في بعض الحالات. سيكون الارتباط القوي بواسطة GroEL للوسائط القابلة للطي المعرضة للتجميع كافيًا لمنع هذا التفاعل غير المنتج. علاوة على ذلك ، شريطة أن يكون هناك إطلاق فعال وفي الوقت المناسب للبولي ببتيد المرتبط ، فإن النتيجة الإجمالية لهذه الآلية ستكون تحفيز إنتاج الحالة الأصلية دون التأثير بشكل مباشر على كشف البولي ببتيد نفسه. أظهر رانسون وزملاؤه أن طي نازعة هيدروجين المالات الميتوكوندريا بواسطة GroEL يتضمن مثل هذه الآلية (57). هنا ، حتى في القياسات المتكافئة منخفضة تصل إلى 1:20 بالنسبة إلى الركيزة ، يمكن لـ GroEL تحفيز اكتساب الحالة الأصلية عن طريق زيادة نسبة وسيط الطي الأحادي المتاح لمسار الطي العادي. من المهم الإشارة ، مع ذلك ، إلى أنه من غير المعروف إلى أي مدى قد يساهم التجميع أو سوء التشكيل داخل الجزيئي في مصير خارج المسار لأي ركيزة من GroEL ، لا سيما في سياق الخلية السليمة. في الواقع ، يبدو من المحتمل أن كلا الآليتين قد تعملان في نقاط مختلفة على مسار الطي ، وقد تكون سمة انتقادية للطي بوساطة المرافق التي يمكن التعامل معها بواسطة نفس الآلية.

المرحلة الثانية: تجليد النيوكليوتيدات و GroES

منذ إجراء تجارب إعادة الطي بمساعدة GroEL في المختبر ، لوحظ أنه في حين أن GroEL وحده يمنع إعادة الطي ، فإن GroEL في وجود أيونات K + و Mg-ATP و GroES يعزز الطي الفعال إلى الحالة الأصلية (37 ، 58 ، 59 ، 60 ، 61). أدى هذا إلى قيام المحققين باقتراح وجود ما لا يقل عن اثنين من المطابقات المميزة للمركب: أحدهما يربط البولي ببتيدات غير المطوية بإحكام و ATP بشكل ضعيف والآخر يتم عكس خصائص الارتباط فيه (60 ، 62) ، مما يشير إلى أن التغييرات التوافقية المعدلة بالنيوكليوتيدات من chaperonin متأصل في دورة طي البروتين. كشفت قياسات التوازن الأولية لربط ATP والتحلل المائي بواسطة GroEL عن درجة عالية من التعاون ، والتي تم تعزيزها بشكل أكبر عند إضافة GroES (63 ، 64 ، 65 ، 66). علاوة على ذلك ، يعتمد ارتباط GroES على ارتباط النوكليوتيدات. تمت دراسة ترتيب هذه الأحداث ومعدلاتها باتباع التغييرات في مضان البايرين المسمى GroEL. يؤدي الارتباط الضعيف لـ ATP بـ GroEL إلى حدوث تغيير توافقي سريع (نصف الوقت ∼40 مللي ثانية) (65) ، والذي يسبق الارتباط السريع لـ GroES (& gt4 × 10 7 M −1 s −1) (67). وقد لوحظت التغييرات التوافقية مباشرة عند إضافة ATP ، باستخدام تقنية cryo-EM وإعادة بناء جسيم واحد ثلاثي الأبعاد. تم تفسيرها ، بافتراض حركات مجال الكتلة التي أظهرها التركيب البلوري ، لإظهار أن المجالات القمية لحلقة واحدة تنفتح بحوالي 5-10 درجات بالنسبة للمحور الاستوائي وأيضًا الالتواء ، مما يتسبب في استطالة طفيفة لـ GroEL اسطوانة (25 ، 68). يتبع التأثير النسبي للنيوكليوتيدات المختلفة على حركات المجال القمي ترتيب ATP & gtAMP-PNP & gtADP ، والذي يتوافق مع الآلية الجزيئية الموضحة أدناه.

لا يتناسب السلوك الخيفي لـ GroEL فيما يتعلق بوظيفة ATPase بشكل جيد مع نموذج بسيط من التعاون. بدلاً من ذلك ، تم وصفه كميًا في نموذج متداخل يجمع بين التباين الإيجابي داخل كل حلقة مع تأثير سلبي بين الحلقات (69). يوفر هذا النموذج سياقًا يمكن من خلاله تقدير التفاصيل الجزيئية للتغيرات التوافقية التي يسببها الترابط والتي تكمن وراء التأثيرات التعددية ، كما كشفت عنها الهياكل البلورية (انظر أدناه) ، ولتبرير تأثيرات التغيرات الطفرية المختلفة التي تعطل بشكل مستقل واحدًا أو التفاعل الخيفي الآخر. ومع ذلك ، يصعب التقاط العلاقات الهيكلية / الوظيفية الرائعة لدورة الطي تمامًا مع الأشكال الشكلية المدمجة التي تم تطويرها في الأصل لوصف سلوك الهيموجلوبين وتنظيم إنزيمات القلة. على سبيل المثال ، يتم تحلل ATP المرتبط بـ GroEL على حلقة واحدة فقط في كل مرة ، حتى في حالة وجود فائض من ATP (67) ، في حين أن ارتباط سبعة جزيئات ADP بحلقة واحدة من GroEL هو عمليًا غير متعاون وغير متماثل بشكل هامشي فقط بين الحلقات. ومع ذلك ، في وجود GroES ، يكون ربط ADP كاملًا ولا رجوع فيه بشكل أساسي داخل حلقة واحدة وغير موجود في الحلقة المقابلة. يبدو أن هناك تعاونًا إيجابيًا وسلبيًا متأصلًا داخل GroEL tetradecamer الذي يتم دفعه بواسطة GroES إلى الحالات الوسيطة المنفصلة التي تميز مراحل دورة الطي.

تمت ملاحظة بنية النيوكليوتيد في موقع الارتباط الخاص به في الجزء العلوي من المجال الاستوائي ، الذي يواجه التجويف المركزي ، لأول مرة في التركيب البلوري لمتغير GroEL (R13G / A126V) معقد بالكامل مع 14 جزيء ATPγS ، تم حلها بدقة 2.4 Å (70) (الشكل 4أ). يحتوي الموقع على بقايا 87-91 (DGTTT) ، والتي تتفاعل مع β- وγ- فوسفات ATP وتقع في منطقة حلقة (بين الحلزونات C و D) محفوظة بشكل كبير بين المرافقين (71). يوجد اثنان من الأيونات المعدنية في موقع ربط النوكليوتيدات. الأول هو أيون المغنيسيوم ، الذي يخلب الأكسجين من كل من فوسفات النوكليوتيدات الثلاثة ، وكربوكسيلات Asp87 ، واثنين من جزيئات الماء. من المثير للدهشة أن الهيكل العام لمجمع ATPγS كان قابلاً للتركيب إلى حد كبير على بنية الأشعة السينية لـ GroEL غير المجمعة (33 ، 72) ، على عكس حركات المجال المهمة التي شوهدت في إعادة بناء صورة cryo-EM. تم اقتراح أن التناقض بين الهياكل المبردة والبنية البلورية قد يرجع جزئيًا إلى انخفاض التعاون السلبي الملحوظ للبروتين المتغير (73) ، مما يسمح بربط ATPγS بجميع الوحدات الفرعية الأربعة عشر وخلق جزيء متماثل للغاية قادرة على تشكيل شعرية بلورية واضحة المعالم. ومع ذلك ، يبدو أن هذا ليس هو الحال ، لأن مزيدًا من الدراسات البلورية مع النوع البري GroEL و ATPγS تكشف أيضًا عن بنية متشابهة (D Boisvert ، ملاحظات غير منشورة) ، مما يترك احتمال أن تكون قوى الشبكة قد سادت على حركات مجال قمي مرن. . على عكس العينات البلورية ، التي تتطلب حالة موحدة ، فإن المجمعات غير البلورية في دراسات cryo-EM لا تخضع لمثل هذه القيود على التناظر. ومع ذلك ، لوحظ تحولاين هامين للبنية التحتية المحلية في التركيب البلوري ATPγS: ترجمة محورية كبيرة للحلزون C وحركة حلقة جذعية (Lys34 إلى Asp52) ، التي يشكل جذعها المضاد الموازي اتصال β متوازيًا أساسيًا مع الوحدة الفرعية المجاورة داخل الحلقة من خلال β-strand بالقرب من الطرف C (حبلا 19) (الشكل 5أ). تتضح أهمية هاتين الحركتين الأساسيتين الآن في ضوء GroEL-GroES- (ADP) الأخير7 هيكل معقد (74).

هيكل مركب GroEL-GroES-ADP غير المتماثل

الهيكل العام لـ GroEL-GroES- (ADP)7 المركب غير المتماثل هو الصورة المتوقعة على شكل رصاصة (الشكل 1 ، مقابل الصفحة 586) ، الناتجة عن سلاسة الاتحاد بين GroEL و GroES (الشكل 5ب). يغطي GroES أحد طرفي GroEL ، وهو ممدود ومدبب باتجاه واجهة GroEL-GroES. يرجع التغيير في شكل GroEL في الغالب إلى التغيير في رابطة الدول المستقلة خاتم GroEL. حركات الكتلة الكبيرة للنطاقات القمية والمتوسطة في رابطة الدول المستقلة حلقة تتوسع وتطيل رابطة الدول المستقلة تجويف. يتم تجميع حلقة GroES كما هو الحال في هيكلها المستقل ، وتغطي السطح القمي لـ رابطة الدول المستقلة حلقة ، ترسي الاتجاه المرتفع للمجالات القمية وتغلق نهاية التجويف. والنتيجة النهائية هي حجرة على شكل قبة لها مجالات قمية مرتفعة مثل جدرانها وغطاء GroES كسقف لها. تشترك حلقات GroEL و GroES في محور دوران واحد تقريبًا سبعة أضعاف (الشكل 1 ، مقابل الصفحة 586). على عكس التغييرات الدراماتيكية في رابطة الدول المستقلة خاتم ، ال عبر الحلقة (الحلقة الفارغة) تشبه إلى حد بعيد حلقة GroEL غير المجددة.

إعادة التشكيل الدراماتيكية لـ رابطة الدول المستقلة الحلقة ناتجة عن إعادة الترتيب التي تشمل المجالات المتوسطة والقمية (الأشكال 4 و 5 و 6). أولاً ، يتأرجح المجال المتوسط ​​لأسفل نحو المجال الاستوائي والقناة المركزية ، ويتمحور حوالي 25 درجة حول Pro137 و Gly410. تغلق الحركة موقع ربط النوكليوتيدات المشغول ، الموجود على السطح الداخلي العلوي للمجال الاستوائي ، وتولد العديد من التفاعلات الجديدة مع النوكليوتيدات المرتبطة والمجال الاستوائي. ثانيًا ، يتأرجح المجال القمي لأعلى 60 درجة بالنسبة لخط الاستواء ويلتف حول المحور الطويل للمجال بحوالي 90 درجة ، مما يشكل واجهات جديدة مع المجالات القمية المجاورة ويؤدي إلى تفاعل مع الحلقة المتنقلة لـ GroES. كل من حركات المجال المتوسط ​​والقمي هي كتلة إلى حد كبير. ال رابطة الدول المستقلة تظهر المجالات الاستوائية أيضًا حركة كتلة صغيرة الحجم مقارنة بتلك الموجودة في المجال المتوسط ​​والقمي ولكن كل جزء منها مهم. المجالات الاستوائية من رابطة الدول المستقلة إمالة التجميع إلى الداخل نحو المحور الأسطواني بمقدار 4 درجات (الشكل 9). نظرًا للحفاظ على الواجهة القوية بين الحلقات ، هناك ميل خارجي مكمل للمناطق الاستوائية في عبر حلقة. يفرض هذا مزيدًا من عدم التناسق بين الحلقتين ويؤثر على التماثل السلبي الذي يربط بينهما (انظر أدناه).

عدم تناسق GroEL-GroES- (ADP)7 يكون التعقيد أكثر وضوحًا في ارتباط الترابط الخاص به: يرتبط GroES بنهاية واحدة من GroEL ، والسبعة رابطة الدول المستقلة مواقع ربط النوكليوتيدات مشغولة بالكامل ، في حين أن المواقع السبعة عبر المواقع فارغة تمامًا. باستثناء عدم وجود تفاعل أيوني معدني ثانٍ مع α-phosphate لـ ATPγS ، فإن التفاعلات المحددة لـ ADP مع المجال الاستوائي تعكس إلى حد كبير تلك الموجودة في بنية GroEL-ATPγS (70) (الشكل 4ب). في بنية GroEL-ATPγS (وكذلك في GroEL غير المترابط) ، يكون موقع ربط النيوكليوتيدات مفتوحًا إلى حد كبير (مقارنة اللوحات أ و ب في كل من الشكلين 2 و 5) ، لذلك يمكن للنيوكليوتيدات الدخول والخروج دون الكثير من العوائق الفاصلة. ومع ذلك ، عند ربط GroES ، فإن بقايا الحلزونات F و M للمجال الوسيط المعاد توجيهه تعلق على النيوكليوتيد ، والعامل المساعد Mg 2+ ، وبقايا المجال الاستوائي ، وبالتالي إغلاق موقع ربط النيوكليوتيدات. وهكذا ، فإن النوكليوتيدات محاصرة في رابطة الدول المستقلة الحلقة وستبقى هناك حتى رابطة الدول المستقلة يتم تفكيك المركب ، حتى عند تركيزات النوكليوتيدات منخفضة بما يكفي لتفريغ عبر مواقع ربط الحلقة.

توضح بعض التفاعلات الملاحظات غير المبررة سابقًا. على سبيل المثال ، يشكل Ile150 من اللولب F تفاعل فان دير فالس مع جزء السكر في ADP ، وهذا على الأرجح هو السبب في أن طفرة Ile150 مميتة (41). يساهم Helix M في الأكسجين الكربوكسيل لـ Asp398 في قفص التنسيق الأيوني Mg 2+ ، موضحًا سبب احتفاظ GroEL المتحولة D398A بنسبة 2 ٪ فقط من نشاط ATPase من النوع البري ، على الرغم من عدم تأثر تقاربها بـ ATP (40). علاوة على ذلك ، إذا تم منع Asp398 من تولي هذا الموقع النشط الجديد من خلال تقييد حركات المجال عن طريق الارتباط التساهمي ، فإن GroEL غير قادر على تحلل ATP المرتبط (75). تؤكد هذه الملاحظات الاستنتاج المستخلص من الهيكل المرتبط بـ ATPγS المرتبط بالكامل ، أي أن ارتباط ATP بـ GroEL لا يتطلب تحولات في المجالات الوسيطة أو القمية ولكن التحلل المائي اللاحق لـ ATP يتطلب ذلك.

يدعم ربط ATP أو ADP ربط GroES (16) ، وإن كان ذلك بمعدلات مختلفة من ارتباط GroES بمجمعات GroEL-nucleotide الثنائية المختلفة. على سبيل المثال ، يرتبط GroES بسرعة (& gt4 × 10 7 M −1 s −1) بـ GroEL- (ATP)7 بعد التغيير التوافقي الناجم عن ATP (67) ، في حين أن GroES تربطها ببطء (1 × 10 5 M −1 s −1) مع GroEL- (ADP)7 دولة (65). إن القواعد الكيميائية الفراغية للترابط بين GroES والنيوكليوتيدات ذات ثلاثة أضعاف. أولاً ، المجالات الاستوائية لـ رابطة الدول المستقلة حلقة GroEL-GroES- (ADP)7 يُظهر المركب نفس التحولات الهيكلية التي يسببها النيوكليوتيد والتي تظهر في بنية ATPγS المشبعة بالكامل: تحول محوري للحلزون C وإزاحة الحلقة الجذعية Lys34-Asp52. توفر هذه التحولات اتصالات استقرار للمجال الوسيط المعاد توجيهه جذريًا (الشكل 5). ثانيًا ، يوفر معقد Mg 2+ للنيوكليوتيدات المرتبطة اتصالات استقرار إضافية مباشرة للمجال الوسيط المعاد توجيهه. هذه التفاعلات هي نفسها تلك التي تحبس النوكليوتيدات في رابطة الدول المستقلة الجمعية العامة. ثالثًا ، أعاد المجال الوسيط المحول للنيوكليوتيدات الآن وضع المفصلة التي تربطه بالمجال القمي ، بحيث تتعطل اتصالات المجال المتوسط ​​/ المجال القمي بين الوحدات الفرعية للهيكل غير المترابط وتكون تفاعلات التثبيت اللاحقة مع GroES مجدية من الناحية العملية. وبالتالي ، يتم تمكين ربط GroES من خلال الانتقال الهيكلي الذي يبدأ بربط النوكليوتيدات.

يتبع مدى التغييرات المطابقة التي يسببها الترابط ترتيب ATP و gtAMPPNP و gtADP ، مما يشير إلى تفاعلات مجسمة عالية الوضوح مع β-γ phosphoanhydride لشق ثلاثي الفوسفات. لوحظ أيضًا نفس ترتيب الفعالية الوظيفية في المعدلات الواضحة والصلات المرتبطة بـ GroES المرتبطة بمجمعات GroEL-nucleotide المختلفة وفي الاستقرار المتزايد لـ GroEL-GroES- (ATP)7 معقدًا على نظيره ADP (40) ، مما يشير إلى اعتماد مماثل على ثنائي الفوسفات الطرفي. ومع ذلك ، لا يمكن اشتقاق التفاعلات المحددة التي تمثل هذا الترتيب بثقة من الهياكل الحالية.

يتم قفل حركة Ile150 و Asp398 في موقع ATPase النشط عن طريق ربط GroES ، وبالتالي عزل النيوكليوتيد ومنع فقدان ATP (أو منتج التحلل المائي ADP) أو تبادله مع يجند مجاني. نظرًا لمطابقة التناظر الدوراني ذي السبعة أضعاف ، تفرض GroES نفس القيود على جميع الوحدات الفرعية من رابطة الدول المستقلة رنين في وقت واحد. لذلك ، فقط في وجود GroES توجد نيوكليوتيدات ATP السبعة المرتبطة بـ رابطة الدول المستقلة حلقة ملتزمة بالتحلل المائي كوحدة. وبالتالي ، فإن GroES يزيد بشكل ملحوظ من التعاون الإيجابي للتحلل المائي ATP داخل حلقة واحدة ، مما ينتج عنه السلوك الكمي لنشاط ATPase لـ GroEL ، كما وصفه Viitanen وزملاؤه (76) وكميًا بواسطة Burston وزملائه (67).

على عكس التغييرات الهيكلية الرئيسية التي تحدث في GroEL ، فإن حلقة GroES heptamer في مجمع GroEL-GroES تشبه تلك الموجودة في الهيكل المستقل (34) باستثناء بقايا الحلقة المتنقلة ، والتي أصبحت الآن منظمة. كما هو متوقع ، تشكل الحلقة المتنقلة الواجهة مع حلزونات H و I المرتفعة والمنحرفة للمجال القمي GroEL من خلال سلاسل جانبية أليفاتية صغيرة ، بما في ذلك Ile25 و Val26 و Leu27 من GroES.

تشير العديد من الملاحظات إلى أن جوانب معينة من دور cochaperonin في تفاعل الطي تظل غير محددة بشكل كامل. أولاً ، لا تحتوي المرافقة الخلوية البدائية وحقيقية النواة (TF55 و CCT ، على التوالي) على cochaperonin. بدلاً من ذلك ، يبدو أن الثيرموسوم لديه حلقة ممتدة في مجاله القمي الذي يعمل على الحد من رابطة الدول المستقلة غرفة قابلة للطي (76A). ربما تتطلب الحاجة إلى المساعدة في طي بروتينات الركيزة متعددة المجالات ثقبًا قميًا أقل تقييدًا. ثانيًا ، تعمل الطفرات في مناطق المفصلات في GroEL (V174F و V190I و G375S) على قمع تعطيل ارتباط GroES الناجم عن طفرات معينة في حلقة GroES المتنقلة (77). لا تقدم الهياكل البلورية الحالية تفسيرًا مباشرًا لهذه الملاحظة. ثالثًا ، يبدو أن ارتباط GroES يحد من حجم عديد الببتيدات التي يمكن مساعدة طيها بواسطة مجمع GroEL-GroES. على سبيل المثال ، على الرغم من أن بكتيريا T4 تستخدم المرافقة المضيفة ، إلا أنها ترمز نسختها الخاصة من cochaperonin ، والمعروفة باسم gp31. يشير التركيب البلوري الحديث لـ gp31 (78) إلى أنه يمكن أن يشكل تجويفًا أكبر للطي في رابطة الدول المستقلة مركب (قفص Anfinsen) لاستيعاب & gt50 kDa بروتين رأس فج (gp23) ، والذي قد لا يتناسب بشكل مريح مع GroES.

المرحلة الثالثة: إطلاق عديد الببتيد والطي

يقترح التركيب البلوري لمركب GroEL-GroES كيف يمكن تجريد الركيزة المتعددة الببتيد من مواقع الربط الخاصة بها على جدران القناة وإطلاقها في تجويف رابطة الدول المستقلة التجمع (الشكل 7 ، مقابل ص 600 و 601). تتحرك الحلزونات H و I للمجال القمي ، وتحمل بقايا ربط الببتيد Leu234 ، و Leu237 ، و Val259 ، و Leu263 ، و Val264 ، إلى الجزء العلوي من تجويف GroEL لتشكل جزءًا من واجهة GroEL-GroES. الحلقة بين الجدائل 6 و 7 ، التي تحمل بقايا ربط الببتيد Tyr199 و Ser201 و Phe203 و Tyr204 ، يتم رفعها وتدويرها في رابطة الدول المستقلة الحلقة التي تم تشكيلها حديثًا بين المجالات القمية المعاد توجيهها. وبالتالي ، فإن ربط GroES والنيوكليوتيدات يحرم الركيزة polypeptide من عناصر الربط الخاصة بها ، والتي تشارك الآن إما في ربط GroES مباشرة (الحلزونات H و I) أو في دعم ربط GroES بشكل غير مباشر عن طريق تثبيت الواجهة بين المجالات القمية المرتفعة والمدارة. أن بقايا ربط البولي ببتيد التسعة تدعم الطي النشط رابطة الدول المستقلة يشرح التجميع ملاحظة أن التغيير الجذري للطفرات الجينية لبقايا واحدة فقط يمكن أن يمنع ارتباط GroES ، وفي الواقع ، يكون قاتلاً لسلالة متحولة (41).مع انتقال المجالات القمية إلى مواقعها الجديدة ، تنفصل عناصر ربط الببتيد المقابلة على المجالات القمية ، وربما تضع الركيزة "على الرف" وتساعد على كشفها ، إما محليًا أو عالميًا (49). قد يكون هذا كافيًا لسحب البولي ببتيد المربوط من التشكل الموجود في مصيدة الطي الحركية ووضعه مرة أخرى على المنظر الطبيعي القابل للطي قبل إطلاقه في التجويف أو بالتزامن معه. يتم الآن دفن المخلفات الكارهة للماء ، والتي ارتبطت في الأصل بالبولي ببتيد غير الأصلي (من المفترض من خلال التفاعل الكارثي للماء) في تجويف الحلقة غير المجنونة بطريقة أخرى ، في رابطة الدول المستقلة تجميع الحلقة وتم استبدالها على جدران التجويف بمخلفات قطبية في الغالب [الشكل 8 (مقابل الصفحة 602) ، قارن رابطة الدول المستقلة و عبر خواتم]. أصبح البولي ببتيد المنطلق الآن حرًا في إعادة إنشاء الطي كجزيء معزول في تجويف كبير الحجم ، حيث تساعد البطانة المحبة للماء على دفن المخلفات الكارهة للماء والطي في هيكل أصلي.

المرحلة الرابعة: طي البروتين وإطلاق الروابط

تراكب المجالات الاستوائية من رابطة الدول المستقلة تظهر حلقة GroEL على تلك الخاصة بـ GroEL غير المقيدة أن طائرة رابطة الدول المستقلة الحلقة مشوهة قليلاً (الشكل 9). في ال رابطة الدول المستقلة الحلقة ، تميل كل وحدة فرعية بحوالي 4 درجات باتجاه محور الأسطوانة ، بحيث يكون الجزء الداخلي من الحلقة أقل بمقدار 3 درجات عن المستوى الأصلي ويكون الجزء الخارجي أعلى بمقدار 5 درجات. لوحظ بعض أكبر التحولات للبقايا التي تشارك في تفاعلات الحلقة المتقاطعة: على سبيل المثال ، يتحرك Cα لـ Glu434 4.9 Å و Cα لـ Ala109 يتحرك 3.8 Å بعيدًا عن المستوى المتساوي. على الرغم من هذه التحولات ، يتم الحفاظ على التفاصيل الكيميائية للواجهة. للحفاظ على الواجهة البينية للحلقة ، فإن عبر يجب أن تتحول الحلقة في اتجاه مكمل. هذا يسبب كل عبر تميل الوحدة الفرعية في الاتجاه المعاكس ، أي بعيدًا عن المحور المركزي ، بحوالي 2 درجة. وهكذا ، فإن تشكيل رابطة الدول المستقلة تفضل مجموعة GroEL-GroES التغيير الهيكلي في الحلقة المقابلة التي تعارض تشكيل ثانية رابطة الدول المستقلة التجمع (كرة قدم متناظرة). أحداث ملزمة في رابطة الدول المستقلة عصابة تتنافس ضد أحداث مماثلة في عبر حلقة توضح انتقال التأثيرات الخيفية السلبية عبر المستوى الاستوائي. مثل التأثيرات الإيجابية داخل الحلقة ، يتم هذا النقل بشكل أساسي من خلال حركات الكتلة بدلاً من التحولات التوافقية داخل المجالات. على عكس الآليات الموجودة في معظم الأنظمة الخلافية الأخرى ، فإن هذا التعبير عن التباين السلبي يعتمد على الحفاظ ، بدلاً من تغيير ، الاتصالات البينية الرباعية عبر المستوى الاستوائي.

يتم تحديد الفائز في المنافسة بين الحلقتين حسب نوع نوكليوتيد الأدينين الذي يرتبط به. تظهر التجارب الوظيفية أن ATP يهيمن على ADP لأنه يوفر قوة استقرار أقوى للمركب. أولاً ، سيؤدي ربط GroES بـ ATP ، ولكن ليس ADP ، إلى إطلاق البولي ببتيدات غير الأصلية الأكثر ارتباطًا بإحكام في تجويف القبة القابل للطي في رابطة الدول المستقلة الحلقة ، مما يسمح لهم بالبدء ، وإذا مر وقت كافٍ ، فإن الطي الكامل للبروتين الأصلي (40). ثانيًا ، يتسبب ATP المرتبط ، ولكن ليس ADP ، في حدوث تجمع ناقص لـ ATPase (يحتوي على طفرة D398A) للحفاظ على سلامته الهيكلية عند التعرض لدرجات حرارة منخفضة و 0.5 M guanidinium HCl (40). أخيرًا ، تحافظ حلقات D398A التي تعاني من نقص ATPase على قبتها رابطة الدول المستقلة التجميع ولن يطلق النوكليوتيدات والغرز والبولي ببتيد المطوي عند التعرض لـ عبر الحلقة إلى ATP ، ما لم يكن ATP المرتبط في رابطة الدول المستقلة يُسمح للحلقة بالتحلل المائي إلى ADP. كما ذكرنا سابقًا ، يبدو أن الجزء β-γ ثنائي الفوسفات / Mg 2+ من النوكليوزيد ثلاثي الفوسفات يساهم في اتصالات قوية إضافية تتجاوز تلك المتاحة من ADP والتي تعمل في النهاية على استقرار التغييرات التي تكمن وراء تكوين القبة. رابطة الدول المستقلة الجمعية العامة. وهكذا ، فإن رابطة الدول المستقلة يضعف الارتباط الحلقي لـ GroES عندما يفقد النيوكليوتيدات فوسفاته عن طريق التحلل المائي ، ويصبح المركب عرضة للتفكيك (وإطلاق GroES ، و polypeptide ، و ADP) عند تعرضه لضغط الإمالة الخارجي الذي يفرضه ارتباط ATP على الحلقة المعاكسة (الشكل 3). يتوافق هذا النموذج تمامًا مع دور النيوكليوتيدات في قيادة الأنظمة الميكانيكية الجزيئية الأخرى مثل بروتينات G وأنظمة الانقباض. علاوة على ذلك ، فإنه يفسر لماذا تتطلب دورة طي البروتين الديناميكي بمساعدة GroEL بنية حلقي مزدوج.

يمكن قياس توقيت تشكيل وتفكك وسيطة GroEL-GroES النشطة القابلة للطي من عدة تجارب (عند 23 درجة مئوية). بعد ربط GroES و ATP بمركب ثنائي GroEL-polypeptide لتشكيل a رابطة الدول المستقلة مركب ATP ، يتم إطلاق عديد الببتيد في القناة المركزية في غضون ثانية ، كما يتضح من قياسات تباين التألق (39 ، 40). ومن المثير للاهتمام ، خلال هذه الثانية الأولية ، أن هناك انخفاض حاد في تباين الخواص ، مما يعكس زيادة تنقل مجموعات الإبلاغ وربما عملية الانكشاف السريع المذكورة أعلاه ، حيث يتم تمديد البولي ببتيد مبدئيًا على مواقع الربط القمي المعبأة. بعد إطلاق البولي ببتيد في القناة ، هناك فترة ∼6-8 ثوانٍ قبل التحلل المائي لـ ATP في رابطة الدول المستقلة المجمع يحولها إلى حالة ADP معدة (67). يبدو أن الطي المنتج يستمر خلال هذا الوقت وبعد تشكيل رابطة الدول المستقلة حالة ADP ، كما يتضح من تغيرات تباين الخواص المستمرة والتراكم المستمر للنشاط البيولوجي للركيزة القابلة للطي (39 ، 40). بعد -5-10 ث في رابطة الدول المستقلة تتم المطالبة بحالة ADP ، وتصريف GroES و polypeptide عن طريق ربط ATP في عبر خاتم (40). من المحتمل أن يكون تفكك المجمع خطوة سريعة ، كما هو مقترح في تجارب التألق الديناميكي الأخيرة (HS Rye ، نتائج غير منشورة) ، بما يتوافق مع التعاون الكمي داخل الحلقة الذي يقترن بالتعاون السلبي بين الحلقات ، كما هو موضح أعلاه. ما يلي على الأرجح للأول رابطة الدول المستقلة الحلقة هي أن نطاقاتها القمية تسترخي وتعود مرة أخرى إلى التشكل مع التقارب العالي لعديد الببتيد ، كما يظهر في هياكل GroEL غير المجمعة. ماذا يحدث للسابق عبر الحلقة لا تزال غير مفهومة. على سبيل المثال ، لم يتم تحديد ما إذا كان البولي ببتيد غير الأصلي أو GroES مرتبطًا بـ عبر حلقة أثناء الطي و / أو تفريغ ATP الناجم عن رابطة الدول المستقلة مركب. في دراسة مع الركيزة ملزمة في عبر معقد ADP الثلاثي ، ارتبطت إضافة GroES و ATP الزائدة بالإصدار غير المنتج بدلاً من الطي المنتج ، مما يشير إلى أن ربط GroES الثاني غير مرغوب فيه (WA Fenton ، بيانات غير منشورة). وبالتالي ، على الرغم من أنه من الجذاب اعتبار أن آلة المرافقة يمكنها في وقت واحد تشغيل تفاعلين إنتاجيين مختلفين داخل حلقات متقابلة ، وتحويل 180 درجة في الدورة عن بعضها البعض ، فقد لا يكون هذا هو وضع عملها. لا يزال من الممكن إزالة كل من البولي ببتيد و GroES تمامًا من GroEL قبل أن تبدأ الجولة التالية من الربط الإنتاجي (للحلقات في حالة استرخاء تام). في هذا الصدد ، أظهرت دراسة مع مجموعة GroEL ذات الحلقة المختلطة ، القادرة على ربط polypeptide و GroES في واحدة فقط من حلقاتها ، حركية إعادة تشكيل الرودانيز التي كانت مماثلة لتلك الخاصة بإعادة الطي بواسطة GroEL من النوع البري (79). هذا يدعم الفكرة القائلة بأنه ، على الأقل بالنسبة للرودانيز ، يتقدم GroEL خلال دورة واحدة كاملة قبل البدء في الدورة التالية ، وإلا كان المرء يتوقع أن تكون حركية المرافقة من النوع البري ، مع اثنين من التجاويف المختصة ، أسرع. قد تحل مزيد من الدراسات كيفية دوران الآلة بين الحالات النشطة.

بالنظر إلى الجدول الزمني للأحداث على GroEL الذي يمليه ارتباط ATP والتحلل المائي ، يصبح من الواضح أن البروتينات غير الأصلية مغلفة في رابطة الدول المستقلة يحتوي المجمع الثلاثي على مقدار محدد من الوقت ، 15 ثانية ، للوصول إلى الحالة الأصلية قبل تعطيل مجمع chaperonin النشط القابل للطي. يبدو أن جزءًا معينًا فقط من جزيئات البولي ببتيد غير الأصلية المقيدة يمكن أن تصل إلى الحالة الأصلية أو التشكل الملتزم بالحالة الأصلية (أي ، لم يعد يمكن التعرف عليه بواسطة GroEL) خلال هذا الوقت. لكن الجزء المتبقي يفشل في الوصول إلى الشكل الأصلي ويتطلب إما جولة أخرى من التفاعل مع GroEL أو ، في الخلية ، التفاعل مع المرافقين الآخرين أو مع البروتياز. الاحتمال الأخير يبدو مهمًا بشكل خاص لإزالة البروتينات التالفة لمنع انسداد آلية المرافق. يظهر هذا الجزء غير الأصلي في جزء كبير منه على أنه يتم تفريغه من GroEL ، كما يتضح من عدد من التجارب ، لا سيما تلك التي تستخدم جزيء "trap" - وهو شكل متحور أو معدل من GroEL يمكنه الارتباط ولكن لا يطلق البروتينات غير الأصلية. كشفت إضافة مثل هذه الجزيئات إلى تفاعل الطي بشكل متكرر عن معدل إطلاق الرودانيز ، على سبيل المثال ، أي ما يقرب من 10 أضعاف معدل إعادة الطي. وبالتالي ، فإن جزءًا كبيرًا من الأشكال غير الأصلية ، إن لم يكن كلها ، يتم تفريغها من المرافقة أثناء جولة تفكك رابطة الدول المستقلة مجمع (76 ، 79 ، 80 ، 81 ، 82 ، 83). لقد تم طرح السؤال حول ما إذا كانت إعادة ربط هذه الأشكال تحدث في التشكل الذي تقدم نحو الحالة الأصلية أو ما إذا كانت هذه عملية الكل أو لا شيء ، حيث تبدأ كل جولة من الطي من نفس التشكل غير الأصلي أو ما شابه. قد يجادل الدليل المتوفر حول هذا الأخير ، حيث يبدو أن تكوين البروتين غير الأصلي المرتبط بعد الانتقال إلى جزيئات GroEL الأخرى يتوافق مع ذلك المرتبط في البداية بـ chaperonin (56 ، 80).


يعزز GroEL المؤتلف الحماية الواقية بواسطة المستضد ضد عصيات الجمرة الخبيثة تحدي بوغ

عدوى الاستنشاق القاتلة الناجمة عن عصيات الجمرة الخبيثة ينتج عن دورة مُمْرِضة معقدة تنطوي على إطلاق البكتيريا للسموم التي تنبت من الأبواغ. تتكون اللقاحات المتاحة حاليًا ضد الجمرة الخبيثة من مستضد وقائي (PA) ، أحد مكونات سم الجمرة الخبيثة. ومع ذلك ، فإن هذه اللقاحات القائمة على PA هي وقائية جزئية فقط ضد تحدي الجراثيم في الفئران. هذا يدل على أن الاستنباط الحصري للعيار العالي المضاد لـ PA لا يرتبط مباشرة بالحماية. هنا ، نوضح أن إدراج GroEL لـ الجمرة الخبيثة مع PA يولد حماية معززة ضد تحدي أبواغ الجمرة الخبيثة في الفئران. تم تضمين GroEL حيث تم الإبلاغ عن وجوده على كل من exosporium وفي الإفراز بالإضافة إلى سطح الخلية من الجمرة الخبيثة. كما وجد أنه يحمي من مسببات الأمراض الأخرى. في هذه الدراسة ، كان التحصين مع GroEL وحده قويًا بدرجة كافية للحث على استجابة خلطية عالية وخلوية ، وأدى بشكل كبير إلى إطالة متوسط ​​الوقت حتى الموت في الفئران التي تعاني من البوغ. كمستضد سطحي ، أظهر طين الجراثيم باستخدام مضاد لـ GroEL IgG زيادة في امتصاص الجراثيم المعالجة وبالتالي تسريع معدل تدمير الجراثيم بواسطة الخلايا البلعمية مما يؤدي إلى حماية الفئران. وجدنا أن GroEL كان قادرًا على تعزيز إطلاق أكسيد النيتريك من الخلايا الليمفاوية وأيضًا تقليل الحمل البكتيري من الأعضاء ، ربما من خلال تنشيط الضامة والإفراط في التعبير عن بعض مستقبلات المناعة الفطرية. لذلك ، تؤكد الدراسة الحالية أن GroEL هو جهاز مناعي فعال ضد الجمرة الخبيثة عدوى.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


طي البروتين: فهم رقصة المرافقين

البروتينات هي لبنات البناء الجزيئية وآليات الخلايا وتشارك عمليًا في جميع العمليات البيولوجية. لإنجاز مهامهم ، يجب أن يتم طيهم في هيكل ثلاثي الأبعاد معقد. قام علماء من معهد ماكس بلانك للكيمياء الحيوية (MPIB) في مارتينسريد بالقرب من ميونخ بألمانيا ، بتحليل أحد اللاعبين الرئيسيين في عملية الطي هذه: المرافقة الجزيئية DnaK. يقول أولريش هارتل ، مدير MPIB: "إن فهم هذه الآليات له أهمية كبيرة في ضوء العديد من الأمراض التي ينحرف فيها الطي ، مثل مرض الزهايمر أو مرض باركنسون".

تم نشر عمل الباحثين الآن في تقارير الخلية.

البروتينات مسؤولة عن جميع الوظائف البيولوجية تقريبًا. تصنع خلايا جسم الإنسان باستمرار آلاف البروتينات المختلفة في شكل سلاسل من الأحماض الأمينية. لكي تكون هذه السلاسل مفيدة بيولوجيًا ، يجب أن يتم طيها في نمط معقد ثلاثي الأبعاد. عندما تسوء هذه العملية الصعبة ، يمكن أن تؤدي إلى تكتلات بروتينية غير مجدية أو حتى خطيرة. لذلك طورت جميع الخلايا ، من البكتيريا إلى الإنسان ، شبكة من المرافقات الجزيئية ، والبروتينات نفسها ، والتي تساعد البروتينات الأخرى على الانطواء بشكل صحيح.

لقد حقق علماء MPIB الآن في تنظيم هذه الشبكة في بكتيريا Escherichia coli. باستخدام التحليلات البروتينية ، يُظهرون كيف تتعاون المرافقون المختلفون أثناء عملية الطي. يوضح أولريش هارتل: "حددنا بروتين Hsp70 DnaK باعتباره اللاعب المركزي للشبكة". "إنها تعمل كنوع من القرص الدوار." يرتبط DnaK بحوالي 700 سلسلة بروتين مختلفة أثناء تصنيعها. علاوة على ذلك ، يتوسط DnaK في طي معظم سلاسل البروتين هذه. يتم نقل تلك التي لا يمكن طيها إلى مرافق آخر ، وهو GroEL على شكل برميل. GroEL هي آلة طي عالية التخصص. إنه يشكل قفصًا نانويًا يتم فيه إحاطة سلسلة بروتين واحدة مؤقتًا والسماح لها بالثني بينما تكون محمية من التأثيرات الخارجية.

الاضطرابات في شبكة Chaperone

حقق الباحثون أيضًا في ما يحدث عندما تتعطل شبكة المرافق. على سبيل المثال ، عندما تتم إزالة GroEL من الخلايا ، تتراكم بروتينات العميل على DnaK ، والتي تنقلها بعد ذلك إلى البروتياز لتتحلل. يقول عالم الكيمياء الحيوية: "على ما يبدو ، يدرك DnaK أن سلاسل البروتين المتصلة لن تكون أبدًا قادرة على النضوج إلى جزيئات مفيدة". تتحكم شبكات المرافق المتشابهة ولكن الأكثر تعقيدًا في بروتينات الخلايا البشرية. إن فهم هذه التفاعلات له أهمية كبيرة في ضوء العديد من الأمراض العصبية التنكسية التي ينحرف فيها الطي.


تمويه كابيرونين

تنتقل العديد من الفيروسات بين النباتات في لعاب الحشرات الماصة للنسغ. لكن هذا عمل محفوف بالمخاطر - فالمليارات من جزيئات الفيروس لا تصنعه أبدًا. لذلك ، طورت بعض الفيروسات آليات معقدة لتحسين فرصها. على سبيل المثال ، ينتقل فيروس تجعد أوراق الطماطم الصفراء (TYLC) عن طريق الذباب الأبيض (Bemisia tabaci) بطريقة تنطوي على المرور عبر جسم الحشرة. الإبلاغ في علم الفيروسات (256، 75-84 1999) شاي مورين وآخرون. أظهر أن الفيروس ، في طريقه إلى النبات ، يستفيد من البكتيريا التي يحملها الذبابة البيضاء.

عندما تتغذى الذبابة البيضاء من نبات مصاب بفيروس TYLC (انظر الرسم البياني) ، فإن جزيئات الفيروس (الحمراء) تمر عبر جدار أمعاء الحشرة وإلى السائل (الدم اللمف) في تجويف جسمها. ربما لا يتكاثر الفيروس في الحشرة ، ولكن بمجرد دخولها ، تصل بعض الجزيئات الفيروسية إلى الغدد اللعابية (S). هنا يتم نقلهم إلى لعاب الحشرة ، حيث يمكن أن يصيبوا نباتًا آخر.

هذا الوضع الغريب للإرسال له مزاياه. يتم نقل معظم الفيروسات الأخرى التي تصيب النبات والتي تستخدم نواقل الحشرات لبضع ساعات أو أيام فقط في أجزاء فم الحشرة أو حلقها. تتساقط جزيئاتها عندما تطرد الحشرة هيكلها الخارجي. ومع ذلك ، فإن الذباب الأبيض الذي يصيب فيروس TYLC غالبًا ما يظل معديًا طوال حياته ، مما يزيد من احتمالات انتقال الفيروس إلى نبات آخر.

لكن المرور عبر الحشرة أمر خطير. تعمل الإنزيمات الموجودة في الهيموليمف على تحلل جزيئات الفيروس ، وهذا هو المكان الذي تساعد فيه البكتيريا. بوكنيرا تعيش البكتيريا ، التي توجد فقط في بعض الحشرات ، داخل خلايا حشرية متخصصة تُعرف باسم الخلايا الفطرية (الصفراء). تنتج هذه البكتيريا كميات كبيرة من بروتين يسمى GroEL (أزرق) ، يتسرب البعض منه إلى الدملمف. على الرغم من أننا لا نعرف سبب إطلاق GroEL ، يا مورين وآخرون. تبين أن جزيئات الفيروس تتجنب التحلل من خلال التفاعل مع هذا البروتين. GroEL هو مساعد - يرتبط بالبروتينات الأخرى ويساعدها على الانطواء. لذلك يمكن أن يغير شكل البروتينات الفيروسية ، ويمنعها من التحلل.

نوع آخر من الفيروسات يستخدم نفس خدعة النجاة تقريبًا. ينتقل فيروس أوراق البطاطس عن طريق حشرات المن. كما هو الحال مع فيروس TYLC ، فإن جزيئاته تمر عبر جسم الحشرة ، دون أن تتكاثر ، من الأمعاء إلى الغدد اللعابية. حشرات المن تحمل أيضا بوكنيرا البكتيريا ، و GroEL التي تنتجها هذه البكتيريا تحمي الجزيئات الفيروسية. ولكن في حين أن فيروس لفائف أوراق البطاطس يحتوي على جينوم الحمض النووي الريبي ، فإن فيروس TYLC له حمض نووي واحد ، وتسلسل جيناته وجزيئاته مختلفة تمامًا. لذا من الواضح أن هذه الفيروسات قد تقاربت على نفس الاستراتيجية بشكل مستقل.


& ltp> يوفر هذا القسم معلومات عن التركيب الرباعي للبروتين وحول التفاعل (التفاعلات) مع البروتينات الأخرى أو معقدات البروتين. & ltp> & lta href = '/ help / interaction_section' target = '_ top'> المزيد. & lt / a> & lt / p> التفاعل i

& ltp> هذا القسم الفرعي من & lta href = "http://www.uniprot.org/help/interaction٪5Fsection"> قسم "التفاعل" & lt / a> يوفر معلومات حول بنية البروتين الرباعي والتفاعل (التفاعلات) مع البروتينات الأخرى أو مجمعات البروتين (باستثناء تفاعلات المستقبلات الفسيولوجية التي تم شرحها في قسم & lta href = "http://www.uniprot.org/help/function٪5Fsection"> "الوظيفة" & lt / a>. & ltp > & lta href = '/ help / subunit_structure' target = '_ top'> المزيد. & lt / a> & lt / p> هيكل الوحدة الفرعية i

أوليغومر مكون من 14 وحدة فرعية مكونة من حلقتين مكدستين من 7 وحدات فرعية. يمكن أن يتزعزع المركب عندما يتم تحور Ala-2 و Glu-76 لمطابقة هذه البقايا في مرض السل (PubMed: 15327959).

التأكيد اليدوي على أساس التجربة في i

& ltp> هذا القسم الفرعي من '& lta href = "http://www.uniprot.org/help/interaction٪5Fsection"> Interaction & lt / a>' يقدم القسم معلومات حول تفاعلات البروتين الثنائي. البيانات المقدمة في هذا القسم هي مجموعة فرعية مصفاة الجودة من التفاعلات الثنائية المشتقة تلقائيًا من & lta href = "https://www.ebi.ac.uk/intact/"> قاعدة بيانات IntAct & lt / a>. يتم تحديثه في كل & lta href = "http://www.uniprot.org/help/synchronization"> إصدار UniProt & lt / a>. & ltp> & lta href = '/ help / binary_interactions' target = '_ top'> المزيد. & lt / a> & lt / p> التفاعلات الثنائية i

P0A6F5

GO - الوظيفة الجزيئية i

قواعد بيانات تفاعل البروتين البروتين

المستودع البيولوجي العام لمجموعات بيانات التفاعل (BioGRID)

ComplexPortal: مورد منسق يدويًا للمجمعات الجزيئية

قاعدة بيانات البروتينات المتفاعلة

قاعدة بيانات تفاعل البروتين ونظام التحليل

قاعدة بيانات التفاعل الجزيئي

STRING: شبكات رابطة البروتين الوظيفية


أساليب

الهدف من هذه الدراسة هو اختبار الاختلاف الوظيفي بين نسخ GroEL المختلفة في الكلاميديا وتقديم قائمة بمواقع الأحماض الأمينية التي قد تكون مسؤولة عن هذا الاختلاف الوظيفي ، وبالتالي تفصيل الاختلافات الوظيفية بين النسخ. بجانب من في السيليكو اختبار الاختلاف الوظيفي بين نسخ بروتين GroEL ، نحن مهتمون بالتقدير الكمي لهذا الاختلاف وتحديد آثار هذا الاختلاف في وظيفة كل نسخة. أخيرًا ، قمنا باختبار تأثير هذا الاختلاف على تفاعل نسخ GroEL مع عملاء البروتين المعتمدين مسبقًا على GroEL [31] وقمنا بتسليط الضوء على القيود الانتقائية التي تعمل في كل Paralog GroEL.

محاذاة التسلسل وتحليل النشوء والتطور

تم استرجاع ترميز تسلسل البروتين لـ GroEL1 (Ct110) و GroEL2 (Ct604) و GroEL3 (Ct755) من قاعدة بيانات GeneBank للأنواع المختلفة من الكلاميديا. يتم توفير التسلسلات وأسماء الأنواع وأرقام انضمام تسلسل ترميز البروتين في الجدول & # x200B الجدول 1 1 من الملف الإضافي 1. قمنا بمحاذاة تسلسل البروتين باستخدام برنامج ClustalX [35] مع الإعدادات الافتراضية. ثم قمنا بمحاذاة تسلسلات النوكليوتيدات التي تسلسل ثلاثة توائم من النيوكليوتيدات وفقًا لمحاذاة تسلسل البروتين المتعدد (المحاذاة متاحة من المؤلفين عند الطلب). جنبا إلى جنب مع غريل تسلسل الجينات حصلنا أيضًا على محاذاة لبروتينات العميل التي يظهر أنها تعتمد عليها بكتريا قولونية GroEL للحصول على تكوين بروتين إنتاجي (وظيفي) [31]. حصلنا على التسلسلات لكل واحد من الكلاميديا يتم توفير الأنواع أو السلالات من GenBank وأرقام المدخلات في الجدول & # x200B Table2 2 من الملف الإضافي 2. ثم قمنا بمحاذاة التسلسلات لكل واحد من جينات تشفير البروتين باتباع نفس الإجراء المفصل أعلاه.

فيما يتعلق بتحليلات علم الوراثة ، لكل واحدة من محاذاة التسلسل المتعددة ، استخدمنا لأول مرة ModelTest 1.3 [36] لتحديد مصفوفة معدل الاستبدال المرشح الأفضل لاستدلال الاحتمال الأقصى. حدد البرنامج بدقة TrN + I + G كخيار أول. استخدمنا بعد ذلك المخرجات التي تم إنشاؤها بواسطة ModelTest كمدخل لبرنامج PAUP [26] واستنتجنا شجرة النشوء والتطور ذات الاحتمالية القصوى للمحاذاة التي تحتوي على ثلاثة تسلسلات مختلفة لترميز البروتين GroEL باستخدام النهج التجريبي.

تحليل الاختلاف الوظيفي

لتحديد بدائل الأحماض الأمينية المسؤولة عن الاختلاف الوظيفي بين بروتينات GroEL ، اختبرنا الاختلاف الوظيفي من النوع الأول [37،38] في محاذاة تسلسل البروتين المتعدد الذي يحتوي على ثلاث نسخ مختلفة من GroEL الكلاميديا بعد كل حدث ازدواج جيني. تستخدم طريقة Gu إجراءً ذا احتمالية قصوى لاختبار ما إذا كان هناك تغيير كبير في معدل التطور بعد تكرار الجينات الذي أدى إلى اثنين من المتماثلات. تختبر هذه الطريقة الاختلاف الوظيفي عن طريق تقدير قيمة احتمالية تسجيل الفرضية بافتراض قيمة لمعامل الاختلاف الوظيفي (& # x003b8 & # x0003e 0) ومقارنة هذا الاحتمال مع ذلك في ظل فرضية عدم وجود اختلاف وظيفي (& # x003b8 = 0). نظرًا لأن كلا النموذجين متداخلين ، يمكن مقارنتهما باختبار نسبة الاحتمال (LRT) ، والذي يمكن تقريبه إلى توزيع & # x003c7 2 بدرجة حرية واحدة. إذا تم رفض الفرضية الصفرية للاختلاف غير الوظيفي ، يقوم البرنامج بحساب الاحتمال اللاحق (PP) لوظيفة يتم تصنيفها ضمن فئة الاختلاف الوظيفي. لقد أنشأنا قيمة قطع لـ PP وفقًا لتأثير إزالة مجموعات مواقع الأحماض الأمينية التي لها قيمة PP مساوية أو أعلى من قيمة القطع في & # x003b8 اختبار القيمة [38].

اختبرنا الاختلاف الوظيفي بين GroEL1 والمجموعة التي تحتوي على GroEL2 و 3 ، وبين GroEL2 و GroEL3 باستخدام برنامج Diverge الإصدار 2.0 [39]. ثم قمنا بعد ذلك بتعيين أحداث الاختلاف الوظيفي في شجرة النشوء والتطور بما في ذلك حدثا الازدواج اللذان أديا إلى ظهور نسخ بروتين GroEL الثلاث.

اختبار التطور المشترك بين نسخ GroEL

كان أحد الأسئلة التي كنا نهدف إلى الإجابة عليها هو ما إذا كان GroEL2 و GroEL3 قد تباعدا بالتساوي عن GroEL1 أو ما إذا كان أحدهما يقدم أدلة أقل على الوظائف المشتركة مع GroEL1. من الطرق الجيدة لاختبار هذه الفرضية فحص أنماط التطور المشترك بين نسخ GroEL المختلفة. كلما كان التطور المشترك أقوى بين البروتينات كلما زاد مقدار النمط التطوري المشترك وبالتالي زادت احتمالية مشاركة المزيد من الوظائف. لاختبار فرضية التطور المشترك بين البروتينات ، استخدمنا الطريقة غير المعلمية بناءً على معيار المعلومات المتبادلة (MIC) الذي طوره كوربر وزملاؤه [40]. يتم تمثيل المعلومات المتبادلة بواسطة الانتروبيا التي تتضمن التوزيع الاحتمالي المشترك ، P (sأنا، س'ي) ، لحدوث الرمز أنا في الموضع س و ي في الموضع س' لمحاذاة التسلسل المتعدد. ولدت قيم MIC نطاقًا بين 0 ، مما يشير إلى تطور مستقل ، وقيمة موجبة يعتمد حجمها على مقدار التباين المشترك. كانت المواضع المتغيرة المدرجة في المحاذاة والتي تم أخذها في الاعتبار في التحليلات التطورية المشتركة هي تلك البخل بالمعلومات (أي أنها تحتوي على نوعين على الأقل من الأحماض الأمينية ويحدث اثنان منها على الأقل بتردد اثنين على الأقل). تم تقييم أهمية قيم MIC عن طريق التوزيع العشوائي لأزواج المواقع في المحاذاة ، وحساب قيم MIC الخاصة بهم ومقارنة القيم الحقيقية مع توزيع مليون قيمة عشوائية. لتصحيح العديد من الاختبارات غير المستقلة ، قمنا بتنفيذ إجراء التقليب التنحي وصححنا الاحتمالات وفقًا لذلك [31]. يتم تنفيذ MICK في برنامج PECA (متاح من المؤلف المقابل عند الطلب).

اختبار اختلاف تفاعل البروتين البروتين بين نسخ GroEL وعملاء البروتين

كانت إحدى الفرضيات التي أردنا اختبارها هي ما إذا كان الاختلاف الوظيفي بين نسخ GroEL المختلفة ينطوي أيضًا على اختلاف في أنماط التطور المشترك مع عملاء بروتين GroEL المعروفين. لاختبار هذه الفرضية ، قمنا بتحليل التطور المشترك لكل نسخة من GroEL مع كل واحد من عملاء بروتين GroEL المعروفين باستخدام المنهجية الموضحة في القسم السابق. تم حساب قوة نمط التطور المشترك عن طريق تصنيف قيم MIC المهمة في الفئات (0.1 ، 0.15 ، 0.20 ، 0.25 ، 0.30 ، 0.35 ، 0.40 ، 0.45 ، 0.50 ، MIC & # x0003e 0.50). يتضمن 0.1 هنا كل أزواج مواقع الأحماض الأمينية بقيم MIC 0 & # x0003c MIC & # x02264 0.1 0.15 تشمل 0.1 & # x0003c MIC & # x02264 0.15 ، وهكذا دواليك. يسمح هذا التصنيف لقيم MIC بإجراء مقارنة مباشرة للنتائج التطورية المشتركة بين أزواج مختلفة من البروتينات بغض النظر عن مجموعة قيم MIC التي تم الحصول عليها في كل تحليل. لتحديد مساهمة كل فئة في قيمة MIC الإجمالية ، قمنا أولاً بحساب عدد أزواج المواقع التي تعرض قيم MIC ضمن تلك الفئة. قمنا بعد ذلك بحساب النسبة المئوية لأزواج المواقع المدرجة في تلك الفئة بقسمة عدد المواقع في الفئة على العدد الإجمالي لأزواج المواقع التي تم اكتشافها على أنها متداخلة بشكل كبير. بهذه الطريقة ، يمكن مقارنة مساهمة كل فئة MIC بين أزواج البروتينات.

تحليل القيود الانتقائية

تتمثل الخطوة الأخيرة في تحليل الاختلاف الوظيفي في رسم خرائط للقيود الانتقائية في بنية البروتين بعد كل حدث ازدواجية. اختبرنا هنا ما إذا كان الاختلاف الوظيفي ناتجًا عن التثبيت التكيفي لبدائل الأحماض الأمينية في مناطق البروتين الوظيفية في نسخ GroEL. لاختبار هذه الفرضية قمنا بتطبيق منهجيتين. أولاً ، طبقنا نهج النافذة المنزلقة القائم على البخل لاكتشاف القيود الانتقائية في جينات ترميز البروتين [41] ، والذي تم تنفيذه في برنامج SWAPSC الإصدار 1.0 [42]. باختصار ، يعرض البرنامج حجم النافذة الأمثل إحصائيًا على طول محاذاة التسلسل لاكتشاف القيود الانتقائية وتقدير احتمالية الاستبدالات لكل مواقع غير مترادفة (دن) والبدائل لكل المواقع المترادفة (دس). تم تحسين حجم النافذة عن طريق استخدام عدد من مجموعات البيانات المحاكاة. الطريقة القياسية لقياس شدة الاختيار عند تحليل تقلب الحمض النووي هي المقارنة دسإلى دن[43 ، 44]. النسبة بين السعرين (& # x003c9 = D N د ق MathType @ MTEF @ 5 @ 5 @ + = feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacH8akY = wiFfYdH8Gipec8Eeeu0xXdbba9frFj0 = OqFfea0dXdd9vqai = hGuQ8kuc9pgc9s8qqaq = dirpe0xb9q8qiLsFr0 = vr0 = vr0dc8meaabaqaciaacaGaaeqabaqabeGadaaakeaaiiGacqWFjpWDcqGH9aqpdaWcaaqaaiabdsgaKnaaBaaaleaacqWGobGtaeqaaaGcbaGaemizaq2aaSbaaSqaaiabdofatbqabaaaaaaa @ 34EE @) يساعد على توضيح إذا كان الجين إصلاح بدائل الأحماض الأمينية بشكل محايد (& # x003c9 = 1) ، تمت إزالة البدائل عن طريق تنقية التحديد (& # x003c9 & # x0003c 1) ، أو تم إصلاح الطفرات عن طريق التطور التكيفي (& # x003c9 & # x0003e 1). ومع ذلك ، فقد ثبت أن & # x003c9 هو مؤشر ضعيف لعمل التطور التكيفي بسبب حقيقة أن إشارات التطور التكيفي قد تغرق في خلفية تنقية الانتقاء الذي تطور بموجبه البروتين أكثر خلال وقته التطوري [44].

يستخدم SWAPSC & # x003c9 لتقدير شدة الاختيار الذي يعمل على منطقة ترميز البروتين في فروع معينة من الشجرة. استخدمنا 1000 مجموعة بيانات محاكاة في تحليلنا تم الحصول عليها باستخدام برنامج Evolver من حزمة PAML [36]. لإجراء عمليات المحاكاة ، أخذنا كمعلمات أولية متوسط ​​قيمة & # x003c9 ، ومعدلات الانتقال إلى التحويل وجدول الكودون الذي تم إنشاؤه بموجب نموذج Goldman and Yang ، باستخدام محاذاة التسلسل الحقيقي كمدخل. ثم يقوم البرنامج بتحريك النافذة على طول محاذاة التسلسل الحقيقي والتقديرات دنو دسمن خلال طريقة لي. يحدد البرنامج أهمية هذه التقديرات في ظل توزيع بواسون لبدائل النوكليوتيدات على طول المحاذاة.

بالإضافة إلى ذلك ، قمنا باختبار التطور التكيفي باستخدام النهج القائم على الاحتمال الأقصى المطبق في برنامج PAML v3.15 (Yang 1997). قمنا بعد ذلك بمقارنة قيمة احتمالية السجل لنموذج (نموذج Goldman and Yang ، يسمى هنا G & # x00026Y) [45] الذي يفترض & # x003c9 للمحاذاة الكاملة وشجرة النشوء والتطور بنموذج يقدر قيمة & # x003c9 لـ كل فرع من فروع شجرة النشوء والتطور (يسمى هنا نموذج النسبة الحرة FRM). قارنا قيمتي الاحتمالية باستخدام اختبار نسبة الاحتمالية (LRT) مع درجات الحرية التي تكون عدد الفروع في الشجرة ناقص 1.


تعليقات المراجعين

المراجع 1: مايكل جروميا

في هذا العمل ، قام المؤلفون بتحليل منهجي للاضطراب البنيوي في مجموعة من الكائنات الحية الصغيرة وأظهروا أن عددًا قليلاً من الوظائف المميزة مرتبطة بالاضطراب التوافقي. علاوة على ذلك ، اقترحوا أن هذه الوظائف تتوافق مع أهم الوظائف التي يؤديها الاضطراب البنيوي في الكائنات الخلوية. تم إجراء التحليل على نطاق واسع مع أمثلة محددة لبوليميراز RNA ، وبروتين chaperone ، وبروتينات ربط DNA أحادية الجديلة ، و DnaK وما إلى ذلك. العمل مثير للاهتمام والبيانات توفر رؤى جديدة.

يمكن معالجة التعليقات التالية من أجل التحسينات.

1. يمكن مناقشة النتائج التي تم الحصول عليها بمجموعة بيانات سلبية.

رد المؤلفين: نشكر المراجع على تقديره لعملنا واقتراحاته للتحسينات. لسنا متأكدين تمامًا مما يعنيه المراجع بمجموعة البيانات السلبية. نظرًا لأن البروتينات التي تم فحصها تكون صغيرة للغاية ، مما يؤثر على كل من عدد وطول البروتينات ، في بعض منها حتى البروتينات الأساسية المدرجة في الجدول 1 مفقود. أيضًا ، في العديد منها إما اختفت المناطق المضطربة أو تم تقصيرها إلى حد أنها لا تفي بمعاييرنا الخاصة بـ LDRs (رسم بياني 1 يشير إلى أنه على الرغم من أن المناطق المضطربة تكون أقصر في بعض الحالات ، إلا أنه يتم الحفاظ عليها في الغالب). الآن أضفنا أخصائيي تقويم العظام من البكتيريا المرجعية لمجموعات النشوء والتطور المختلفة لمعالجة ما إذا كانت المناطق المحددة مضطربة بشكل عام أو بسبب الطبيعة البسيطة للأنواع التي تم فحصها. نجد أن الكثيرين يعانون أيضًا من اضطراب في البروتينات المرجعية. الآن نتحقق أيضًا من صحة نتائجنا باستخدام طريقة أخرى للتنبؤ بالاضطراب.

2. يمكن تبرير القيمة الحدية البالغة 580 بروتينًا لانتقاء البروتينات ذات الاختزال الشديد في الجينوم.

رد المؤلفين: لقد اخترنا عتبة 580 لحجم البروتين لأنه فوق هذه العتبة كانت مجموعة البروتينات التي تم الحصول عليها منحازة للغاية تجاه أنواع الميكوبلازما. من خلال هذه العتبة ، تأكدنا من اختيار اثنين فقط من الميكوبلازما ، ولكن لا يزال يتم تمثيل المتعايشين الداخليين الملزمين من مجموعات النشوء والتطور المختلفة بشكل جيد. أيضًا ، فوق هذه العتبة إلى حد ما ، توجد بروتينات غير ميكوبلازما لم يتم فيها شرح البروتينات ، بل تم ترقيمها فقط وبالتالي لا يمكن استخدامها في هذا التحليل.

المراجع 2: زولتان جاسباري

تصف هذه الورقة بعض النتائج المهمة حول دور اضطراب البروتين الداخلي في الحد الأدنى من الجينوم. الأصل ويمكن أن يكون محل اهتمام الباحثين العاملين في المجال المعني. على الرغم من أنني أعتقد أن العمل يحتوي على نتائج جديدة ، إلا أن حجم البيانات المعالجة والمعلومات الجديدة المقدمة محدودة بعض الشيء. أعتقد أن مقدار التسلسلات التي تم تحليلها يجعل من الممكن إجراء دراسة أكثر تفصيلاً ، وأقدم بعض التوصيات لهذا أدناه والتي قد يفكر فيها المؤلفون في تحسين المخطوطة.

- استخدم المؤلفون خوارزمية تنبؤ واحدة (IUPred) ، وعتبة واحدة (0.5) لتصنيف المخلفات وواحدة (20 أأ) لتحديد المناطق الطويلة. حيثما ينبغي اتخاذ مثل هذه الاختيارات الذاتية بالضرورة ، قد يكون من المهم إثبات قوة الاستنتاجات الرئيسية من خلال تكرار التحليل مع بعض المتغيرات المتنوعة. يمكن للكتاب تقديم مثل هذه الاعتبارات؟

رد المؤلفين: نشكر المراجع على تقديره لعملنا واقتراحاته للتحسين. IUPred هي طريقة مستخدمة على نطاق واسع وموثوق بها تُظهر توافقًا جيدًا مع تنبؤات الإجماع التي تم الحصول عليها بناءً على العديد من الطرق المختلفة. في العديد من التحليلات السابقة ، كررنا نحن وآخرون التنبؤات بطرق مختلفة وتم الحفاظ دائمًا على الاتجاهات المحددة. لهذا السبب اعتقدنا أن طريقة واحدة موثوقة يجب أن تكون كافية للإشارة إلى مثل هذه الميول. أيضًا ، من المعروف أن بعض الطرق التي يمكن استخدامها محليًا على البروتينات الكاملة ، على سبيل المثال VSL2B تتنبأ بأنماط متشابهة جدًا ولكن بقيم مطلقة مرتفعة ، مما يعني أنها عادة ما تبالغ في تقدير عدد ومدى المناطق المضطربة مقارنة بأنماط اضطراب الإجماع. في هذا التحليل ، ليس من المرغوب بالتأكيد الإفراط في التنبؤ لأننا أردنا العثور على مجموعة مناطق البروتين التي تحافظ باستمرار على طبيعتها المضطربة. من وجهة نظرنا ، من الأفضل الحصول على مجموعة مناطق محدودة نسبيًا ولكنها مستقرة ، بدلاً من الحصول على مجموعة أكبر مخففة بحالات إيجابية كاذبة. الآن كررنا التحليل باستخدام طريقة تنبؤ أخرى ، ESpritz X-ray ، ووجدنا اتجاهات مشابهة جدًا كما هو موضح في الفقرة الأخيرة من قسم النتائج.

القيمة الحدية المنشورة لـ IUPred والتي تميزت بين المناطق المطوية والمضطربة الأفضل هي 0.5 ، وهذه ليست قيمة اعتبرناها متغيرة. في رسم بياني 1 ومع ذلك ، فقد قمنا أيضًا بتسليط الضوء على المخلفات مع درجة تنبؤ & gt0.4 ولكن & lt0.5 لإظهار أن درجات الاضطراب في كثير من الأحيان لا تنخفض بشدة ، وبالتالي عادةً ما تتلقى البقايا المحيطة أو المتداخلة بالمناطق المضطربة المتوقعة درجات متوقعة تشير إلى مرونة عالية.

لقد حاولنا الآن البحث عن مناطق أطول من 30 بقايا متتالية. فقط 7 بروتينات ريبوزومية و 4 بروتينات غير ريبوسومية احتفظت بـ LDRs لما لا يقل عن 30 بقايا متتالية في ثلاثة كائنات حية صغيرة على الأقل من اثنين على الأقل من الكتل البكتيرية الممثلة. أضفنا اثنين ملف إضافي 1: الجدولين S3 و S4 لإظهار النتائج بهذه المعلمة ، وكذلك وصف تلك الموجودة في المخطوطة.

لم نرغب في البحث عن مناطق & lt20 بقايا لأن هذه لا يمكن اعتبارها LDRs (على الأقل لا نعرف أي تحليل في أدبيات المعرف حيث تم اعتبار & lt20 مناطق طويلة من المخلفات LDRs). وهكذا بدا أن 20 من البقايا كخيار مثالي. على سبيل المثال ، المنطقة الطرفية C لـ GroEL هي فقط ما بين 15 و 25 وحدة بنائية في معظم الكائنات الحية بغض النظر عن حجم البروتين ، والذي يكون مقيدًا على الأرجح بحجم التجويف الداخلي. توضح التجارب المتعددة مع طفرات الحذف لهذه المنطقة أن LDRs الحقيقية الشبيهة بالمجموعة والتي تضم حوالي 20 وحدة بنائية يمكن أن تؤدي وظائف حاسمة (انظر مراجع الأدبيات [36–39]).

- قد يكون من المهم تحليل بعض عائلات البروتين مع مناطق LDR بمزيد من التفصيل قليلاً ، بما في ذلك التسلسلات من الكائنات الحية ذات الجينوم غير الأدنى. قد تكون هناك أنماط مثيرة للاهتمام في وجود / عدم وجود LDRs التي تظهر فقط في مجموعة بيانات أكبر.

رد المؤلفين: ونحن نتفق. قمنا بتوسيع التحليل ، الجدول 1 ، وجميع الجداول الإضافية ومحاذاة رسم بياني 1 مع أخصائي تقويم العظام من البكتيريا المرجعية غير الحد الأدنى كما هو موضح أدناه.

- بشكل عام ، يمكن أن تستفيد الدراسة من استخدام بعض "الكائنات المرجعية" مع جينوم غير محدود من جميع المجموعات التي تم فحصها. قد يكون من المثير للاهتمام ما إذا كانت أي ميزة قد ترتبط بكونها في الحد الأدنى من الجينوم.

رد المؤلفين: ونحن نتفق. قمنا بتوسيع التحليل ، الجدول 1 ، وجميع الجداول الإضافية ومحاذاة رسم بياني 1 مع بعض الكائنات المرجعية ، وهي Escherichia coli (سلالة K12) التي تمثل Proteobacteria ، و Bacteroides vulgatus (سلالة ATCC 8482) التي تمثل Bacteroidetes ، و Bacillus subtilis (سلالة 168) التي تمثل Clade Firmicutes. من Tenericutes ، لم نقم بتضمين بروتين مرجعي لأن أفضل تمثيل له هو Mycoplasmas ، والذي تم تضمينه في مجموعة البيانات على أي حال. ومع ذلك ، لم نقبل المزيد من نتائج البروتين التي تظهر فقط اضطرابًا في البروتينات المرجعية لأننا كنا مهتمين صراحةً بالبروتينات / مناطق البروتين التي تحافظ على طبيعتها المضطربة بعد التقليل الشديد من الجينوم. نحن نستخدم البروتينات المرجعية فقط لإثبات أن LDRs المحددة موجودة أيضًا في الغالب أيضًا وبالتالي فهي ليست نتيجة لتقليل الجينوم أو التغييرات التطورية السريعة المرتبطة وعدم استقرار البروتينات.

- قد يرغب المؤلفون في التعليق على ما إذا كانت جميع مناطق LDRs المحددة مناطق مضطربة "حقيقية" وليست ملفات ملفوفة أو أجزاء أخرى يُتوقع عادةً أنها غير منظمة.

رد المؤلفين: نحن لا نعرف عن المناطق التي تم الكشف عنها بشكل ضئيل داخل وحدات البوليميراز الفرعية b و b 'و FtsH ، لأن هذه المناطق ليست مضطربة باستمرار ولم يتم ذكرها في الأدبيات على هذا النحو. ومع ذلك ، تم فحص المناطق الأخرى التي حددناها ، والتيول الطرفية C لـ DnaK ، و GroEL ، ورابط داخل RpoD و N-terminus من GrpE و InfB ، بالإضافة إلى منطقة الذيل لـ SSB وكلها `` أصلية '' المناطق المضطربة ، والتي تتوافق مع المناطق المفقودة في هياكل PDB المعنية ، كما هو موضح الآن في المخطوطة.

- لم يتم وصف كيفية تحديد المؤلفين لأخصائيي تقويم العظام على أنهم أسماء جينية / بروتينية قد لا تكون قاطعة. يرجى التعليق على هذا لأن هناك العديد من المتجانسات / أطباء تقويم العظام المفقودين المشار إليهم في الجدول 1.

رد المؤلفين: لقد حددنا في الواقع أخصائيي تقويم العظام بناءً على أسماء الجينات والبروتينات ، لأننا وجدنا أنه في حالة هذه الكائنات الحية الصغيرة والبروتينات المهمة المرتبطة بها ، كانت تلك الأشياء حاسمة. عندما نفتقد بروتينات بالغة الأهمية ، كنا نحاول أيضًا التعرف على تلك البروتينات المصابة بالانفجار ، لكن لم نتمكن من العثور عليها أبدًا. على سبيل المثال ، فوجئنا برؤية أن GroEL كان مفقودًا في الميكوبلازما اللذين ليسا حتى من بين أصغر البروتينات ، ومع ذلك لم نتمكن من العثور على أي تسلسل يشبه GroEL وأخيرًا وجدنا منشورات تفيد أنه في العديد من الميكوبلازما ، فإن نظام GroEL-GroES مفقود تمامًا (وونغ بي وهوري ، واشنطن ، 2004). لذا فإن المتجانسات / المتعاملين المفقودين في الجدول 1 مفقودة حقًا نتيجة لتقليل الجينوم وليس بسبب التعليقات الخاطئة.

- قد يرغب المؤلفون في التعليق على البروتينات التي تحتوي على LDRs الموجودة في بروتين واحد فقط من البروتينات التي تم فحصها. قد يكون من المهم ما إذا كانت هذه البروتينات مرتبطة بأي شكل من الأشكال بالتواجد في الحد الأدنى من الجينوم.

رد المؤلفين: هذا اقتراح مثير للاهتمام ولكن من وجهة نظرنا سيكون هذا خارج نطاق مذكرة الاكتشاف هذه. لم نحدد أي شيء يبدو محددًا للحد الأدنى من الجينومات ، ولكن من المدهش أن لديهم العديد من الجينات / البروتينات المفترضة فيما يتعلق بطبيعتها في أضيق الحدود. بعض هؤلاء مضطربين. نظرًا لأن العديد من الأعمال تشير إلى أن بروتيناتهم تحتاج إلى مساعدة مكثفة من المرافقين ، فقد كنا نخمن أنه من بين تلك البروتينات المفترضة قد يكون هناك مرافقات مضطربة ، لكن لا يمكننا إثبات هذا الافتراض. أيضًا ، نحن مقيدون بشدة بكل من طول النص وعدد عناصر العرض ، لذلك نود التمسك بالفكرة الأصلية ، وهي البحث عن المناطق المضطربة باستمرار في مجموعات النشوء والتطور المختلفة بعد تقليل الجينوم على نطاق واسع.

- الصفحة 5 ، السطر 39: خطأ إملائي في "عامل بدء الترجمة".

رد المؤلفين: نشكر هذه الملاحظة ، صححنا الخطأ.

- يمكن دمج ملفي xls الإضافيين في ملف واحد مع وجود البيانات في علامتي تبويب.

رد المؤلفين: نشكر هذه الملاحظة ، والآن يتم ترتيب جميع الجداول الإضافية التي تحتوي على بيانات IUPred كعلامات تبويب لملف Excel واحد وتلك التي تحتوي على ESpritz يتم جمعها في ملف آخر.

المراجع 3: ساندور بونجور

تسلط مخطوطة Pancsa و Tompa الضوء على حقيقة أنه في الكائنات الحية ذات الحد الأدنى من الجينوم ، ترتبط وظائف البروتين الأساسية بالاضطراب البنيوي. الرسالة مكتوبة بشكل جيد ومفهومة. الأرقام واضحة.

أشعر أنه يمكن جعل الرسالة أكثر إيجازًا من خلال التأكيد على بعض الجوانب التي قد لا تكون واضحة على الفور لجمهور أوسع. على سبيل المثال ، 1) لماذا تم اختيار مجموعة من 13 بروتينًا؟ هي النتيجة - أي. مجموعة البروتينات التي وجدت حساسة للاختيار؟ تتضمن قائمة NCBI للجينومات الكاملة (المشروحة) أكثر من 80 من المتعايشين الداخليين. بمزيد من التفصيل ، تم تحسين مجموعة بيانات Mazumder لتشابه التسلسل وكذلك المعايير الببليوغرافية في سياق جميع البروتينات ، بينما قد تكون التغطية التصنيفية ضمن مجموعة الكائنات الحية المختارة (الحد الأدنى من الجينوم) أكثر صلة بهذا العمل ، على الأقل وفقًا لهذا العمل. المراجع. تنص الورقة الأصلية لـ Mazumder et al على أن CMT55 متفوق على توزيعات dbase الأخرى في هذا الصدد - هل يمكن للمؤلف شرح سبب اختيار مجموعة بيانات CMT15؟

رد المؤلفين: نشكر المراجع على تقديره لعملنا واقتراحاته للتحسين. لقد اخترنا مجموعة بيانات CMT15 لأنها تحتوي على أنواع مشروحة جيدًا ، تم تعيين مجموعة النشوء والتطور الخاصة بها. على الرغم من أن مجموعة البيانات هذه أصغر من CMT55 ، إلا أن جودة التعليقات التوضيحية أفضل بكثير. بالنسبة للبكتيريا ، تتطابق مجموعة بيانات CMT55 مع قائمة البروتينات المرجعية لـ UniProt التي تحتوي حاليًا على 4159 بروتينًا (UniProt 08_2016). بالعودة إلى عام 2011 عندما تم نشر ورقة Mazumder ، كان لديهم إجماليًا 637 بروتينًا فقط في مجموعة بيانات CMT55 ، بينما أصبح الآن أكثر من 5000. إن توسيع مساحة التسلسل سريع جدًا بحيث لا يمكن لإجراءات التعليقات التوضيحية اللحاق بها بعد الآن. لذلك ، على الرغم من وجود المزيد من البروتينات في CMT55 ، إلا أن العديد من هذه البروتينات ليست مشروحة جيدًا ، والعديد منها يأتي من عينات بيئية ، وهناك العديد من الأنواع الممثلة من نفس الجنس ، لذلك فهي زائدة عن الحاجة ، وهناك العديد من الأنواع غير المصنفة التي تنتمي إلى مجموعة النشوء والتطور. غير معروف (على سبيل المثال ، هناك بروتينات مرجعية متعددة بأرقام GW تسمى بكتيريا مجموعة Parcubacteria أو بكتيريا مجموعة Microgenomates). أيضًا ، وجدنا العديد من الأخطاء التي من المحتمل أن تؤثر على مجموعة البيانات الخاصة بنا ، على سبيل المثال تحت كود UniProt UP000064377 ، يوجد Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis str. تم تعيين أنواع LA5 كبروتين مرجعي مع 102 بروتين فقط. كان من الواضح أن هذا التعليق التوضيحي لا يمكن أن يكون صحيحًا ، لأن أنواع السالمونيلا المعوية عادة ما تحتوي على جينومات وبروتينات ضخمة مع بروتينات & gt5000. لقد تحققنا من هذا الإدخال واتضح أنه يحتوي فقط على بروتينات البلازميد المعني. على الرغم من وجود أخطاء يسهل تحديدها وتصفيتها ، إلا أن هناك أيضًا أخطاء أقل في التعليقات التوضيحية الصاخبة والتي لن تظهر بالضرورة في خط أنابيب تحليل البيانات الآلي المستخدم هنا ، لذلك قررنا استخدام مجموعة بيانات CMT15 الأصغر ولكن الأفضل والموثوقة والأكثر موثوقية . بالنسبة للبروتينات التي نستخدمها ، فإن الجينات والبروتينات موضحة جيدًا أيضًا ، لذلك يمكننا الاعتماد على أسماء الجينات والبروتينات المشروحة ، بينما بالنسبة للعديد من البروتينات المرجعية لمجموعة بيانات CMT55 ، يتم ترقيمها فقط بدون معلومات عن وظيفة البروتين مهما يكن. أخيرًا ، إذا كنت تستخدم مجموعة بيانات أكبر بكثير ، فلن نتمكن من إظهار جدول البيانات المقابل في المخطوطة ، ولا لتصوير المحاذاة الكاملة لأخصائيي تقويم العظام.

ب) هل أخصائيو تقويم البروتينات المحددة الموجودة في الجينوم غير المختزل مضطربًا أيضًا؟

رد المؤلفين: بالنسبة للوحدات الفرعية للبوليميراز ، لم نعثر على أي دليل أدبي حول المناطق المضطربة المحفوظة ، ولكن بالنسبة إلى DnaK و DnaJ و GroEL و GrpE و SSB وعامل بدء الترجمة 2 (infB) وعامل إطلاق سلسلة الببتيد 1 (prfA) هناك تحليلات في الأدبيات وهياكل البروتين المتاحة التي تدعم أن المناطق المعنية مضطربة في تقويم العظام من الجينوم غير المختزل. الآن قمنا بتضمين ثلاثة بروتينات بكتيرية مرجعية تمثيلية في التحليل لإظهار حالة الاضطراب في المناطق المحددة في تلك المناطق وذكر هياكل البروتين المقابلة.

ج) يعتمد تحديد البروتينات المضطربة على التنبؤ بالامتدادات الطويلة المضطربة. هل يؤثر حد الطول واختيار برنامج التنبؤ على النتائج؟ هل تعطي طريقة التنبؤ المختلفة تنبؤات وظيفية مختلفة؟

رد المؤلفين: لقد أجبنا بالفعل على أسئلة مماثلة لـ Zoltan Gaspari أعلاه. الطول يؤثر بالتأكيد على النتائج. مع حد أدنى من LDR يبلغ 30 بقايا متتالية ، وجدنا مناطق مضطربة أقل حفظًا ، لكن 7 بروتينات ريبوزومية و 4 بروتينات أخرى لا تزال تحتفظ بـ LDRs في أكثر من كليد بكتيري واحد (انظر المضافة حديثًا) ملف إضافي 1: الجدول S3 و S4.

يبدو أن عشرين من البقايا هي الخيار المثالي لـ LDR. لم نرغب في البحث عن مناطق & lt20 مخلفات لأنه لا يمكن اعتبارها LDRs.

الآن كررنا التحليل باستخدام طريقة توقع محافظة أخرى ، ESpritz X-ray ، ووجدنا ميولًا متشابهة جدًا. يرجى الاطلاع على الفقرة الجديدة قبل قسم المناقشة.

3) هل يمكن للمرء تعيين أهمية إحصائية للنتائج ، على سبيل المثال ببساطة عن طريق تكرار التنبؤات بسلسلة من مجموعات فرعية من البروتينات المختارة؟

رد المؤلفين: ربما يمكننا تخصيص دلالة إحصائية لكننا لا نعتقد أنها ضرورية. يتراوح متوسط ​​جزء المخلفات المضطربة في هذه البروتينات بين 1 و 12٪ ، بمتوسط ​​3.7٪ منخفض للغاية مقارنة بالكائنات الأخرى (Pancsa and Tompa ، 2012). كان عدد LDRs التي تم تحديدها بين 1 و 57 في 13 من البروتينات الدنيا بما في ذلك بروتينات الريبوسوم ، ولكن فقط من 0 إلى 41 باستثناء بروتينات الريبوسوم (بمتوسط ​​17 و 7 مناطق ، على التوالي). فرصة اختيار نفس 20 قطعة من البروتين الطويل بشكل متكرر عن طريق الصدفة (دون افتراض الحفظ التطوري للاضطراب في تلك المناطق) منخفضة بشكل مهم. لا نعتقد أننا يجب أن نفرض الإحصائيات على ذلك ، خاصة أننا ملزمون بقيود الطول الصارمة لتنسيق ملاحظة الاكتشاف. من الواضح أن معظم المناطق المحددة هنا (باستثناء تلك الموجودة في وحدات البوليميراز الفرعية و FtsH التي ظهرت في مناطق مختلفة من البروتينات المتعامدة) تمثل مناطق مضطربة محفوظة تطوريًا لا تظهر فقط بسبب أخطاء التنبؤ أو التعليقات التوضيحية. نوضح الآن أن المناطق المعنية يتم تحديدها بشكل مستقل عن طريقة التنبؤ المستخدمة وأنها أيضًا مضطربة في الغالب في البكتيريا المرجعية غير الحد الأدنى من الكتل المتنوعة.


شاهد الفيديو: البكتيريا الشقية البكتريا المقاومة (كانون الثاني 2022).