معلومة

كيفية عزل اثنين من البلازميدات من الإشريكية القولونية حبلا؟


لدي سلالة من خلايا الإشريكية القولونية أستخدمها للتعبير عن بروتين باستخدام نظامين من البلازميد. واحد يمنح AmpR وواحد KanR.

بالنسبة للطفرات ، أود فصل البلازميدات لزيادة كفاءة تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل المسبب للطفرات. لقد تمكنت من علاج خلايا بلازميد KanR لأنه نسخة منخفضة بينما AmpR نسخة عالية لذا يمكنني بسهولة زراعة الخلايا في الأمبيسلين فقط وانتهى بي الأمر ببلازميد AmpR فقط. ومع ذلك ، لم أتمكن من فعل الشيء نفسه لعزل بلازميد KanR.

كانت فكرتي التالية هي تشغيل البلازميدات من خلال مادة هلامية والقيام بعملية الاستخراج. نظرًا لأنني لم أقم بعملية هضم ، كان من الصعب جدًا التمييز بين العصابات وانتهى بي الأمر بالحصول على عائد ضئيل. أعتقد أن البلازميدات تم تلطيخها ببساطة من خلال الهلام بسبب الهياكل الثلاثية.

أملي الأخير هو إجراء عملية هضم على البلازميدات باستخدام إنزيم تقييد يقطع كل بلازميد مرة واحدة. ما يقلقني هو أنني لن أكون قادرًا على الحصول على القياس المتكافئ بشكل صحيح بسبب وجود البلازميدات بشكل متزامن بتركيزات مختلفة إلى حد كبير.

هل لدى أي شخص أي نصائح حول كيف يمكنني عزل البلازميدات؟ أو ربما هل لدى أي شخص خبرة في إجراء هضم على البلازميدات بتركيزات غير معروفة؟ أنا حقا بحاجة للمساعدة في القيام بذلك. استمر مشروع الطفرات منذ شهور ، وهذا ليس حتى معمل بيولوجيا جزيئية ... لذا فهو يصرف الوقت عن أهداف البحث الرئيسية!


يجب أن تحصل على إعادة التحويل إلى بلازميد نقي. قم بتحويل مزيج البلازميد إلى بكتريا قولونية فارغة (لا تستخدم الكثير من الحمض النووي) ، طبق على Kan / Amp اعتمادًا على ما تحتاجه. إن احتمال أن تكون خلية واحدة قد تناولت كلا البلازميدات منخفضة للغاية ، ويمكنك التحقق من المستعمرة PCR للتأكد فقط.

بخلاف ذلك: اسأل حولك ، يجب أن يكون هناك مخزون (قديم) من البلازميدات المفردة حوله ، أو مخزونات الجلسرين من الإشريكية القولونية التي تحتوي على واحد فقط من البلازميدات.

الخيار الثالث: الق نظرة على طريقة الطفرات الخاصة بك. لتلبية احتياجاتك ، قد تكون هناك تقنيات حول ذلك ستعمل على مزيج من البلازميدات. إذا كنت تحتاج فقط إلى متغير واحد أو مكتبة تشبع موقع واحد ، فيمكنك استخدام Quikchange على سبيل المثال. لا أرى سببًا لعدم نجاح هذا على مزيج من البلازميدات.


تحليل البلازميد لعزلات Escherichia coli من كوريا الجنوبية المنتجة بشكل مشترك لـ NDM-5 و OXA-181 carbapenemases

في الآونة الأخيرة ، تم التعرف على عزل Escherichia coli المشترك في إنتاج New Delhi metallo-β-lactamase (NDM) -5 و oxacillinase (OXA) -181 في مستشفى الرعاية الثالثية في كوريا الجنوبية. تم جمع العزلة CC1702-1 من البول في يناير 2017 وتم استرداد العزلة CC1706-1 من نضح عبر القصبة لمريض في المستشفى في مايو 2017. تم التعرف على جينات Carbapenemase عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد والتسلسل ، وتم إجراء تسلسل الجينوم الكامل لاحقًا باستخدام PacBio نظام RSII. تنتمي كل من عزلات E. coli إلى نفس الاستنساخ (ST410) وكانت مقاومة لجميع β-lactam بما في ذلك carbapenems. حصلنا على متواليات بلازميد كاملة من العزلات: pCC1702-NDM-5 من CC1702-1 و pCC1706-NDM-5 و pCC1706-OXA-181 من CC1706-1. تنتمي عزلتا الإشريكية القولونية إلى نفس الاستنساخ (ST410) وكانت مقاومة تمامًا لجميع β-lactams ، وكذلك carbapenems. اثنان بلوخNDM-5تنتمي البلازميدات الموصلة إلى نفس مجموعة عدم التوافق ، IncFIA / B ، وتتألف من 79.613 نقطة أساس و 111.890 نقطة أساس مع 87 و 130 تسلسل ترميز على التوالي. التراكيب الجينية للـ blaNDM-5- تحمل البلازميدات ، والتي كانت متميزة عن البلازميداتNDM-5اختلفت البلازميدات الحاملة من عزلات Klebsiella pneumoniae التي كانت تنتقل سابقًا من الإمارات العربية المتحدة (الإمارات العربية المتحدة) إلى كوريا الجنوبية ، عن بعضها البعض. بينما أظهر pCC1702-NDM-5 درجة عالية من الهوية مع البلازميد من عزلة مقاومة للأدوية المتعددة من Citrobacter fruendii P5571 وجدت في الصين ، كان pCC1706-NDM-5 مشابهًا جدًا للبلازميد من عزلة مقاومة للأدوية المتعددة من E. coli AMA1176 وجدت في الدنمارك. كان pCC1706-OXA-181 ، الذي كان عبارة عن بلازميد IncX3 قابل للانتقال ذاتيًا بحجم 51 كيلو بايت ، مطابقًا لبلازميدات الإشريكية القولونية pAMA1167-OXA-181 من الدنمارك و pOXA-181-WCHEC14828 من الصين. البلازميدات تأوي blaNDM-5 في عزلات الإشريكية القولونية قد لا يتم نقلها من عزلات K. الرئوية المنتجة بشكل مشترك لـ NDM-5 و OXA-181. ربما نشأت من مصادر متعددة.

الكلمات الدالة: Carbapenemase New Delhi metallo-β-lactamase (NDM) -5 Oxacillinase (OXA) -181.


تجارب CRISPR-Cas للمدارس والعامة

يُحدث "مقص الجينات" CRISPR-Cas ثورة في مجال البيولوجيا الجزيئية مع تأثير هائل على المجتمع بسبب إمكانات التطبيق الواسعة في الطب الحيوي والتكنولوجيا الحيوية والزراعة. لقد طورنا تجارب CRISPR-Cas بسيطة يمكن أن تساعد في تعريف التلاميذ والطلاب وغير العلماء على حد سواء بالقوة الرائعة لتحرير الجينات المستهدفة. ينقسم المقرر التجريبي إلى قسمين. في الجزء الأول ، نستهدف lacZ المحمول بالبلازميد لتحويل الإشريكية القولونية الزرقاء إلى الإشريكية القولونية البيضاء. في الجزء 2 ، قمنا بتحليل فواصل حبلا مزدوجة CRISPR-Cas9 بوساطة في جين lacZ بواسطة أ) مستعمرة PCR ، ب) هلام تكسير المستعمرة أو ج) هضم تقييد البلازميدات. يتم تضمين العمل التجريبي في أجزاء المحاضرة النظرية القصيرة التي توفر خلفية عن CRISPR-Cas ودروسًا تعليمية خطوة بخطوة للعمل العملي. على الرغم من أن التجربة قوية وغير مكلفة وبسيطة ، تجدر الإشارة إلى أن التوجيه من قبل مدرب خبير مطلوب. بناءً على تجربتنا ، فإن دورة المختبر ليوم كامل لها تأثير إيجابي على موقف المشاركين تجاه البحث بشكل عام. هذا صحيح بالنسبة لطلاب المدارس الثانوية وكذلك غير العلماء (الفئات العمرية 16-70 سنة).

الكلمات الدالة: تجربة غرفة الصف CRISPR Cas9 E. coli Educational module lacZ.

حقوق النشر © 2019 Elsevier Inc. جميع الحقوق محفوظة.

بيان تضارب المصالح

إعلان عن تضارب المصالح يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل الوارد في هذه الورقة.


الأرقام

تحديد رقم نسخة البلازميد. نمت سلالة بكتيرية تحتوي على البلازميد في وسط قليل من الأملاح بالإضافة إلى أحماض الكازامينو والجلوكوز. تم تنفيذ الملصقات والتحلل ، وتم طرد المحللة في التدرج CsClethidium بروميد. تم جمع الكسور ذات السبعة قطرات على صواني ميكروترية ومعايرة النشاط الإشعاعي.

شكل 1

تحديد رقم نسخة البلازميد. نمت سلالة بكتيرية تحتوي على البلازميد في وسط قليل من الأملاح بالإضافة إلى أحماض الكازامينو والجلوكوز. تم تنفيذ الملصقات والتحلل ، وتم طرد المحللة في التدرج CsClethidium بروميد. تم جمع الكسور ذات السبعة قطرات على صواني ميكروترية ومعايرة النشاط الإشعاعي.


وصول

  • APA
  • اساسي
  • هارفارد
  • فانكوفر
  • مؤلف
  • BIBTEX
  • RIS

مخرجات البحث: المساهمة في المجلة ›المقال› مراجعة الأقران

T1 - تحليل تسلسل اثنين من البلازميدات المشفرة من Bifidobactenum longum DJO10A وبناء ناقل استنساخ مكوك

N2 - Bifidobacterium longum DJO10A هو عزل بشري حديث بخصائص بروبيوتيك ويحتوي على اثنين من البلازميدات ، pDOJH10L المعين و pDOJH10S. تم الآن تحديد التسلسل الكامل لكل من هذه البلازميدات ويتكون من جزيئين دائريين من الحمض النووي تبلغ قيمتهما 10073 و 3661 زوجًا أساسًا ، بمحتويات G + C بنسبة 62.2٪ و 66.2٪ على التوالي. البلازميد pDOJH10L عبارة عن بلازميد متكامل يتكون من مناطق DNA تظهر هوية تسلسل عالية جدًا لاثنين من بلازميدات B. longum الأخرى ، pNAC2 (98٪) و pKJ50 (96٪) ، جنبًا إلى جنب مع منطقة أخرى. ومن المثير للاهتمام ، أن مناطق التكرار الدائري المتداول (RCR) لكل من البلازميدات الشبيهة بـ pNAC2 و pKJ50 قد تعطلت أثناء حدث إعادة التركيب مما أدى إلى حدث إعادة تركيب إضافي للحصول على نسخة متماثلة وظيفية. يتكون هذا من جين rep مدمج جديد ونوع RCR يتكون من صندوق DnaA محفوظ في منطقة غنية بـ AT متبوعًا بأربعة متواليات متكررة متجاورة تتوافق مع بنية iteron وتكرار مقلوب. لم يكن لدى pDOJHIOS أي تشابه تسلسلي مع أي بلازميد آخر مميز من بكتيريا bifidobacteria. بالإضافة إلى ذلك ، لم يحتوي على أي ميزات متوافقة مع RCR ، وهي آلية النسخ المتماثل المقترحة لجميع بلازميدات bifidobacteria المميزة حتى الآن. لقد أظهر تشابهًا في التسلسل مع العديد من بروتينات النسخ المتماثل ذات الصلة بثيتا من بكتيريا أخرى إيجابية الجرام عالية G + C ، مع أقرب تطابق من بلازميد رودوكوكس رودوكروس ، مما يشير إلى آلية ثيتا للتكرار. كشف تحليل نوكلياز S1 لكل من البلازميدات في B. longum DJO10A عن وسيط DNA أحادي الخيط لـ pDOJH10L ، وهو ما يتوافق مع RCR ، ولكن لم يتم اكتشاف أي منها لـ pDOJH10S. نظرًا لأن محتوى G + C لـ pDOJH10S مشابه لمحتوى Rhodococcus rhodochrous (67٪) وأعلى بكثير من محتوى B. Longum (60.1٪) ، فقد يكون قد تم الحصول عليه من خلال نقل الجينات الأفقي من نوع Rhodococcus ، مثل كلا الأجناس هم أعضاء في الفطريات الشعاعية ويسكنون الأمعاء. بكتريا Escherichia coli-B. تم إنشاء ناقل استنساخ المكوك الطويل من pDOJH10S ومنطقة E.coll ori في p15A ، وجين lacZ مع موقع استنساخ متعدد لـ pUC18 ، وجين مقاومة الكلورامفينيكول (CAT) من pCI372 وتم تحويله بنجاح إلى E. coli و B. longum. لا يمكن إدخاله في بكتيريا حمض اللاكتيك (Lactococcus و Lactobacillus) ، مما يدل على أنه ليس منحل للغاية. تم الحفاظ عليه بثبات في B. longum في غياب ضغط المضادات الحيوية لمدة 92 جيلًا ، وهو ما يتوافق مع الاستقرار الفصلي للبلازميدات التي تتكاثر ثيتا في البكتيريا موجبة الجرام. هذا هو أول ناقل استنساخ للبكتيريا المشقوقة الذي لا يستخدم RCR ويجب أن يكون مفيدًا للإدخال المستقر للجينات غير المتجانسة إلى هؤلاء السكان المهيمنين في الأمعاء الغليظة.

AB - Bifidobacterium longum DJO10A هي عزلة بشرية حديثة بخصائص بروبيوتيك وتحتوي على نوعين من البلازميدات ، pDOJH10L المعين و pDOJH10S. تم الآن تحديد التسلسل الكامل لهذين البلازميدات ويتكون من جزيئين دائريين من الحمض النووي تبلغ قيمتهما 10،073 و 3661 زوجًا أساسًا ، بمحتويات G + C بنسبة 62.2٪ و 66.2٪ على التوالي. البلازميد pDOJH10L عبارة عن بلازميد متكامل يتكون من مناطق DNA تظهر هوية تسلسل عالية جدًا لاثنين من البلازميدات B. longum الأخرى ، pNAC2 (98٪) و pKJ50 (96٪) ، جنبًا إلى جنب مع منطقة أخرى. ومن المثير للاهتمام ، أن مناطق التكرار الدائري المتداول (RCR) لكل من البلازميدات الشبيهة بـ pNAC2 و pKJ50 قد تعطلت أثناء حدث إعادة التركيب مما أدى إلى حدث إعادة تركيب إضافي للحصول على نسخة متماثلة وظيفية. يتكون هذا من جين rep مدمج جديد ونوع RCR يتكون من صندوق DnaA محفوظ في منطقة غنية بـ AT متبوعًا بأربعة متواليات متكررة متجاورة تتوافق مع بنية iteron وتكرار مقلوب. لم يكن لدى pDOJHIOS أي تشابه تسلسلي مع أي بلازميد آخر مميز من بكتيريا bifidobacteria. بالإضافة إلى ذلك ، لم تحتوي على أي ميزات تتوافق مع RCR ، وهي آلية النسخ المتماثل المقترحة لجميع بلازميدات bifidobacteria المميزة حتى الآن. لقد أظهر تشابهًا في التسلسل مع العديد من بروتينات النسخ المتماثل ذات الصلة بثيتا من بكتيريا أخرى إيجابية الجرام عالية G + C ، مع أقرب تطابق من بلازميد رودوكوكس رودوكروس ، مما يشير إلى آلية ثيتا للتكرار. كشف تحليل نوكلياز S1 لكل من البلازميدات في B. longum DJO10A عن وسيط DNA أحادي الخيط لـ pDOJH10L ، وهو ما يتوافق مع RCR ، ولكن لم يتم اكتشاف أي منها لـ pDOJH10S. نظرًا لأن محتوى G + C لـ pDOJH10S مشابه لمحتوى Rhodococcus rhodochrous (67٪) وأعلى بكثير من محتوى B. Longum (60.1٪) ، فقد يكون قد تم الحصول عليه من خلال نقل الجينات الأفقي من نوع Rhodococcus ، مثل كلا الأجناس هم أعضاء في الفطريات الشعاعية ويسكنون الأمعاء. بكتريا Escherichia coli-B. تم إنشاء ناقل استنساخ المكوك الطويل من pDOJH10S ومنطقة E.coll ori في p15A ، وجين lacZ مع موقع استنساخ متعدد لـ pUC18 ، وجين مقاومة الكلورامفينيكول (CAT) من pCI372 وتم تحويله بنجاح إلى E. coli و B. longum. لا يمكن إدخاله في بكتيريا حمض اللاكتيك (Lactococcus و Lactobacillus) ، مما يدل على أنه ليس منحل للغاية. تم الحفاظ عليه بثبات في B. longum في غياب ضغط المضادات الحيوية لمدة 92 جيلًا ، وهو ما يتوافق مع الاستقرار الفصلي للبلازميدات التي تتكاثر ثيتا في البكتيريا موجبة الجرام. هذا هو أول ناقل استنساخ للبكتيريا المشقوقة الذي لا يستخدم RCR ويجب أن يكون مفيدًا للإدخال المستقر للجينات غير المتجانسة إلى هؤلاء السكان المهيمنين في الأمعاء الغليظة.


علم الأحياء المقارن لمتغيرين طبيعيين من عائلة بلازميدات عائلة IncQ-2 ، pRAS3.1 و pRAS3.2

تين. 1. مقارنة الخرائط الجينية لبلازميدات pRAS3 مع pTF-FC2 و pTC-F14. تشير النسب المئوية الموجودة أسفل جينات العمود الفقري البلازميد لـ pTF-FC2 و pTC-F14 إلى هوية تسلسل الأحماض الأمينية المئوية للمنتج الجيني مع مثيله الخاص ببلازميدات pRAS3. النسب المئوية أقل من oriT و oriV تشير المناطق إلى هوية تسلسل النوكليوتيدات. تحتوي البلازميدات pRAS3.1 و pRAS3.2 على أعداد مختلفة من التكرارات 6-bp و 22-bp iterons ، في حين أن تسلسل النوكليوتيدات لكل تكرار أو iteron متطابق ، كما هو موضح أدناه pRAS3. تين. 2. التسلسل الجيني بين oriT و mobB من pRAS3.1 ، يُظهر موضع التكرارات 6-bp. ال oriT تحتها خط وكرر معكوس غير كامل داخل oriT يشار إليها بواسطة الأسهم المقلوبة المكسورة. يشار إلى موقع النك السداسي المحمي بخط عريض مع سهم عمودي يشير إلى موضع النك المفترض. تتم تسمية التكرارات 6-bp CCCCCG من 1 إلى 5. يتكون التكرار الأول من 5 نقاط أساس فقط ، لأنه يفتقر إلى قاعدة سيتوزين. يتم عرض المروج المفترض مع منطقة 35 قريبة الإجماع ومنطقة 10 ضعيفة بخط مائل غامق ويفصل بينها فاصل 17 نقطة أساس. تين. 3. محاذاة oriT مناطق من بلازميدات IncQ-2 و IncPα plasmid RP4 ، والتي تُظهر الاختلاف التسلسلي الذي يمكن أن تتحمله بروتينات Mob للبلازميد pRAS3 بينما كانت لا تزال قادرة على تعبئة الحمض النووي من oriT. يشير السهم العمودي إلى الاسترخاء جيد الموقع الذي يحدث فيه الانقسام المفرد الذي تقطعت به السبل على النحو المحدد للبلازميد RK2 / RP4 (29). تين. 4. سلالات البروتينات السامة المضادة للسموم من pRAS3 ومقارنتها بالبروتينات وثيقة الصلة وكذلك بروتينات PemIK و MazEF ذات الصلة البعيدة. (أ) كانت مضادات السموم على النحو التالي: أروماتوليوم أروماتيوم، CAI08016 بارتونيلا تريبوكوروم، CAK00897 Dinoroseobacter shibae، YP_001541878 نيتروسوموناس يوروبا ATCC 19718 ، CAD85218 زانثوموناس أكسونوبوليس الكهروضوئية. سلالة سيتري 306 ، NP_644761 Xanthomonas campestris الكهروضوئية. حويصلات سلالة 85-10 ، CAJ19793 Xylella fastidiosa آن -1 ، ZP_00682677 بكتريا قولونية MG1165 MazE، AAA69293 plasmid R100 PemI، P13975. (ب) كانت السموم كما يلي: أروماتوليوم أروماتيوم، CAI08015 بارتونيلا تريبوكوروم، CAK00896 الكلوروبيوم فيروكسيدان، EAT59633 نيتروسوموناس يوروبا ATCC 19718 ، 85217 دولار كندي سيودوموناس سيرينجاي الكهروضوئية. Phaseolicola، AAZ37969 زانثوموناس أكسونوبوليس الكهروضوئية. سيتري سلالة 306 ، NP_644760 Xanthomonas campestris الكهروضوئية. حويصلات سلالة 85-10 ، CAJ19792 بكتريا قولونية MG1165 MazF، AAA69292 plasmid R100 PemK، P13976. تين. 5. فقدان بلازميد الاختبار ذي العدد المنخفض ، pOU82 ، مع وبدون جينات TA التي تشبه PemIK من pRAS3 في غياب اختيار البلازميد.

الرسوم المتحركة 34: يمكن نقل الجينات بين الأنواع.

يقوم ستانلي كوهين وهربرت بوير بتحويل البكتيريا ببلازميد مؤتلف ، ويدرس دوج هاناهان إحداث التحول.

مرحبًا ، أنا ستانلي كوهين ، مرحبًا ، أنا ستانلي كوهين وأنا هربرت بوير. في عام 1972 ، كنا في مؤتمر علم الأحياء في هاواي. في ذلك الوقت ، كنت أدرس مقاومة البكتيريا للمضادات الحيوية ، وكان هربرت يدرس الإنزيمات المقيدة. أدركنا أنه يمكننا العمل معًا لإعادة تجميع جينات من بكتيريا مختلفة في جزيء DNA واحد. استخدمنا جينات من سلالتين مقاومتين للأدوية من بكتيريا الإشريكية القولونية - توفر إحدى الجينات مقاومة للمضاد الحيوي التتراسيكلين ، وتوفر الأخرى مقاومة للكاناميسين. يُحمل كل جين على بلازميد في الإشريكية القولونية. البلازميدات عبارة عن حلقات صغيرة من الحمض النووي توجد بشكل مستقل عن الكروموسوم البكتيري الرئيسي. يمكن تكرارها ونقلها إلى ذرية. سميت هذه البلازميدات p للبلازميد و SC لستانلي كوهين. يحمل البلازميد pSC101 جينًا لمقاومة التتراسيكلين ، ويحمل pSC102 جينًا لمقاومة الكاناميسين. زرعنا السلالات البكتيرية التي حملت هذه البلازميدات ، ثم عزلنا DNA البلازميد. أضفنا إنزيم التقييد EcoRI إلى DNA البلازميد. يقوم EcoRI بقطع كل خيط DNA بعيدًا عن مركز موقع التعرف ، مما ينتج عنه تسلسلات قصيرة أحادية الجديلة تسمى النهايات "اللاصقة". قمنا بخلط البلازميدات المقطوعة وأضفنا DNA ligase. الأجزاء ذات النهايات EcoRI مكملة. هذا يسمح للأجزاء أن تتحد مع أي شيء آخر. تقوم الروابط الهيدروجينية بمحاذاة نهايتين لزجتين ، حتى يصلح الليجاز روابط فوسفات السكر لإنشاء جزيء مؤتلف مستقر. كان هدفنا هو الجمع بين جين kan r وجين tet r في بلازميد واحد. ومع ذلك ، تم ربط أنواع أخرى من الجزيئات معًا من الأجزاء. قبل أن نتمكن من عزل البلازميد المؤتلف الذي أردناه ، كنا بحاجة إلى طريقة للحصول على البلازميدات المربوطة في الإشريكية القولونية. أظهرت التجارب الكلاسيكية التي أجراها أوزوالد أفيري ومجموعته أن بكتيريا المكورات الرئوية "تتحول" إلى ضراوة عندما تأخذ الحمض النووي من سلالات خبيثة. ومع ذلك ، يعتبر التحول الطبيعي حدثًا نادرًا ، لذلك استخدمنا طريقة كيميائية تم تطويرها في عام 1970 بواسطة Mandel and Higa في جامعة هاواي. تضمن ذلك خلط البكتيريا والحمض النووي في تعليق كلوريد الكالسيوم البارد عند درجة حرارة التجمد. بعد ذلك ، قمنا برفع درجة الحرارة وخفضها بسرعة لخلق "صدمة حرارية". تحث هذه التقنية البكتيريا على تناول البلازميد DNA. ننشر البكتيريا المحولة على طبق مزرعة يحتوي على تتراسيلين والكاناميسين. يمكن فقط للبكتيريا المحولة التي تحتوي على كلا النوعين من الجينات المقاومة أن تنمو في وجود كلا المضادات الحيوية. كانت هذه النتيجة متسقة مع البكتيريا التي يتم تحويلها ببلازميد معاد تجميعه يحتوي على كل من جين tet r وجين kan r. ومع ذلك ، كان من الممكن أيضًا أن تكون بعض البكتيريا قد تم تحويلها بشكل مضاعف من خلال نسخ متدينة من البلازميدات الأصلية. أظهر تحليل القيود أن بعض المستعمرات قد تحولت بالفعل بواسطة بلازميد مؤتلف. تمكنا من معرفة أيهما كان عندما قطعنا البلازميدات وركضناها على هلام الاغاروز. (قم بتدوير كل فرقة لمعرفة الفرق.) لقد صنعنا أول بلازميد مؤتلف. بعد عدة أشهر ، أظهرنا أنه يمكن استخدام هذه الأساليب نفسها لإعادة تجميع الجينات من الكائنات حقيقية النواة والكائنات بدائية النواة. قمنا بإدخال جين ضفدع في E. coli plasmid. أنتجت البكتيريا الناتجة RNA الضفدع. مرحبًا ، أنا دوغ هاناهان. كطالب دراسات عليا في جامعة هارفارد ، قمت بأول دراسة شاملة للتحول المستحث للإشريكية القولونية. إليكم أفكاري حول ما يحدث عندما يتم تحويل الخلايا البكتيرية باستخدام طريقة Mandel و Higa. أثناء النمو السريع ، يحتوي غشاء الخلية للإشريكية القولونية على مئات المسام ، تسمى مناطق الالتصاق. يتكون غشاء الخلية نفسه من جزيئات دهنية تحتوي على فوسفات سالب الشحنة. على الرغم من أن مناطق الالتصاق كبيرة فيزيائيًا بما يكفي لقبول DNA البلازميد ، إلا أن الفوسفات سالب الشحنة على حلزون الحمض النووي يتم صده بواسطة تلك الموجودة على الدهون. نظريًا ، يمكن لأيونات Ca 2+ من كلوريد الكالسيوم المضاف أن تتعقد مع الشحنات السالبة ، مما يؤدي إلى وضع متعادل إلكتروستاتيكيًا. أيضًا ، يؤدي خفض درجة الحرارة إلى تجميد الغشاء الدهني - مما يؤدي إلى استقرار الفوسفات سالب الشحنة ويجعلها أسهل في الحماية. تخلق الصدمة الحرارية اختلالًا في درجة الحرارة على جانبي الغشاء البكتيري ، مما قد يؤدي إلى إنشاء تيار. مع وجود "الدرع الأيوني" في مكانه ، يتم بعد ذلك تمرير الحمض النووي عبر منطقة الالتصاق. خلقت تقنيات مثل التحول والحمض النووي المؤتلف مجال التكنولوجيا الحيوية. من الممكن الآن هندسة البكتيريا لصنع بروتينات بشرية مهمة مثل الأنسولين. ومع ذلك ، من أجل جعل البكتيريا تصنع الأنسولين أو أي بروتين حقيقي النواة آخر ، هناك عدد من العوامل التي يجب أخذها في الاعتبار. كما تعلمت في Concept 24 ، فإن الجينات في الحيوانات حقيقية النواة لها أقسام إنترونات - أجزاء من الحمض النووي غير المشفر. لا تحتوي البكتيريا على إنترونات في جيناتها ، وبالتالي فهي لا تمتلك آلية كيميائية حيوية لإزالة الإنترونات. هناك أيضا اعتبار آخر. تتم معالجة بعض البروتينات حقيقية النواة بعد الترجمة. على سبيل المثال ، يُترجم الأنسولين لأول مرة على أنه بريبرونسولين ، وهو 108 حمض أميني طويل. أول 24 من الأحماض الأمينية هي تسلسل الإشارة الذي يؤدي إلى خروج البريبرونسولين من الخلية. عندما يغادر البروتين الخلية ، يتم قطع تسلسل الإشارة ، تاركًا البرونسولين ، الذي يتم تخزينه في البنكرياس لمزيد من المعالجة. يتم طيات Proinsulin في هيكل حلقي وتصنع جسور ثاني كبريتيد بين مجموعات السيستين الأمينية التي تغطي البروتين. يتم شق امتداد 33 من الأحماض الأمينية تاركًا بروتين الأنسولين الناضج. لا تستطيع البكتيريا معالجة الأنسولين المسبق في الأنسولين. لذلك ، لجعل البكتيريا تصنع الأنسولين القابل للاستخدام ، تم استخدام بعض الحيل. أولاً ، بدلاً من نسخ mRNA للأنسولين ، تم صنع الحمض النووي بناءً على تسلسل البروتين في سلسلتي الأنسولين - A و B. ثم تم استخدام بوليميريز الحمض النووي لصنع الشريط الثاني. هذه هي شظايا الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل والتي يتم إدخالها في البلازميدات. يتم إدخال كل جزء من الحمض النووي في جين -galactosidase على البلازميد. تحتوي البلازميدات أيضًا على جين مقاومة التتراسيكلين. ثم يتم تحويل البلازميدات إلى بكتيريا. يضاف التتراسيكلين لقتل أي بكتيريا غير محولة. تزرع البكتيريا المحولة ، ثم يتم حصاد وتنقية بروتين اندماج الجالاكتوزيداز والأنسولين. يتم قطع جزء -galactosidase من البروتين والتخلص منه. أخيرًا ، يتم خلط سلسلتي البروتين معًا. في ظل الظروف المناسبة ، تتشكل روابط ثاني كبريتيد ويتم تصنيع الأنسولين البشري القابل للاستخدام من البكتيريا.

بكتيريا e coli ، dna ligase ، المقاومة البكتيرية للمضادات الحيوية ، DNA plasmid ، Oswald avery ، جزيء dna ، هربرت بوير ، المضاد الحيوي التتراسيكلين ، إنزيمات التقييد ، الروابط الهيدروجينية ، الكروموسوم البكتيري ، حبلا الحمض النووي ، بكتيريا المكورات الرئوية ، السلالات البكتيرية ، ستانلي كوهين ، إنزيم التقييد

المحتوى ذو الصلة

17054. تجارب المختبر الافتراضي في التكنولوجيا الحيوية: التحول البكتيري

15028. الاهتمام بالبلازميدات ، هربرت بوير

يتحدث هيرب بوير عن ستانلي كوهين واهتمامه بالبلازميدات كنواقل للحمض النووي.

15916. تحول الحمض النووي

قام ستانلي كوهين وهربرت بوير بإدخال جزيء الحمض النووي المؤتلف الذي أنشأوه في بكتيريا الإشريكية القولونية عن طريق البلازميد ، مما أدى إلى امتصاص والتعبير عن تسلسل الحمض النووي الغريب المعروف باسم "التحول".

15476. آلية إعادة التركيب ، الرسوم المتحركة ثلاثية الأبعاد مع السرد الأساسي

الهندسة الوراثية: إدخال DNA جديد في ناقل بلازميد.

15626. بول بيرج وستانلي كوهين

هربرت بوير: خبير سابق في الجامعة أصبح أحد كبار الشخصيات في مجال التكنولوجيا الحيوية. خبير في قطع الحمض النووي قبل أن يعرف معظم الناس أنه يمكن القيام به. ستانلي كوهين: اكتشف عامل مصلح مولود خدعة استخدام حلقات من الحمض النووي تسمى البلازميدات لتحويل الحمض النووي البكتيري

16721 السيرة الذاتية 34: هيرب دبليو بوير (1936 -)

اخترع هيرب بوير وستان كوهين تقنية الحمض النووي المؤتلف.

16720. السيرة الذاتية 34: ستان نورمان كوهين (1935 -)

اخترع ستان كوهين وهيرب بوير تقنية الحمض النووي المؤتلف.

15030. الآثار المترتبة على عمل الحمض النووي المؤتلف ، هربرت بوير

ينعكس هيرب بوير على أهمية عملهم على تقنية الحمض النووي الريبي وتأثيره على فهم علم الوراثة للكائنات الحية العليا.

16613. الرسوم المتحركة 28: يتم إصلاح بعض أنواع الطفرات تلقائيًا.

يشرح ستان روبرت التلف الناتج عن الأشعة فوق البنفسجية وأنظمة إصلاح الحمض النووي التي يتم تنشيطها بالضوء وعمل ريتشارد سيتلو في إصلاح ثايمين ثايمر.

15917. قطع ولصق الحمض النووي

إن اكتشاف الإنزيمات التي يمكنها قطع ولصق الحمض النووي جعل الهندسة الوراثية ممكنة.


تصور TS و ET الدراسة. جمعت AL و OS و TS البيانات. قام كل من AL و TS بتحليل وتفسير البيانات ، وكتب المسودة الأولى للمخطوطة. ساعد CB في شرح البلازميدات. قام كل من SH و MF بالتسلسل. قدم ET تنقيحات نقدية شاملة. ساهم جميع المؤلفين في المقالة ووافقوا على النسخة المقدمة.

تم دعم هذا المشروع من قبل المعهد الوطني للأغذية والزراعة ، وزارة الزراعة الأمريكية ، بموجب الاتفاقية رقم. 2013-67019-21375 ، برنامج REU & # x201CM التطور الجزيئي والكائن & # x201D من مؤسسة العلوم الوطنية (منحة بحثية # 1460696) ، جائزة التطوير المؤسسي (IDeA) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة تحت المنحة رقم P20GM103408 ومنحة بحثية للطلبة الجامعيين من مكتب أبحاث البكالوريوس في جامعة أيداهو. تم إجراء تسلسل الجينوم بواسطة IBEST Genomic Resources Core ، وأصبح ممكنًا بفضل NIH NIGMS (الجائزة رقم P30 GM103324). تم دعم AL جزئيًا من قبل منحة أبحاث كلية العلوم بجامعة أيداهو.


الاستنتاجات

لقد طورنا طريقة استنساخ جديدة توفر طريقة بديلة لتجميع الحمض النووي. هذه الطريقة مستقلة عن مواقع التقييد و Dpnأنا أعالج ، ولا يقدم تسلسلات تشغيلية غير مرغوب فيها عند تقاطعات الوحدات الوظيفية. تعمل هذه الطريقة الجديدة على تبسيط إجراءات الاستنساخ المعقدة التي يمكن فيها إدخال امتدادات طويلة من الحمض النووي في بلازميدات دائرية بطريقة غير مقيدة ، ولا تنخفض الكفاءة للإدخالات الطويلة التي تصل إلى 20 كيلو بايت. إن بساطة كل من تصميم التمهيدي والإجراء نفسه يجعل الطريقة مناسبة للدراسات عالية الإنتاجية. يتم التعبير عن البروتين محل الاهتمام دون إضافة مخلفات إضافية ناتجة عن إجراء الاستنساخ ، مما يجعلها طريقة بديلة جذابة لعلم الجينوم الهيكلي.


ناقلات تنشيط النسخ (SAM)

وسيط التنشيط التآزري CRISPR / Cas9 (SAM) عبارة عن مركب بروتيني تم هندسته لتمكين التنشيط النسخي القوي للجينات الذاتية - إما جين واحد في كل مرة ، أو ما يصل إلى 10 جينات في وقت واحد في نفس الخلية. يستفيد SAM من خصوصية وسهولة إعادة برمجة نوكلياز Cas9 ، والتي تستهدف موقعًا محددًا في الجينوم الداخلي من خلال توجيه الحمض النووي الريبي. من خلال ترخيص مع Broad Institute * ، تقدم GenScript تسلسلات SAM gRNA التي تم التحقق من صحتها لاستهداف أي منطقة تشفير في الجينوم البشري ، بالإضافة إلى تصميم مجاني لـ SAM gRNA لأي نوع آخر. يتم تصنيع تسلسل الحمض النووي الريبي لدليل SAM بشكل مخصص واستنساخه في نواقل الفيروسة البطيئة الفعالة ، ويرافقها مكونات Cas9-VP64 و MS2-P65-HSF1 التي تشكل مجمع SAM المكون من ثلاثة أجزاء.


شاهد الفيديو: How to Harvest Plasmid DNA with Minipreps (كانون الثاني 2022).