معلومة

4.5: تحليل مستوى النص - علم الأحياء


مقدمة

هناك عدة طرق لتقييم وجود البروتين أو تركيزه. في المقابل ، تحاول اليوم قياس تركيز بروتين معين ليس إلا واحدًا من بين العديد من البروتينات الموجودة في خليط معقد.

تتمثل إحدى الطرق الرائعة للتعرف على البروتينات في استغلال الأجسام المضادة - وتسمى أيضًا الغلوبولين المناعي - سواء في لطخة غربية أو عن طريق ELISA (مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم). في البيئات الفسيولوجية الأصلية (مثل جسمك) ، تفرز الخلايا البائية الأجسام المضادة استجابةً لمسببات الأمراض. يكون الجسم المضاد محددًا للغاية (كد ~ nM) لشريكه الملزم ، المسمى مستضد ، ومجموعة الأجسام المضادة الكاملة لشخص معين متنوعة بشكل لا يصدق (> 107 الأجسام المضادة الفريدة). يتم الحفاظ على التنوع من خلال عمليات إعادة التركيب على مستوى الحمض النووي ، والخصوصية التي تنطوي عليها بنية البروتين.

تتكون بروتينات الجسم المضاد من مناطق ثابتة (C) ومتغيرة (V) ، على كل من سلاسلها الثقيلة والخفيفة. تحدد مناطق C وظائف الجسم المضاد المستجيب ، مثل قتل الخلايا المصابة المعتمد على الجسم المضاد. تشكل الأجزاء الثلاثة شديدة التغير من المنطقة V معًا موقع التعرف على المستضد. يتم التعرف على جزء صغير فقط من مستضد ، يسمى حاتمة ، من خلال الجسم المضاد المتعارف عليه. قد تكون منطقة الأحماض الأمينية ~ 10 خطية ، أو قد تتكون من مناطق بعيدة خطيًا وبالتالي يتم التعرف عليها فقط عندما يكون المستضد في شكله الأصلي. على سبيل المثال ، تعتبر الأجسام المضادة المعتمدة على التشكل مفيدة في التمييز بين أنواع الكولاجين المختلفة.

يمكن أن تربى الأجسام المضادة في الحيوانات ، وخطوط الخلايا الخاصة ، وحتى المعدلة وراثيًا. يمكن الحصول على الأجسام المضادة متعددة النسيلة (تجمعات من الأجسام المضادة التي تتعرف على حواتم مميزة على نفس المستضد) من مصل الحيوانات. يصاب الحيوان بمولد الضد المعني في وجود إشارة تكلفة ، عادة عدة مرات ، ثم ينزف. في هذه الحالة ، لن يكون جزء كبير من الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها ضد مولد الضد محل الاهتمام. في المقابل ، يمكن تصنيع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة بدرجة عالية من التحديد والنقاء. في هذه العملية ، يتم دمج الخلايا البائية الطبيعية المنتجة للأجسام المضادة مع الخلايا البائية الخالدة المشتقة من الأورام النخاعية ، ويتم دمج نوعي الخلايا بواسطة المعالجة الكيميائية بكفاءة محدودة. لاختيار الخلايا المندمجة بشكل غير متجانس فقط ، يتم الاحتفاظ بالمزارع في وسط لا تستطيع فيه خلايا المايلوما وحدها البقاء على قيد الحياة (غالبًا وسط HAT). سوف تموت الخلايا البائية الطبيعية بشكل طبيعي بمرور الوقت دون تدخل ، لذلك في النهاية فقط الخلايا المندمجة ، والتي تسمى الورم الهجين ، تبقى. يمكن استخدام الهندسة الوراثية لدمج "إطار" جسم مضاد بشري (كل من C وجزء من المنطقة V) مع موقع التعرف على المستضد المكتشف في نوع آخر (على سبيل المثال ، الفئران). عند استخدام الأجسام المضادة كعلاجات ، فإن هذا يقلل من احتمالية أن يتعامل معها جسم المريض على أنها أجنبية ، مقارنة بالأجسام المضادة المنتجة من جينات الفئران فقط. عادةً ما يؤدي حقن جسم مضاد من النوع X في حيوان من النوع Y إلى إنتاج أجسام مضادة لـ X ، تسمى الأجسام المضادة الثانوية. يمكن أن تكون هذه مفيدة جدًا في الفحوصات الفنية ، كما سترى أدناه.

اليوم سوف تستخدم الأجسام المضادة ضد الكولاجين في اختبار ELISA غير المباشر. يظهر كل من ELISA غير المباشر والساندويتش في الشكل على اليمين - هل يمكنك أن ترى لماذا قد تكون ELISA السندويتش هي الاختبار الأفضل فيما يتعلق بالحساسية والنوعية؟ في ELISA غير المباشر ، تتمثل الخطوة الأولى في ربط مستخلصات البروتين ، التي تم الحصول عليها من حالتين مختلفتين من الاستزراع ، بأطباق الآبار. بعد ذلك ، ستضيف جسمًا مضادًا أوليًا يتعرف على مستضد معين - أي الحواتم الموجودة على الكولاجين الأول أو الكولاجين الثاني - إلى الآبار ذات الصلة. (في الواقع ، قبل إضافة الجسم المضاد سوف "تحجب" الطبق ببروتين الحليب لمنع الارتباط غير المحدد بالجسم المضاد.) بعد ذلك ، يجب غسل أي جسم مضاد زائد بمنظف معتدل. أخيرًا ، يجب إضافة جسم مضاد ثانوي - أي الجسم الذي يتعرف على الجسم المضاد الأساسي. يترافق الجسم المضاد الثانوي مع الفوسفاتيز القلوي ، والذي سيخضع لتفاعل قياس لوني في وجود ركائزه. وبالتالي ، يمكن تقييم الكمية النسبية للبروتين عن طريق التحليل الطيفي للامتصاص بعد إضافة الركيزة. لتحديد الكمية المطلقة للبروتين ، ستقوم بإجراء تخفيفات لمعيار الكولاجين بالتوازي مع عينات المزرعة الخاصة بك. أثناء خطوات حضانة ELISA الخاصة بك ، يمكنك تشغيل cDNAs التي قمت بإعدادها في المرة الأخيرة على مادة هلامية ، وبدء بعض التحليل.

المراجع: عباس ، أ. ك. ، أ. إتش ليختمان. المناعة الخلوية والجزيئية. 5th إد. فيلادلفيا ، بنسلفانيا: إلسفير سوندرز ، 2005. ISBN: 9780721600086.

البروتوكولات

الجزء 1: اليوم الأول من ELISA

اختياري: قم بقياس تركيز البروتين الكامل

  1. إذا كنت ترغب في ذلك ، يمكنك اختبار مقتطفات البروتين الخاصة بك باستخدام اختبار برادفورد من الوحدة 2 ، ثم تطبيع كمية البروتين الكلي التي تضيفها لكل عينة.
  2. نظرًا لأنك مهتم في النهاية بنسبة الكولاجين II إلى كميات الكولاجين 1 ، فإن هذه الخطوة ليست ضرورية تمامًا. ومع ذلك ، سوف يمنحك معلومات أكثر مما لديك.

بروتوكول إليسا

سنجري هذا الاختبار في لوحة ميكروتيتر 96 بئر ، كما فعلنا لمنحنيات معايرة التألق في الوحدة 1. في ELISA ، سنختبر الامتصاص عند طول موجي معين ، بدلاً من الانبعاث.

  1. قم بتسمية لوحة 96-بئر كمقايسة الكولاجين الأول الخاص بك ، وواحدة كمقايسة الكولاجين II. (لماذا قد نرغب في استخدام لوحات منفصلة؟)
  2. تتمثل الخطوة الأولى في ELISA غير المباشر في امتصاص جميع عيناتك في الآبار. ستحتاج أيضًا إلى إعداد عينات قياسية في نفس اللوحة ، والتي يتم التعامل معها تمامًا مثل عينات الاختبار الخاصة بك. سيتم استخدام هذه المعايير كمرجع لتركيز البروتين. سيتم تشغيل كل من المعايير والعينات غير المعروفة في نسختين ، حسب الجدول التالي.

اقترح خطة ELISA. يمكن استخدام هذه الخطة لكل من الكولاجين 1 ولوحة الكولاجين 2. في كل حالة ، يعد العمودان 1 و 2 نسختين من معايير الكولاجين ، ويحتوي العمود 3 على عيناتك التجريبية وعدد قليل من الآبار (المسمى فارغ) لقياس الخلفية.
1 كولاجين2 معايير3 عينات
أ10 ميكروجرام / مل10 ميكروغرام / مل (مكرر)نموذج 1
ب5"نموذج 1 (مكرر)
ج2.5"نموذج 2
د1.25"نموذج 2 (مكرر)
ه625 ميكروجرام / مل"فارغ
F312"فارغ
جي516"فارغ
ح78"فارغ
  1. سيتم إعطاؤك 250 ميكرولتر من الكولاجين الأول والثاني بمعدل 10 ميكروغرام / مل لكل منهما. قم بإعداد المعايير الخاصة بك على النحو التالي:
    • في النهاية ، تريد ماصة 50 ميكرولتر لكل بئر من كل تركيز قياسي ، بئرين لكل معيار.
    • الخيار 1:
      • تحضير 7 أنابيب إيبندورف مع 120 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل منهما.
      • إضافة 120 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل الكولاجين لأنبوب إيبندورف الأول ، ودوامة.
      • خذ الآن 120 ميكرولتر من هذا المعيار (الآن 5 ميكروغرام / مل) وأضفه إلى أنبوب إيبندورف التالي.
      • عند الانتهاء من كل شيء أو أثناء تقدمك ، ضع المعايير في الآبار المناسبة.
    • الخيار 2:
      • بيبيت 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في الآبار 1 و 2 من الصفوف BH (تخطي!).
      • بيبيت 100 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل من الكولاجين في الآبار المناسبة (A1 و A2).
      • باستخدام ماصة عادية أو متعددة القنوات ، انقل 50 ميكرولتر من هذه الحلول إلى الآبار التالية لأسفل (B1 و B2) ، واخلطها مع PBS.
      • كرر ، الآن نقل 50 ميكرولتر من محلول 5 ميكروغرام / مل في الآبار B وصولاً إلى الآبار C.
    • تسمى أي من هاتين الطريقتين بإجراء تخفيفات مضاعفة. ما هي الطريقة التي تعتقد أنها تقدم أخطاء أقل؟
  2. أضف الآن 50 ميكرولتر من عيناتك إلى الآبار المناسبة. بالنسبة للآبار الفارغة ، يجب إضافة برنامج تلفزيوني.
  3. قم بتغطية كل لوحة (CN I و CNII) عند الانتهاء ، لف حولها باستخدام parafilm لمنع التبخر بشكل أفضل ، والسماح للعينات بالجلوس لمدة 80 دقيقة. في غضون ذلك ، قم بإعداد هلام الاغاروز الخاص بك (الجزء 2).
  4. بعد مرور فترة الحضانة ، ستغسل صحنك ثم تسد.
    • أولاً ، قم بنقر الحلول الموجودة في اللوحة في الحوض.
    • باستخدام الماصة متعددة القنوات والخزان ، أضف 200 ميكرولتر من Wash Buffer إلى كل بئر ، ثم قم بتدوير اللوحة برفق (باليد) لبضع ثوان.
    • قم بإخراج المحاليل مرة أخرى ، ثم امسح اللوح على المناشف الورقية. يمكنك صفع الألواح بشدة ، لكن من الممكن كسرها!
    • كرر الغسل مرة أخرى.
    • أخيرًا ، أضف 200 ميكرولتر من Block Buffer إلى اللوحة. انتظر 60-90 دقيقة أخرى. في غضون ذلك ، اعمل على تحليلك (الجزء 3).
  5. كرر خطوة الغسيل التي قمت بها أعلاه ، مرة أخرى بشطفتين.
  6. عندما تكون جاهزًا ، اسأل أعضاء هيئة التدريس عن بعض الأجسام المضادة الأولية للكولاجين (يجب تخفيفها في اللحظة الأخيرة). إضافة 100 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف لكل بئر.
  7. سيتم ترك العينات الخاصة بك طوال الليل في محلول الجسم المضاد ، ثم يتم إرجاعها مرة أخرى لحظر المخزن المؤقت بواسطة هيئة التدريس.

الجزء 2: Agarose Gel لشظايا PCR

  1. اليوم سنقوم بتشغيل هلام الاغاروز 1.2٪.
    • سيعطينا هذا الاختيار فصلًا أفضل إلى حد ما من هلام 1٪ ، ولكن ليس من الصعب العمل به مثل 3٪ هلام.
  2. تحضير ما يكفي من محلول التحميل المخفف لعينات 9: صبغة تحميل 2 ميكرولتر + 8 ميكرولتر من الماء المعقم لكل عينة.
  3. امزج 10 ميكرولتر من كل منتج PCR مع 10 ميكرولتر من محلول التحميل المخفف.
  4. قم بتحميل العينات وفقًا للجدول أدناه ، مع الحرص على تحميل نفس الكمية في كل بئر.
  5. سيتم تشغيل العينات لمدة 45 دقيقة تقريبًا عند 125 فولت. ستساعدك هيئة التدريس بعد ذلك في الحصول على صور ذات تباين عالٍ قدر الإمكان - أحضر محرك الإبهام.
خطنوع الكولاجينعينةحجم التحميل (ميكرولتر)
1غير متاح100 نقطة أساس سلم10
2CN أنانموذج 118
3CN أنانموذج 218
4CN الثانينموذج 118
5CN الثانينموذج 218

الجزء 3: ابدأ تحليل ImageJ

اليوم سوف تستخدم برنامج تحليل الصور يسمى إيماجيج. يتم تقديم هذا مجانًا من قبل NIH (المعاهد الوطنية للصحة). هدفك هو تحديد الكميات النسبية للكولاجين 2 والكولاجين 1 ، بناءً على شدة العصابات التي تم تطبيعها بواسطة GAPDH المتضخم. يوفر هذا الاختبار جزءًا واحدًا من الدليل على السؤال العام الذي تطرحه هذه الوحدة ، أي العوامل التي تؤثر على صيانة النمط الظاهري للخلايا الغضروفية (مقابل عدم التمايز إلى الخلايا الليفية) أو تكوين غضروف الخلايا الجذعية ، وإلى أي مدى؟ إذا انتهيت من تحليل مستوى النص ، يمكنك الانتقال إلى تحديد بياناتك الحية / الميتة.

شدة النص

  • ابدأ بتحليل بيانات هيئة التدريس للخلايا الغضروفية المعزولة حديثًا والخلايا الجذعية الوسيطة.
    • يتوفر ملفان ، تم التقاطهما في أوقات تعرض مختلفة:
    • العينات من اليسار إلى اليمين هي: (سلم) ، خلية غضروفية CN I ، خلية جذعية CN I ، خلية غضروفية CN II ، خلية جذعية CN II.
    • في كل حالة ، النطاق السفلي هو الضوابط الداخلية GAPDH.
  1. افتح صورة هلام الاغاروز بالاختيار ملف → فتح
  2. باستخدام أداة المستطيل ، حدد منطقة في خلفية الجل ، واضغط على ctrl-M لقياسها. انسخ المتوسط ​​والكثافة القصوى إلى ملف Excel ، واحفظ الملف.
  3. الآن حدد كل من نطاقي الكولاجين و GAPDH بدوره واضغط على ctrl-M في كل مرة. انسخ المنطقة ومتوسط ​​الكثافة ، بالإضافة إلى أي معلومات أخرى تريد الاحتفاظ بها. في النهاية ، ترغب في مقارنة شدة CNII بنطاق CNI لكل عينة بطريقة مكافئة. تأكد من تبرير قرارات تحليل البيانات التي تتخذها.
    • كخيار واحد ، يمكنك تحديد مناطق متساوية من مركز كل نطاق ، لتجنب تأثيرات الحافة (حيث يكون النطاق معتمًا) على متوسط ​​الشدة.
    • من ناحية أخرى ، إذا كان كلا النطاقين ساطعين بشكل متساوٍ ، فإن النطاق السميك سيكون مؤشراً على المزيد من الحمض النووي. لذلك قد ترغب في مقارنة كل من المناطق والشدة ، بدلاً من الشدة فقط. هل يمكنك التفكير في طريقة لاستخدام المنطقة والشدة للحصول على شيء مثل "كثافة البكسل الإجمالية" لكل نطاق؟
    • قد ترغب أيضًا في طرح شدة الخلفية من كل قيمة نطاق عينة قبل أخذ أي نسب.
  4. أولاً ، لاحظ نسب CNII / GAPDH و CNI / GAPDH المتوقعة للخلايا الجذعية والخلايا الغضروفية. بعد ذلك ، يمكنك أخذ نسب CNII / CNI الطبيعية إن أمكن. ما هي مشكلة عمل هذا للخلايا الجذعية؟
  5. أخيرًا ، يمكنك تحليل البيانات الخاصة بك ومعرفة أين تقع بالنسبة للخلايا الغضروفية والخلايا الجذعية.
  6. إذا كان لديك الوقت ، يمكنك استكشاف برنامج تحليل الهلام المدمج في ImageJ.

الجزء 4: صلاحية الخلية

عد الخلايا

سيكون هدفك في هذا القسم هو مقارنة الجهد المطلوب والدقة الناتجة عن حساب الخلايا الحية والميتة يدويًا مقابل القيام بذلك عن طريق تحليل الصور شبه الآلي. بعد الانتهاء ، قد تفكر في الظروف التي قد تفضل فيها طريقة أو أخرى.

  1. افتح صورة الخلية الحية (المرشح الأخضر) عن طريق تحديد ملف → فتح
  2. اختر أداة الخط ، وارسم خطًا بقطر خلية نموذجية
  3. يختار تحليل → ضبط النطاق، ووضع 10 ميكرومتر في الأسفل المسافة المعروفة
    • ملاحظة: بدلاً من استخدام معلومات البكسل الدقيقة من الكاميرا ، فإننا ببساطة نضع متوسط ​​حجم الخلية
  4. قم بتحويل صورتك إلى مقياس رمادي باستخدام صورة ← نوع ← 8 بت
  5. الآن يجب عليك بطريقة ما تحديد الخلايا الخاصة بك من الخلفية
    • طريقة واحدة للقيام بذلك هي عن طريق الاختيار عملية ← ثنائي ← عمل ثنائي. ومع ذلك ، قد تجد أن مجموعات الخلايا تتم قراءتها كخلية واحدة.
    • طريقة محسنة للاستخدام صورة → ضبط → عتبة. يمكنك تعيين شدة الحد العلوي والسفلي التي تحدد الكائنات في صورتك. العب باستخدام منزلقات الكثافة حتى تمتلئ خلاياك في الغالب باللون الأحمر ، ولكن لا تتداخل مع الخلايا الأخرى كلما أمكن ذلك.
  6. الآن يمكنك عد الأشياء. يختار تحليل → تحليل الجسيمات، واختر إظهار → الخطوط العريضة, عرض النتائج, لخص، و احصائيات التسجيل. اختر أيضًا نطاق مساحة معقولة (وليس قطر!) للكائنات بحجم الخلية.
  7. حاول التلاعب بهذه العملية قليلاً - هل هناك أي تغييرات أخرى يمكنك إجراؤها حتى تكون الخوارزمية الآلية جيدة مثل عينك؟
  8. سجل النتائج النهائية (اليدوية وأفضل آلية) في دفتر ملاحظاتك ، لكل عينة لديك بيانات عنها. لا تنسَ أيضًا حساب الخلايا الميتة ، وطرح هذا الرقم من الخلايا الحية (نظرًا لأن المرشح الذي استخدمناه يُظهر الخلايا الخضراء والحمراء معًا).

تحليل احصائي

بمجرد حصولك على عدد الخلايا (سواء أكان آليًا أو يدويًا) الذي تسعدك به ، يمكنك التدرب على إجراء بعض التحليلات الإحصائية الأساسية.

  1. ابدأ بملف Excel هذا (XLS) كإطار عمل لتنفيذ التلاعبات الإحصائية الأساسية التي ناقشناها في المحاضرة 3. تم تعديل الملف من الأصل بواسطة Bevin Engelward. مستخدمة بإذن.
  2. ابحث عن فواصل ثقة 95٪ وارسمها لأعداد الخلايا الحية و / أو النسبة المئوية للخلايا الحية لكل عينة من عينتك.
    • ما هي مزايا وعيوب النظر إلى الأعداد مقابل النسب المئوية؟ في أي المواقف قد يكون النظر إلى التهم مضللاً؟
  3. قارن بين الوسائل (العدد و / أو النسبة المئوية) لعينتك. في أي مستوى ثقة (إن وجد) يختلفان؟

قائمة الكاشف

  • حلول ELISA
    • أعيد تكوين برنامج تلفزيوني من أقراص EMD
      • 140 ملي كلوريد الصوديوم
      • 10 ملي الفوسفات العازلة
      • 3 ملي بوكل
      • 7.4 درجة الحموضة
    • غسل العازلة
      • برنامج تلفزيوني
      • 0.05٪ توين 20
    • كتلة عازلة
      • برنامج تلفزيوني
      • 5٪ حليب بودرة
  • الكواشف الخاصة بالكولاجين إليسا
    • كل ذلك من GeneTex
    • معيار الكولاجين الأول ، المخفف من 1 مجم / مل في برنامج تلفزيوني
    • معيار الكولاجين الثاني ، المخفف من 1 مجم / مل في برنامج تلفزيوني
    • الجسم المضاد للكولاجين 1 المخفف بنسبة 1: 4000 من 1 مجم / مل في برنامج تلفزيوني
    • الجسم المضاد للكولاجين 2 ، المخفف 1: 4000 من 1 مجم / مل في برنامج تلفزيوني

يكشف تحليل شبكة الارتباط عن إعادة تنظيم متسلسلة للحالات الأيضية والنسخية أثناء الإنبات والعلاقات بين الجينات والمستقلبات في تنمية شتلات نبات الأرابيدوبسيس

توفر دراسات التنميط الشامل والأنظمة البيولوجية لتوافر المغذيات مزيدًا من الأفكار حول الآليات التي يستجيب بها التعبير الجيني للمغذيات المتنوعة والمستقلبات. لا يُعرف الكثير عن الآليات التي يتأثر بها التعبير الجيني بالمستقلبات الذاتية ، والتي يمكن أن تتغير بشكل كبير أثناء التطور. تم تطبيق نُهج تحليل الإحصاء متعدد المتغيرات وشبكة الارتباط على بيانات التنميط غير المستهدفة للتحقيق في حالات النسخ والتمثيل الغذائي وتحديد المستقلبات التي قد تؤثر على التعبير الجيني أثناء الانتقال غير المتجانسة إلى ذاتية التغذية لمؤسسة الشتلات.

نتائج

تم الحصول على ملفات تعريف النسخ المستندة إلى Microarray من مقتطفات من بذور نبات الأرابيدوبسيس أو الشتلات التي تم حصادها من التشرب إلى عمر ثمانية أيام. تم الحصول على ملامح مستقلب H-NMR للعينات المقابلة. أظهر تحليل بيانات النسخ تعبيرًا جينيًا تفاضليًا عاليًا من خلال ظهور الشتلات متبوعًا بفترة تغير أقل. زاد التعبير الجيني التفاضلي تدريجياً حتى اليوم الثامن ، وأظهر يومين ، 5 و 7 ، مع نسبة عالية جدًا من الجينات المنظمة ، بما في ذلك جينات عامل النسخ / الإشارة. كشفت رسم الخرائط الشبكي باستخدام التضمين الربيعي عن مجموعتين أساسيتين من المستقلبات شديدة الارتباط ، والتي يبدو أنها تعكس حالات التمثيل الغذائي المتميزة مؤقتًا. أنتجت تحليلات المكون الأساسي لمجموعتي بيانات التنميط انتشارًا زمنيًا للنقاط الزمنية ، والذي يمكن توقعه من سلسلة تنموية. أنتجت خريطة الشبكة لبيانات النص مجموعتين متميزتين تتكونان من أيام من 0 إلى 2 والأيام من 3 إلى 8 ، في حين كشف التحليل المقابل لبيانات المستقلب عن تحول في اليوم الثاني إلى مجموعة اليوم الثالث إلى الثامن. أعطى تحليل الارتباط الزوجي المستقلب والنسخ الذي يشمل جميع النقاط الزمنية مجموعة من 237 ارتباطًا مهمًا للغاية. من بين 129 جينة مرتبطة بالسكروز ، كان من المعروف أن 44 منها تستجيب للسكروز بما في ذلك عدد من عوامل النسخ.

الاستنتاجات

كشف تحليل المصفوفة الدقيقة أثناء الإنبات والتأسيس عن انتقالات رئيسية في نشاط النسخ في نقاط زمنية يحتمل أن تكون مرتبطة بالتحولات التنموية. تشير رسم الخرائط الشبكي باستخدام التضمين الربيعي إلى أن التحول في حالة المستقلبات المهمة من الناحية التغذوية يسبق حدوث تحول كبير في حالة النسخ من الإنبات إلى ظهور الشتلات. حددت الارتباطات الخطية الزوجية لمستويات النسخ والمستقلب العديد من الجينات المعروفة بتأثرها بالمستقلبات ، وقدمت أهدافًا أخرى للتحقيق في تنظيم المستقلب للتعبير الجيني أثناء إنشاء الشتلات.


مقدمة

كان لتقنيات التسلسل تأثير عميق على الطريقة التي نجري بها بحث النسخ ، مما يتيح الوصول إلى النطاق الكامل للنصوص في عينة بيولوجية بفضل RNAseq.تتراوح تطبيقات RNAseq من التقييمات الكلاسيكية للنسخة التفاضلية أو التعبير الجيني بين العينات [1] إلى المشكلات الأكثر تنوعًا مثل توصيف ديناميكيات التعبير الجيني [2] ، وحدود الجينات [3 ، 4] ، وكفاءة الترجمة [5] أو RNA- تفاعلات البروتين [6 ، 7] ، على سبيل المثال لا الحصر. في السنوات القليلة الماضية ، أثار تطبيقان من تطبيقات RNAseq اهتمامًا خاصًا لوصف تعقيد وتنوع تنظيم النسخ — RNAseq وحيدة الخلية [8] ودراسة التضفير البديل على نطاق واسع [9 ، 10]. تجارب RNAseq السائبة متوسط ​​التعبير الجيني عبر مجموعات من الخلايا وبالتالي تمنع التقاط التباين من خلية إلى أخرى. حفز هذا على تطوير استراتيجية خلية واحدة لـ RNAseq [8] ، وبذلت الجهود بلا هوادة لتحسين الاستراتيجية منذ ذلك الحين. حتى الآن ، قدم RNAseq أحادي الخلية نظرة ثاقبة حول تمايز الخلايا [11،12،13،14،15] ، والأنسجة المعقدة وتركيب الخلايا النادرة [16،17،18،19] أو عدم تجانس الورم [20 ، 21 ] والنمو [22] ، ويشكل تقنية متطورة في مجال البحوث البيولوجية. أما بالنسبة لمجال النسخ الإسفنجية ، فقد أظهرت الدراسات المبكرة مستويات عالية من أحداث التضفير البديل (AS) الخاصة بالأنسجة والمنظمة نموًا [9 ، 10 ، 23 ، 24 ، 25] ، والتي تم تفسيرها على أنها طبقة إضافية من التعقيد المظهري. منذ ذلك الحين ، عملت RNAseq على توصيف عدد متزايد من أحداث AS مع أدوار راسخة في العمليات البيولوجية ، أي تكاثر الخلايا وبقائها على قيد الحياة ، والتمايز ، والتوازن ، والاستجابات للإجهاد ، والمرض عند تغييرها. تمت مراجعة هذه الأحداث وآليات تنظيمها بدقة على مدار السنوات القليلة الماضية [23 ، 26 ، 27 ، 28 ، 29 ، 30 ، 31] ، مما وضع مفهوم الربط البديل كعملية معقدة ومنظمة بإحكام وذات صلة وظيفية ، على الرغم من لا يزال غير مفهوم على نطاق عالمي. علاوة على ذلك ، هناك جدل مستمر حول أهميتها البيولوجية [32 ، 33 ، 34].

على النقيض من الوفرة العالية لكل من دراسات الربط البديلة أحادية الخلية RNAseq ومستوى السائبة ، فإن الحالات التي يتم فيها استخدام التنميط النسخي للخلية المفردة لمعالجة تباين الأشكال الإسوية نادرة (الجدول 1). ومع ذلك ، على عكس ما قد توحي به الفجوة الموجودة في الأدبيات ، فإن الجرأة على تجاوز الحجم أمر ضروري للإجابة على بعض الأسئلة المتعلقة بأنماط التعبير عن الأشكال الإسوية البديلة. إن عدم التجانس الذي تم اكتشافه مؤخرًا في آليات التعبير الإسوي في الخلايا المفردة [35 ، 36 ، 37 ، 38] مثير للاهتمام للغاية للمجتمع العلمي ، ويثير التساؤل عما إذا كان هذا المشهد المتنوع والمعقد للتعبير الإسوي يشكل طبقة إضافية من تنظيم التعبير الجيني أو هو فقط نتيجة للأداء العشوائي لآلة الربط البديلة. ليس هناك شك حاليًا في أن دراسات الشكل الإسوي أحادية الخلية يمكن أن تكون المفتاح لحل هذه المشكلة الأساسية.

تم إجراء تحليلات على مستوى النسخ من الأشكال الإسوية كجزء من منشورات التعبير الجيني RNAseq أحادية الخلية [35 ، 39] أو في دراسات مجمعة للتنوع الإسوي [40] ، ولكن فقط كدليل على المفهوم. عادة ، لم يكن الهدف من هذه الدراسات هو معالجة التنوع الإسوي أحادي الخلية ، ولكن لاختبار أداء البروتوكولات التجريبية أو الأدوات الحسابية في هذا السيناريو. في مثل هذا الإطار المحدود ، أنجزت الدراسات السابقة تحديد عدد صغير فقط من اختلافات الربط فوق الضوضاء بين الخلايا المفردة وافتقرت إلى التقييم المتعمق للنتائج. لعدة سنوات ، تم فقط استخدام الطرق المطورة لـ RNAseq ، بشكل أساسي "خليط من الأشكال الإسوية" (MISO) [41] ، في البحث الإسوي أحادي الخلية [35 ، 36] ، ولم يتم حتى وقت قريب أن تكون الاستراتيجيات الحسابية مصممة خصيصًا للخصوصيات من RNAseq وحيدة الخلية بدأت في الظهور [38 ، 42 ، 43]. والجدير بالذكر أن استخدام التسلسل قصير القراءة وعدم توفر الأدوات لتحليل بنية الشكل الإسوي الشامل قد حد من معظم الأبحاث لتقدير مستويات تضمين exon فقط [35 ، 36 ، 38 ، 39 ، 43] أو استهداف مناطق معينة من النصوص - ذلك هي المنطقة 3 غير المترجمة (UTR) لمواقع البولي أدينيل البديلة [44] أو 5 UTR لمواقع بدء النسخ (TSS) [45]. ومع ذلك ، نجحت الدراسات الحديثة التي تطبق تقنيات التسلسل أحادي الجزيء في توصيف الهياكل الإسوية الكاملة [46 ، 47] على عدد محدود من الخلايا (من أربعة إلى ستة) ، بما في ذلك النطاق الكامل لأحداث التضفير البديلة. وتجدر الإشارة إلى أن معظم الدراسات المذكورة أعلاه تستخدم الأساليب الحسابية المتاحة للجمهور (أي [41 ، 48]) ومجموعات البيانات (أي [17 ، 18 ، 36 ، 49 ، 50]) (الجدول 1).

في إطار دراسات الشكل الإسوي أحادي الخلية ، تتوفر ثلاث مجموعات من تقنيات إعداد المكتبة وتسلسلها لتوليد البيانات (الشكل 1 أ):

ضمن تقنيات القراءة القصيرة (Illumina) ، يمكن تمييز طريقتين اعتمادًا على استراتيجية إعداد المكتبة المختارة:

توفر الطرق القائمة على UMI قراءات قصيرة من جزء من الطرف 3 أو 5 وتتضمن معرفًا جزيئيًا فريدًا (UMI) كوسيلة لحساب تحيز التضخيم.

○ توفر الأساليب القائمة على الذكاء قراءات قصيرة تغطي كامل طول النص ولكن لا يمكنها استيعاب UMIs للحصول على تقدير أكثر دقة للتعبير.

على النقيض من ذلك ، فإن تقنيات القراءة الطويلة (مثل تسلسل جزيء واحد) تلتقط جزيء نسخة كامل في تسلسل قراءة واحد.

طرق تسلسل mRNA أحادية الخلية ومصادر تباين الرنا المرسال. أ المناهج المنهجية لدراسات الشكل الإسوي أحادية الخلية. ينتج عن الجمع بين تقنيات إعداد المكتبة والتسلسل ثلاث طرق متميزة لالتقاط تنوع الشكل الإسوي. تقتصر الطرق المستندة إلى UMI على تسلسل 3 ′ (أو 5 end) ، مما يتيح استخدام UMIs لالتقاط تحيز PCR بكفاءة بالإضافة إلى تشفير الخلايا في وقت مبكر ، حتى لو كانت مناسبة بشكل خاص لقياس التعبير على مستوى الجينات. تنتج الطرق الذكية قراءات قصيرة عبر طول النص بالكامل ، على الرغم من أنها تتطلب تشفيرًا شريطيًا متأخرًا للخلية (يتم إدخال الرموز الشريطية في العلامات) ، ولا يمكنها استيعاب UMIs ، وقد يكون من الصعب تعيين القراءات بشكل لا لبس فيه إلى شكل إسوي. يسمح التسلسل أحادي الجزيء بتسلسل كل جزيء نسخ في قراءة واحدة ويوفر اتصالًا إسويًا كاملًا ، على الرغم من أنه يعاني من ارتفاع معدل انتشار أخطاء التسلسل. ب مصادر تباين النص الذي ينتج عنه أشكال إسوية بديلة وموقعها على طول النص. عند مقارنتها مع الشكل الإسوي المرجعي (للراحة ، بما في ذلك جميع exons ، وعدم وجود introns و UTRs الكاملة) ، يتم إنشاء TSSs البديلة (مواقع بدء النسخ) و TTS (مواقع إنهاء النسخ) أثناء عملية النسخ عن طريق تقصير UTRs. تزيل معالجة pre-mRNA أو تحافظ على الإنترونات والإكسونات ، مما يضيف تنوعًا إلى الأشكال الإسوية التي يمكن أن تتولد من الجين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يوجد أكثر من حدث واحد في وقت واحد في نفس الشكل الإسوي ، وبالتالي سيزداد تنوع الشكل الإسوي مع عدد التوليفات المحتملة لأحداث AS. بديل. لبديل، RT النسخ العكسي، UMI معرف جزيئي فريد

هنا ، نركز على تحديد قيود هذه الأساليب المنهجية الثلاثة في تطبيقها على AS والتعبير الإسوي. تحقيقًا لهذه الغاية ، أنشأنا أولاً مجموعة مثالية من المتطلبات لدراسة شكل إسوي ناجحة وتقييم إلى أي مدى يتم الوفاء بها في منشورات RNAseq أحادية الخلية (الجدول 1). بناءً على المعرفة المستمدة من هذا التحليل ، نعرض محاكاة حسابية بسيطة تكشف عن العوامل المحددة المتأصلة في كل من الطرق الثلاثة في بيئة تجريبية حقيقية. أخيرًا ، نناقش الأسئلة البيولوجية التي يمكن أن تتناولها دراسات الشكل الإسوي أحادية الخلية والآفاق المستقبلية للنهج.


نتائج ومناقشة

لتوجيه تحليلنا لخلايا CD4 + T الساذجة ، اتبعنا النهج التالي. أولاً ، بدأنا بتوصيف الأماكن الفردية. تبع ذلك تقاطعات زوجية مختلفة لبياناتنا لتقييم العلاقات بين أنواع البيانات المختلفة كماً ونوعاً. سمح لنا هذا التكامل متعدد الأنظمة أيضًا باكتساب نظرة ثاقبة حول تحرير RNA والتعبير الخاص بالأليل وتخصيص استراتيجيات البحث البروتيني الخاصة بنا. أخيرًا ، أجرينا تحليلًا مقارنًا للميثيلوم والنسخة والبروتينات والفوسفوبروتيوم لخلايا CD4 + T الساذجة والذاكرة لاستكشاف الآليات الخلوية الكامنة وراء الاستجابة المناعية للخلايا التائية. استلزم هذا كلاً من نهج مزدوج بالإضافة إلى تحليل مستوى المسار التكاملي لتحديد التغييرات الجزيئية بعد تجربة المستضد لخلايا CD4 + T الساذجة.

الاختلافات الجينية وتأثيرها المحتمل على مناطق ترميز البروتين

3.3 × 10 6 SNPs ، و 1.75 × 10 5 إدخالات و 1.9 × 10 5 حذف عبر الجينوم (ملف إضافي 2: الشكل S2A). تم العثور على ما يقرب من 16000 SNPs و 130 إدخالًا و 109 عملية حذف داخل جينات ترميز البروتين. أدت هذه التغييرات في التسلسل إلى توليد 107 كودون توقف سابق لأوانه ، و 14 طفرة بدون توقف ، و 109 تغيرات في الإطارات. كانت معظم SNPs داخل مناطق ترميز البروتين مرادفة أو أدخلت تغييرات الأحماض الأمينية المحافظة (ملف إضافي 2: الشكل S2B). كان هناك 7،271 تغيرًا غير مترادف أثر في الغالب على عائلات البروتين المرتبطة بالبيئة خارج الخلية بما في ذلك المستقبلات المقترنة ببروتين G ، والغلوبولين المناعي ، وبروتينات سطح الخلية / الغشاء والقنوات الأيونية (ملف إضافي 2: الشكل S2C). هذا يتفق مع الملاحظات الحديثة التي تشير إلى أن طفرات فقدان الوظيفة المحتملة شائعة جدًا في الأفراد الأصحاء ، خاصة في العائلات الجينية التي لديها العديد من المتماثلات [7]. هناك أيضًا ملاحظات سردية تشير إلى أن المتغيرات في الجزيئات السطحية أو المفرزة قد تفسر التباين الواسع للاستجابات المناعية وامتصاص المغذيات الموجودة في مجموعة سكانية معينة [8-10].

من بين الجينات ذات التغيرات غير المترادفة ، الخريطة يحتوي على متغير متماثل اللواقح قدم كودون توقف سابق لأوانه مما أدى إلى اقتطاع معظم الخريطة مجال كيناز. هذا مثير للاهتمام بشكل خاص بالنظر إلى ذلك الخريطة يشارك في تفعيل ص 38- MAPK، والذي بدوره ثبت أنه يعزز نسخ جينات متعددة تشارك في تنظيم دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج مثل ص 53 و MYC [11 ، 12]. هناك متغير آخر متماثل الزيجوت يؤدي إلى فقدان محتمل لوظيفة البروتين وهو الإدراج داخل فسفوليباز PLCD3 التي أدخلت تغيير الإطارات. نتج عن هذه الطفرة فقدان مجالات PLC و C2 ، المسؤولة عن التحلل المائي للفوسفاتيدينوسيتول 4 ، 5-بيسفوسفات إلى دياسيل جلسرين وإينوزيتول 1،4،5-تريسفوسفات (IP3). هذه النتائج مثيرة للدهشة نظرًا لأنه تم الحصول على الخلايا من متبرع طوعي سليم ومن المحتمل أن تعكس أن المسارات المصابة قد يكون لها آليات تعويضية. من المهم أن نلاحظ أنه تم الإبلاغ مؤخرًا عن حدوث طفرات فقدان الوظيفة هاتين في جينومات الأفراد الأصحاء من مجموعات سكانية متعددة [7].

منظر طبيعي للنسخ لخلايا CD4 + T.

قمنا بتسلسل نسخة من خلايا CD4 + T ساذجة باستخدام تسلسل RNA مزدوج النهاية. تم تقدير وفرة النصوص المجمعة باستخدام FPKM (شظايا لكل كيلوباز من exon لكل مليون جزء) وأظهرت توزيعًا ثنائي النسق (ملف إضافي 3: الشكل S3). تم تطبيق نموذج خليط غاوسي لنمذجة هذين التوزيعين. كشف تحليل النصوص تحت كل ذروة أن ذروة FPKM المنخفضة تحتوي على نصوص مع قراءات داعمة قليلة اعتبرناها ضوضاء. مع قطع FPKM لاثنين من الانحرافات المعيارية عن متوسط ​​الذروة اليسرى (0.860) ، وجدنا & gt13000 من الجينات المنسوخة التي يمثلها

24000 نسخة (الشكل 2 أ ، ملف إضافي 4: الجدول S1). كما هو متوقع ، اكتشفنا تعبيرًا عن العديد من مستقبلات السيتوكين المرتبطة بمجموعات خلايا CD4 + T المساعدة المحددة جيدًا مثل Th1 (IL2RA و IL2RB و IL2RG و IFNGR1 و IL12RB1) و Th2 (IL4R و IL10RB) و Th17 (IL17RA و IL17RC ، IL21R). بشكل عام ، تم التعبير عن السيتوكينات ، ومستقبلات السيتوكين ، ومعقد التوافق النسيجي الرئيسي ، والجينات التي تشفر بروتينات سطح الخلية (على سبيل المثال ، CD4) بمستويات أعلى من المتوسط. كما هو متوقع ، تضمنت أكثر الجينات التي تم التعبير عنها بكثرة تلك التي ترمز لبروتينات الريبوسوم و RNA الريباسي. حددنا نصًا إضافيًا و GT6000 نصًا جديدًا و GT6000 أشكال إسوية مقسمة جديدة غائبة في التعليق التوضيحي المرجعي (تكوين الشرح المرجعي المقدم في الطرق) (ملف إضافي 5: الجدول S2). لقد تحققنا من صحة التعبير عن مجموعة من النصوص الجديدة المختارة عشوائيًا عن طريق تضخيم RT-PCR وتسلسلها في لوحة من الخلايا المناعية الأولية بما في ذلك خلايا CD4 + T. أظهر اثنان من النسخ السبعة تعبيرًا في كل مكان عبر جميع الخلايا المناعية الأولية المختبرة بينما كان البعض الآخر خاصًا نسبيًا بالخلايا التائية (الشكل 2 ب).

نسخة من الخلايا الساذجة CD4 + T. أ مخطط دائري يمثل عدد الفئات المتنوعة من النصوص المحددة في خلايا CD4 + T. ب Agarose gel الذي يصور منتجات PCR المضخمة من الحمض النووي الريبي المعزول من أنواع مختلفة من الخلايا المكونة للدم. تُظهر الملصقات الموجودة في الجزء العلوي علامات السطح بناءً على ما تم تنقية الخلايا وتعرض الملصقات الموجودة على الجانب معرف أزرار الأكمام لكل نص

قمنا بعد ذلك بفحص ملف تعريف miRNA لخلايا CD4 + T. أنتج miRNA-Seq 7.6 مليون قراءة قابلة للاستخدام تمت محاذاتها باستخدام miRdeep2 ، وتحديد 629 miRNAs معروفًا بالإضافة إلى 15 miRNAs مفترضة (ملف إضافي 6: الجدول S3). تم تحديد هذه miRNAs الجديدة المفترضة بناءً على وجود ميزات مميزة لـ miRNAs بما في ذلك تكوين دبوس الشعر ، وهيكل حلقة جذعية مستدامة بالإضافة إلى التسلسلات الناضجة والنجومية كما هو موضح في الملف الإضافي 7: الشكل S4. أكثر من 99.9 ٪ من القراءات تتوافق مع 283 miRNAs ، مما يشير إلى أن هذا يشكل المجموعة الأساسية من miRNAs المعبر عنها في خلايا CD4 + T. باستخدام طريقة منشورة مسبقًا ، أثبتنا أن FPKM من

73 يتوافق مع نسخة ميرنا واحدة لكل خلية ، وهو ما يعادل

حددت نسبة 50٪ من الجزيئات المجهرية وجودها في نسخة واحدة على الأقل لكل خلية و

13٪ مع 100 نسخة على الأقل [13].

الملف البروتيني لخلايا CD4 + T.

لقد أجرينا تحليلًا بروتينيًا متعمقًا لخلايا CD4 + T ساذجة باستخدام طرق فصل متعددة الأبعاد بالإضافة إلى تجزئة خلوية للنواة والغشاء والعصارة الخلوية [1 ، 13]. في المجموع ، تم تحديد البروتينات المشفرة بواسطة 7449 جينًا (ملف إضافي 8: الجدول S4). لتحديد وفرة البروتينات المعبر عنها في خلايا CD4 + T ساذجة ، استخدمنا الكميات المطلقة القائمة على الكثافة (iBAQ) [14] (الشكل 3 أ). بالاتفاق مع بيانات النسخ ، تم العثور على بروتينات سطح الخلية ومكونات مجمع التوافق النسيجي معبرًا عنها بكثرة. كما هو متوقع ، حددنا العديد من مستقبلات السيتوكينات ، بما في ذلك IL2RG (CD132) ، سلسلة غاما المشتركة التي تشترك فيها مستقبلات السيتوكينات المتعددة (IL2 و IL4 و IL9 و IL15 و IL21) التي تلعب دورًا حيويًا في إشارات الخلايا التائية [15]. ومن المثير للاهتمام أننا اكتشفنا CRLF2 ، الذي يشترك مع IL7R ويعمل كمستقبل لـ TSLP ، وهو سيتوكين رئيسي تطلقه الخلايا الظهارية [16-18]. يوضح النموذج الحالي لإشارات TSLP أن TSLP يؤثر على وظيفة خلايا CD4 T ، والتوازن ، والتأثيرات المسببة للأمراض من خلال تعديل الخلايا التغصنية. ومع ذلك ، نظرًا لأن TSLP هي واحدة من أقدم السيتوكينات التي تم إفرازها أثناء الالتهاب ، ويتم التعبير عن CRLF2 و IL7R معًا في خلايا CD4 + T ساذجة ، تشير هذه النتائج إلى سيناريو محتمل يمكن فيه لخلايا CD4 + T الساذجة أن تشعر مباشرة بالالتهاب محليًا عبر إشارات TSLP مركب.

توزيع البروتينات المعبر عنها في خلايا CD4 + T ساذجة بناءً على وفرتها النسبية. أ توزيع البروتينات المحددة في خلايا CD4 + T الساذجة والوفرة المقابلة لها بناءً على قيم iBAQ (log2) الطبيعية. تشير الجينات الموضحة باللون الأحمر إلى تلك التي تمت إزالتها في NCBI RefSeq 62 ، ولكن تم اكتشافها في دراسة البروتينات الخاصة بنا. ب بنية المجال المتوقعة لمجموعة فرعية من البروتينات الافتراضية المشروحة RefSeq المحددة في دراستنا

حددنا 162 بروتينًا تم شرحها كإطارات قراءة مفتوحة (ORFs) في قواعد البيانات العامة (ملف إضافي 9: الجدول S5). تم التعبير عن بعض هذه البروتينات بكثرة في خلايا CD4 + T ساذجة ولها بنية مجال مميزة بما في ذلك ببتيدات الإشارة ومجالات الغشاء ومجالات الفوسفاتيز (الشكل 3 ب). قد تؤسس الدراسات المستقبلية بعض هذه الجزيئات كمستضدات جديدة للقرص المضغوط والسيتوكينات والكيموكينات. ومن المثير للاهتمام أننا اكتشفنا ثلاثة بروتينات تمت إزالتها من قاعدة بيانات RefSeq للبروتين (الإصدار 71): NP_003917.1 و NP_059120.2 و NP_115949.3 (رموز الجينات المقابلة الموضحة باللون الأحمر في الشكل 3 أ). تمت إزالة هذه البروتينات بسبب عدم كفاية الأدلة البروتينية أو الأدلة النصية أو كليهما. في جميع الحالات الثلاث ، وجدنا mRNA وكذلك أدلة بروتينية تدعم نسخها وترجمتها. في المستقبل ، يمكن تجنب مثل هذه السلبيات الزائفة (أي التعليقات التوضيحية التي تم منعها بسبب نقص الأدلة) من خلال دمج الأدلة النصية والبروتينية من الدراسات المنشورة.

تكامل مجموعات البيانات متعددة omics

أتاح لنا التكامل الرأسي لمجموعات البيانات متعددة الأبعاد على مستوى الجينوم من خلفية متطابقة الفرصة لاستكشاف 1) كيف ينظم تسلسل الجينوم والتعديلات اللاجينية المرتبطة به مثل مثيلة الحمض النووي الريبي وتعبير البروتين في الخلايا 2) مدى تعديلات ما بعد النسخ مثل تحرير الحمض النووي الريبي في الخلايا في ظل الظروف الفسيولوجية العادية 3) الجينات التي تعرض أنماط تعبير خاصة بالأليل والخاصة بالشكل الإسوي ، و 4) أنماط تعبير ميرنا وتأثيرها المحتمل على التعبير عن أهداف البروتين. نظرًا لأننا جمعنا بيانات تمتد من الجينوم إلى البروتين ، يمكننا أيضًا استكشاف إمكانية مناطق ترميز بروتين جديدة في الجينوم البشري.

نمط التعبير المحدد لأليل وتحرير الحمض النووي الريبي

من خلال الجمع بين بيانات تسلسل الجينوم والنسخة الكاملة من نوع خلية واحدة نقية ، تمكنا من التحقيق في التعبير الخاص بالأليل وأحداث تحرير الحمض النووي الريبي. نظرًا لأن متغيرات التسلسل التي تميز أليلين ضرورية لاستخلاص استنتاجات حول أنماط التعبير الخاصة بالأليل ، قمنا بمسح جميع الجينات التي تحتوي على تعدد أشكال تعدد الزيجوت وفقًا للنُهج السابقة [19 ، 20]. كشفت مستويات وفرة هذه الجينات عن 84 جينًا أظهر فيها أليل واحد فقط مستويات تعبير يمكن اكتشافها. بالنسبة للجينات التي تم فيها اكتشاف كلا الأليلين ، قمنا بتعريف التعبير الخاص بالأليل كحالات تم فيها تعيين ما لا يقل عن 10 قراءات وكان هناك فرق 5 أضعاف على الأقل في القراءات المعينة بين الأليلات. باستخدام هذه المعايير ، حددنا 103 جينات حيث تم التعبير عن أليل واحد في الغالب. وشمل ذلك الجينات المطبوعة المعروفة مثل ATP10A و SNRPN إلى جانب العديد من جينات ترميز البروتين الإضافية والجينات الخادعة والـ RNAs غير المشفرة التي لم يتم الإبلاغ عنها سابقًا على أنها مطبوعة (ملف إضافي 10: الجدول S6).

يعد تحرير الحمض النووي الريبي (RNA) آلية ما بعد النسخ والتي من خلالها ينتج عن التقليل الأنزيمي لنيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي (RNA) تغيير الاقتران بين الكودون والمضاد الكودون. في تسلسل الجيل التالي ، تم الإبلاغ عن هذه التغييرات في النهاية على أنها أدينوزين إلى جوانين أو سيتوزين إلى انتقالات ثايمين. يمكن أن تؤثر هذه التغييرات على العمليات البيولوجية التي تتراوح من ارتباط ميرنا بوظيفة البروتين. حتى الآن ، لم تتم دراسة تحرير الحمض النووي الريبي في صورة واحدة مطهرة الأولية نوع الخلية ، على الرغم من أنه تم تقييمه في سياق خطوط الخلايا الخالدة والأنسجة [21-23]. لتحديد مواقع تحرير الحمض النووي الريبي في خلايا CD4 + T ساذجة ، قمنا بتطوير خط أنابيب ، كما هو موضح في الشكل 4 أ (يظهر سير عمل أكثر تفصيلاً في الملف الإضافي 11: الشكل S5). كشف تحليل بيانات RNA-Seq المتوافقة عن 9877 موقعًا محتملاً لتحرير الحمض النووي الريبي (يشار إليها باسم اختلافات الحمض النووي الريبي أو RDDs) والتي يتوافق 93 ٪ منها مع SNP الموجود في تسلسل الجينوم الكامل. تمت محاذاة التسلسلات المحتوية على RDD باستخدام BLAST أو BLAT ، والتي حددت 3 ٪ أخرى من RDDs كأخطاء محاذاة ، غالبًا ما تتضمن الجينات الخادعة. تركت إزالة هذه الإيجابيات الكاذبة 333 موقعًا محتملاً لتحرير الحمض النووي الريبي. للتحقق من صحة هذه المواقع ، تم إجراء التخصيب المستهدف وإعادة تسلسل الحمض النووي والحمض النووي الريبي في 94 موقعًا. تم العثور على 22 موقعًا من خلال إعادة تسلسل الحمض النووي لتكون SNPs لم يتم استدعاؤها بواسطة WGS الأولي. من بين 72 موقعًا متبقيًا تم التحقق من صحتها ، أعيد اكتشاف 38 موقعًا على أنها RDDs. بالنسبة إلى المواقع الـ 34 المتبقية التي لم يتم إعادة اكتشافها ، لم يتم العثور على القاعدة المعدلة عند مستويات ملحوظة في بيانات التسلسل المستهدفة (تحتوي جميع الـ 34 موقعًا إما على 0 أو 1 أو 2 قراءة تدعم RDD المفترض) ، مما يعني أن التعديل الأولي ربما كان عبارة عن تسلسل خطأ. كانت المواقع التي تم التحقق من صحتها تتألف في الغالب من مواقع تحرير معروفة ومتعارف عليها (A-to-G و C-to-T) (الشكل 4 ب). لتوضيح التأثير الوظيفي للمواقع التي تم التحقق من صحتها ، حددنا ما إذا تم العثور عليها في مناطق ترميز البروتين أو مناطق غير مشفرة (أي المناطق التي تعتبر مناطق غير مشفرة أو غير مترجمة لمناطق ترميز البروتين). كما هو مبين في الشكل 4 ج ، حدثت غالبية التعديلات في المناطق غير المشفرة للنصوص ذات التأثير الواضح القليل على مناطق ترميز البروتين ، وهو ما يتوافق مع دراسة حديثة [24]. ومن المثير للاهتمام ، عند فحص ارتباط miRNA ، وجدنا أنه تم تعديل 28 تسلسلًا لبذور miRNA عن طريق تحرير RNA وتم إنشاء 25 موقعًا جديدًا عن طريق التحرير ، مما قد يشير إلى دور محتمل لتحرير RNA في تنظيم mRNA بوساطة التعبير البروتيني.

سير العمل وملخص لأحداث تحرير RNA لوحظ في ساذجة CD4 + الخلايا التائية. أ سير العمل الذي تم استخدامه لتحديد المواقع المفترضة لتحرير الحمض النووي الريبي في نسخة ساذجة من خلايا CD4 + T. يظهر عدد مواقع تحرير الحمض النووي الريبي المفترضة على المحور الصادي ويتم تمثيل أسباب استبعادها على المحور السيني. ب مصفوفة توضح جميع بدائل النوكليوتيدات التي لوحظت في مواقع تحرير الحمض النووي الريبي المؤكدة. تشير الأرقام المميزة باللون الأحمر إلى تغييرات أساسية (A-to-G و C-to-T). يتم تمييز G-to-A و T-to-C أيضًا لأن هذه التغييرات من المحتمل أن تكون تعديلات أساسية مع تعيين خيط غير صحيح لبيانات RNA-Seq. تم تمييز الأرقام بتنسيق لون أخضر هي أحداث غير متعارف عليها. ج توزيع مواقع تحرير RNA بناءً على موقعها داخل النصوص

التحليل البروتيني عن طريق دمج البيانات متعددة omics

أتاح لنا توافر البيانات الجينومية والنسخية والبروتينية عالية التغطية أن نعلق ميزات بروتينية جديدة بالإضافة إلى تنقيح التعليقات التوضيحية الموجودة [25]. باستخدام خط أنابيب علم الجينوميات الموضحة في الملف الإضافي 12: الشكل S6 ، بحثنا في أطياف الكتلة الترادفية التي لا مثيل لها مقابل قواعد بيانات تسلسل الببتيد / البروتين المخصص التي تضم المتغيرات الجينية التي كشف عنها تسلسل الجينوم الكامل. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا ببناء قواعد بيانات بروتينية مخصصة تتكون من ترجمة مكونة من 6 إطارات لجينوم بشري 19 وترجمة 3 إطارات للتعليق التوضيحي المرجعي لـ RNA-Seq (تتألف من mRNAs و ncRNAs و lncRNAs والجينات الزائفة). في مجموعة بيانات البروتين الخاصة بنا ، حددنا 10000 ببتيدات امتدت عبر وصلات لصق exon المعروفة وحددنا 17 ببتيدًا تقدم دليلاً على إمكانات الترميز لـ 11 exons جديدًا ، تم تحديدها جميعًا من بيانات RNA-Seq أيضًا. يظهر مثال على شكل إسوي جديد لـ FXR1 تم تحديده باستخدام RNA-Seq بالإضافة إلى البيانات البروتينية في الشكل 5. حددنا أيضًا 2 ORFs محتملتين في المنبع بناءً على 2 ببتيدات تم تحديدها في مناطق غير مترجمة من mRNAs المعروفة (ملف إضافي 13: الجدول S7 ). لتوصيف واكتشاف مواقع بدء الترجمة الجديدة ، بحثنا عن أستلة البروتينات الطرفية N. حددنا 1،740 N-terminal acetylated peptides ، والتي تؤكد التعليقات التوضيحية الحالية لمواقع بدء الترجمة لـ 1720 منتجًا جينيًا. لتحديد مواقع البدء البديلة ، تم إنشاء قاعدة بيانات تحتوي على بقايا ميثيونين بديلة على الفور في بداية أو أسفل مواقع البدء الترجمية المعروفة. من هذا ، تم تحديد 20 ببتيدًا بديلًا من N-termini في اتجاه مجرى تسلسل البروتين المشروح حاليًا ، مما يوفر دعمًا تجريبيًا لمواقع بدء الترجمة غير المعروفة سابقًا.

نهج علم الجينوميات لتحديد مناطق ترميز البروتين الجديدة. تم تحديد الببتيد بواسطة علم الجينوميات الذي تم تعيينه إلى منطقة intronic من FXR1 الجين. يتم تصوير أطياف MS / MS للببتيد وكثافة القراءة من بيانات RNA-Seq التي تدعم الشكل الإسوي الجديد

تعد ببتيدات الإشارة جزءًا لا يتجزأ من الانتقال اللاحق للبروتينات إلى مواقع محددة داخل الخلية أو خارجها. في الوقت الحاضر ، خوارزميات قاعدة البيانات التي تعتمد على البحث غير قادرة على التنبؤ بنجاح بمواقع الانقسام وتحديد ببتيدات الإشارة بسبب الصعوبات في تحديد تسلسل إشارات الأحماض الأمينية المشقوقة بالتريبسين غير المتوقعة [26]. للتغلب على هذه الصعوبة ، قمنا بدمج الببتيدات التجريبية التي تسبق مواقع الانقسام بناءً على تسلسل الإشارات المتوقعة من SMART [27] و SignalP4.0 [28] ومواقع الانقسام المشروحة في HPRD [29] في خط أنابيب التحليل الخاص بنا. حددنا 35 موقعًا معروفًا و 24 موقعًا جديدًا لانقسام ببتيد الإشارة (ملف إضافي 14: الجدول S8). حدد بحثنا مقابل قاعدة بيانات الجينات الزائفة المترجمة 3 ببتيدات ترسم خرائط فريدة لثلاثة جينات خادعة (ملف إضافي 15: الجدول S9) مما يشير إلى أنها في الواقع جينات جديدة مفترضة لترميز البروتين. توضح هذه النتائج أن التغطية العالية للبروتين الخلوي ببيانات مشتقة من مقياس الطيف الكتلي عالية الدقة تسمح بالاستكشاف المنهجي لتدفق المعلومات من الجينوم إلى البروتين الذي يمكن أن يزيد من شرح الجينوم.

لاستكشاف العلاقة بين البروتين ووفرة النسخ في خلايا CD4 + T ساذجة ، قمنا بربط قيم iBAQ للبروتينات وقيم FPKM النصية. تم العثور على ارتباط سبيرمان البالغ 0.35 بين قيم FPKM و iBAQ ، مما يشير إلى ضعف الارتباط بين النسخة ووفرة البروتين (ملف إضافي 16: الشكل S7). لاستكشاف دور miRNAs في القمع النسخي أو الانتقالي للجينات المعبر عنها في خلايا CD4 + T ساذجة ، تم قياس مستويات ميرنا ومقارنتها بقيم iBAQ و FPKM. من منظور عالمي ، عند النظر في البروتين ووفرة النسخ من الجينات التي تشكل أهدافًا محتملة لـ miRNAs ، وجدنا أن هناك انخفاضًا ثابتًا في متوسط ​​مستوى البروتين للجينات المستهدفة مع زيادة عدد قراءة miRNA (ملف إضافي 17: الشكل S8A) . ومع ذلك ، على مستوى النص ، لم يكن هذا الاتجاه واضحًا (ملف إضافي 17: الشكل S8B).

أنماط مثيلة الحمض النووي وتأثيرها على تعبير الحمض النووي الريبي والبروتين

تعتبر مثيلة الحمض النووي واحدة من أكثر الآليات التنظيمية المعروفة للتعبير الجيني ، مع زيادة المثيلة غالبًا ما تتوافق مع نشاط النسخ المتناقص. هنا ، قمنا بتقييم أنماط مثيلة على مستوى الجينوم باستخدام مجموعة Illumina 450 K BeadChip. أظهر ملف الميثلة العالمي توزيعًا ثنائي النسق مع 39 ٪ من المواقع التي تم فحصها تظهر hypomethylation (قيمة بيتا & lt 0.33) و 52 ٪ تظهر فرط الميثيل (قيمة بيتا & gt 0.66). في مناطق المروج (التي تم تعريفها على أنها من 0 إلى 1500 قاعدة في الجزء العلوي من موقع بدء النسخ (TSS)) ، كانت 69٪ من المواقع ناقصة الميثيل و 23٪ كانت ميثيل مفرط الميثيل. بشكل عام ، كانت مستويات المثيلة أقل بالقرب من TSS وارتفعت عبر جسم الجين و 3 UTR (ملف إضافي 18: الشكل S9).

تمت مقارنة مستويات المثيلة أيضًا بمستويات النسخ والبروتين القريبة (باستخدام FPKM و iBAQ كقياسات للنصوص والبروتينات ، على التوالي). كشف هذا أن مثيلة مناطق المروج أظهرت ارتباطًا ضعيفًا مع مستويات نسخ أقل للجينات المقابلة (ملف إضافي 19: الشكلان S10A و S10B). لم يلاحظ أي ارتباط بين وفرة البروتين ومثيلة المروج (ملف إضافي 19: الشكل S10C) أو مثيلة مناطق الجينات المختلفة (ملف إضافي 19: الشكل S10D). نحن نفترض أن عدم وجود علاقة بين مستويات البروتين المثيلة والبروتين الموجود هنا يرجع إلى تحليلنا العالمي. نظرًا لأنه لا يتم تنظيم جميع الجينات عن طريق المثيلة ، وهناك ارتباط منخفض بين مستويات النسخ والبروتين ، نعتقد أن الإشارة الحقيقية لمستويات البروتين التي تتجه مع مستويات المثيلة محجوبة. لتصحيح ذلك ، نشعر أن التقسيم الطبقي الصحيح للبيانات جنبًا إلى جنب مع العمل التجريبي الإضافي ضروري لاكتشاف التغيرات في وفرة البروتين كدالة للمثيلة.

مقارنة متعددة الأوميك لخلايا CD4 + T الساذجة مع خلايا CD4 + T للذاكرة المريحة ذات تجربة المستضد

التنظيم اللاجيني لتمايز الخلايا التائية

تتمايز خلايا Naïve CD4 + T إلى عدة سلالات من الخلايا التائية المساعدة CD4 + بعد تجربة مستضد - سلالة واحدة تستريح خلايا الذاكرة CD4 + T. تجسد خلايا الذاكرة المريحة CD4 + T التغيرات الجزيئية التي يسببها التعرض للمستضد لخلايا CD4 + T. لتشريح الآليات الجزيئية الأساسية التي تنظم هذا الانتقال ، أجرينا تحليلًا مقارنًا متعدد النطاقات لهاتين المجموعتين الخلويتين المرتبطين ارتباطًا وثيقًا. لتحديد الآليات التنظيمية المعتمدة على الميثيل المحفز ، قمنا بتقاطع بيانات الميثيلوم والنسخة من كلا نوعي الخلايا ووجدنا الجينات التي تظهر أنماط مثيلة تفاضلية قد تؤثر على التعبير الجيني. كانت المناطق المروجة للكينازات LYN و SGK1 بالإضافة إلى methyl-transferase / hydrolases METTL7A و DDAH2 ناقصة الميثيل مع زيادات متزامنة في مستويات التعبير الجيني في خلايا CD4 + T الساذجة بالنسبة لخلايا الذاكرة T (ملف إضافي 20: الشكل S11). على العكس من ذلك ، كانت مناطق المروج لـ CCR6 و chemokine CCL5 ، والتي تعتبر ضرورية لهجرة خلايا CD4 + T ، مفرطة الميثيل. إلى جانب انخفاض مستويات التعبير عن هذه الجينات في خلايا CD4 + T الساذجة ، تشير هذه النتائج إلى وجود تغييرات جزيئية محددة في المثيلة والتعبير الجيني المتضمن في الانتقال من خلايا CD4 + T الساذجة إلى خلايا الذاكرة T المسترخية التي تتوافق مع الملاحظات السابقة [ 30 - 32].

اكتشفنا بعد ذلك دور المواقع الميثيلية المرتبطة غير المروّجة في مجموعة البيانات الخاصة بنا. تم تحديد مواقع مثيلة التنظيمي المحتملة للحمض النووي من خلال مقارنة مثيلة الحمض النووي وأنماط التعبير الجيني في مئات الأورام من مجموعات بيانات TCGA واختيار المواقع التي تحتوي على ارتباط ميثيل عكسي وتعبير جيني (TCGA ، https://tcga-data.nci.nih.gov/ tcga /) [33 ، 34]. لكل موقع تنظيمي تم تحديده من مجموعة بيانات TCGA ، قمنا بفحص الاختلافات في مثيلة الحمض النووي والتعبير الجيني بين خلايا CD4 + T الساذجة وخلايا الذاكرة T (ملف إضافي 21: الجدول S10). سمح لنا هذا النهج بإثراء مواقع مثيلة الحمض النووي والجينات والمسارات المرتبطة ببيولوجيا الخلايا CD4 + T (ملف إضافي 22: الجدول S11). على سبيل المثال ، في مسار TCR ، تم ميثلة العديد من الجينات المعروفة بأهميتها لتفعيل الخلايا التائية في المواقع التنظيمية مع انخفاضات متزامنة في مستويات التعبير في الخلايا الساذجة مقارنة بخلايا الذاكرة. يشير هذا إلى تنظيم جيني لهذا المسار الحرج المطلوب لتمايز الخلايا التائية.

الاختلافات البروتينية والفوسفورية بين الخلايا التائية الساذجة والذاكرة

للتحقيق في اختلافات الإشارة بين خلايا CD4 + T الساذجة وخلايا الذاكرة CD4 + T ، استخدمنا مقاربات بروتينية وبروتينية فسفورية مقارنة. تم إجراء البروتينات الكمية باستخدام المنهجية القائمة على iTRAQ [35] ، والتي توفر مقياسًا لوفرة البروتين بين العينات. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتخصيب الفوسفوبتيدات من كلا النوعين من الخلايا باستخدام TiO22- إستراتيجية قائمة على تحديد الاختلافات الكمية على أساس وفرة الأيونات [27 ، 36]. كما هو مبين في الشكل 6 أ ، وجد أن العديد من البروتينات يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي بين خلايا الذاكرة الساذجة والراحة. ومن المثير للاهتمام أن العديد من البروتينات أظهرت مستويات فسفرة تفاضلية بين نوعي الخلايا دون أي تغيير في وفرة البروتين. تتضمن الأمثلة البارزة للبروتينات المُفسفرة التفاضلية نوعين من الكينازات سيئة التوصيف ، SGK223 و BAZ1B ، والتي أظهرت نمط فسفرة معكوس بين نوعي الخلايا (الشكل 6 ب). أظهر SGK223 مستويات مرتفعة من البروتين وكذلك الفسفرة في خلايا CD4 + T ساذجة ، بما في ذلك موقعان لم يتم الإبلاغ عنهما سابقًا ، Ser508 و Ser805. عبّرت خلايا الذاكرة عن مستويات بروتينية أعلى من كينازات المعروف عنها أنها تلعب أدوارًا حاسمة في تنشيط الخلايا التائية ، بما في ذلك LYN و SYK و BTK و TBK1. يتوافق التعبير الأعلى عن هذه الكينازات في خلايا الذاكرة مع الفكرة القائلة بأن التعرض للمستضد لخلايا الذاكرة يؤدي إلى استجابة مناعية قوية وأسرع بحكم وجود مستويات مرتفعة من جزيئات الإشارة [38]. أشار تحليلنا البروتيني أيضًا إلى الفسفرة التفاضلية لبروتينات المحول المدروسة جيدًا في إشارات الخلايا التائية. على سبيل المثال ، بروتين 11 الذي يحتوي على مجال توظيف caspase (CARD11) هو جزيء سقالة متعدد المجالات مسؤول عن التوسط في تنشيط NF-kB أثناء تنشيط الخلايا التائية [39 ، 40]. من المعروف أن الفسفرة في Ser552 و Ser564 و Ser657 في CARD11 تحفز تنشيط NF-kB بوساطة CARD11 بينما من المعروف أن الفسفرة في Ser649 تعمل على تنظيم تنشيط NF-kB [41 ، 42]. ومع ذلك ، كان الأمر الأكثر إثارة للاهتمام هو البروتينات التي لم يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي بين العينات ، ولكن تم فسفرتها تفاضليًا. أظهر BAZ1B ، وهو أحد أنواع التيروزين كيناز المكتشفة مؤخرًا ، مستويات بروتين مماثلة في كلا النوعين من الخلايا ، لكنه أظهر مستويات عالية من الفسفرة في خلايا الذاكرة. تم تحديد ستة مواقع فسفرة تفاضلية على BCL10 ، وهو مكون رئيسي في مجمع CARD11-BCL10-MALT1 الذي ينظم تنشيط NF-kB [43 ، 44]. كانت المواقع الجديدة Ser121 و T130 و S134 و S136 و Ser141 والمعروفة سابقًا Ser138 جميعها شديدة الفسفرة في خلايا الذاكرة CD4 + T. ينظم Ser138 بشكل سلبي تنشيط NF-kB وبالتالي فإن الفسفرة المتزايدة لهذا الموقع في الخلايا الساذجة تتوافق مع قلة خبرة المستضد حيث يكون تنشيط NF-kB محدودًا [45].

المثيلة التفاضلية والتعبير الجيني / البروتيني ونمط الفسفرة بين خلايا CD4 + T الساذجة وخلايا الذاكرة التائية. أ تعبير البروتين التفاضلي ونمط الفسفرة بين الخلايا الساذجة والذاكرة CD4 + T. ال نقاط البيانات السوداء تمثل مستويات التعبير النسبي للبروتين بين الخلايا التائية الساذجة والذاكرة بينما تشير الأشرطة الحمراء والزرقاء إلى مستويات الفسفرة النسبية في الخلايا التائية الساذجة والذاكرة ، على التوالي. ب أمثلة على الكينازات والفوسفاتازات والبروتياز وعوامل النسخ وجزيئات الإشارة التي أظهرت اختلافات كبيرة في مستوى التعبير و / أو مستويات الفسفرة بين الخلايا الساذجة والذاكرة التائية. تمثل الأشكال البيضاوية الرأسية والأفقية البروتينات وتمثل الدوائر مواقع الفسفرة. يشار إلى المستويات الأعلى في خلايا الذاكرة باللون الأزرق ، بينما يشار إلى المستويات المنخفضة في أحمر بينما يشار إلى الوفرة التي لم تتغير بواسطة لون رمادي

أثناء تنشيط الخلايا التائية ، يحول الانقسام المحلل للبروتين بواسطة كاسباس 3 pro-IL16 إلى IL16 ، وهو عامل كيميائي مثير للالتهابات يحفز هجرة الخلايا [46 ، 47]. إن سلائف IL16 pro-IL16 عبارة عن بروتين سقالة نووي وحشوي يشارك في إيقاف دورة الخلية من خلال الارتباط بمجموعة واسعة من البروتينات بما في ذلك HDACs والقنوات الأيونية في الخلايا التائية المريحة [48]. في دراستنا ، كانت مستويات التعبير عن البروتين pro-IL16 قابلة للمقارنة بين الخلايا الساذجة والذاكرة CD4 + T. ومع ذلك ، كانت أنماط الفسفرة مختلفة بين هاتين الخليتين المرتبطتين ارتباطًا وثيقًا. لقد حددنا 16 موقعًا للفسفرة ، 10 منها جديدة ، في pro-IL16. ومن المثير للاهتمام ، أن 6 من 16 موقعًا تمت فسفرتها بدرجة عالية في خلايا CD4 + T ساذجة بينما كان Thr1058 شديد الفسفرة في خلايا الذاكرة. تتوازى هذه النتائج مع الأدوار المختلفة التي يلعبها pro-IL16 في خلايا CD4 + T الساذجة والذاكرة. من خلال تحليل مشترك للبيانات الكمية البروتينية والفوسفورية ، تمكنا من التحقيق في بيولوجيا الخلايا التائية واكتساب رؤى جديدة في التنظيم بوساطة الفسفرة لهذين النمطين الظاهريين للخلية. تشير هذه النتائج معًا إلى دور نشط للكينازات الجديدة وتكشف عن أحداث إشارات قد تكون حاسمة في تنشيط الخلايا التائية.

من خلال دمج البيانات من methylome و transcriptome والبروتيوم والبروتيوم phosphoproteome ، حصلنا على نظرة شاملة للأحداث الجزيئية التي تنظم الخلايا التائية الساذجة والذاكرة (الشكل 7). لتقييم فائدة المسار المتكامل ، قمنا بتقييم العديد من جزيئات الإشارة الرئيسية في سياق وظيفة المناعة. بالنظر إلى أن كلا مجموعتي الخلايا في حالة راحة ، فإن LCK ، وهو كيناز رئيسي في اتجاه مجرى الدم في مسار TCR ، لم يتغير على مستوى البروتين والفسفرة. ومع ذلك ، كانت CD4 و ITK و AKT1 مفرطة الميثيل في خلايا CD4 + T ساذجة ، مع انخفاض مصاحب في مستويات النسخ والبروتين. كان البروتين التيروزين الفوسفاتيز ، نوع المستقبل ، C (PTPRC ، المعروف أيضًا باسم CD45) و KRAS استثناءين ملحوظين لهذا النمط. لقد تم مؤخرًا تورط مستويات البروتين العالية من KRAS في خفض عتبة تنشيط TCR في الخلايا التائية [49]. هنا ، وجدنا hypomethylation لـ KRAS في خلايا الذاكرة جنبًا إلى جنب مع مستويات عالية من البروتين والبروتين. في المقابل ، في الخلايا الساذجة يكون KRAS مفرط الميثيل وله مستويات نسخ أقل ، بما يتوافق مع عتبة تنشيط TCR أعلى. مجتمعة ، تتوافق الملاحظات من هذا النهج المتكامل مع ما هو معروف عن مسار TCR ، مما يدل على قوة مجموعة بيانات متعددة omics لاكتساب رؤى جزيئية شاملة.

مسار إشارات مستقبلات الخلايا التائية يظهر وسطاء في اتجاه مجرى النهر ينظمهم مثيلة الحمض النووي ، وتعبير الجين / البروتين و / أو فسفرة البروتين. مسار إشارات مستقبلات الخلايا التائية الذي يصور الجينات مع حالة مثيلة المروج المقابلة لها ومستويات التعبير الجيني والبروتيني وحالة الفسفرة بين الخلايا التائية الساذجة والذاكرة. تم استيراد حالة مثيلة المروج ، والقياسات النصية ، والبروتينية ، والبروتينية الفوسفورية إلى GeneSpring وتراكبها على مسار إشارات TCR لتحديد التواقيع الجزيئية الكامنة وراء الانتقال من خلايا CD4 + T الساذجة إلى خلايا الذاكرة CD4 + T. مختلف الأشكال تستخدم للدلالة على مثيلة المروج ، مرنا ، البروتين وحالة الفسفرة. أحمر يشير إلى ارتفاع في خلايا CD4 + T الساذجة ، أزرق يشير إلى خلايا CD4 + T عالية في الذاكرة ويتم تصوير الخلايا غير المتغيرة في أبيض. مختلف سهام ملونة تُستخدم لتصوير طرق مختلفة لتنظيم مكونات المسار

التكامل مع مجموعات البيانات الأخرى

أخيرًا ، سعينا إلى تقييم بياناتنا جنبًا إلى جنب مع الدراسات المنشورة مؤخرًا حول خلايا CD4 + T الساذجة والذاكرة لفحص التوافق واستكشاف كيف يمكن لبياناتنا أن تكمل مجموعات البيانات المتاحة.

لاستكشاف العلاقة بين المثيلة والنسخ في الخلايا الساذجة والذاكرة CD4 + T ، كوموري وآخرون. استخدم RNA-Seq وتسلسل بيسلفيت المستهدف لـ 2100 جين. أبلغوا عن 132 جينًا مع مثيلة تفاضلية بين الخلايا الساذجة والذاكرة CD4 + T. من بين هذه الجينات الـ 132 ، أظهر 39 جينة انخفاضًا في المثيلة مع زيادة متزامنة في وفرة النسخ في الخلايا الساذجة مقابل خلايا الذاكرة. لسوء الحظ ، كانت قيم المثيلة الكمية متاحة لـ 40 فقط من هذه الجينات ، وبالتالي بالنسبة لتحليلنا ، قمنا بتعيين تعيينات المثيلة "المتزايدة ، وعدم التغيير ، والخفض" للجينات 132 في 1 و 0 و -1 ، على التوالي ، من أجل تحليلنا. عند مقارنة مستويات المثيلة عبر الدراستين ، لاحظنا ارتباط بيرسون بمقدار 0.42 (ملف إضافي 23: الشكل S12A). تمت زيادة هذا الارتباط إلى 0.61 عندما تمت مقارنة 40 جينًا فقط حيث كانت قيم المثيلة متاحة (ملف إضافي 23: الشكل S12B).

بعد ذلك ، قمنا بتقييم مدى ارتباط مستويات المثيلة بالتعبير عن النصوص المشتقة من الجينات المجاورة. لهذا ، قمنا بتقييد مقارنتنا بخلايا الذاكرة CD4 + T المريحة وخلايا CD4 + T الساذجة غير النشطة والجينات المختارة التي أظهرت علاقة عكسية بين المثيلة والنسخ. بالرغم ان كوموري وآخرون. وصف علاقة عكسية بين مستويات المثيلة ونسخ هذه الجينات لم نلاحظ اتجاهًا عامًا مشابهًا في بياناتنا (ملف إضافي 23: الشكل S12C). لتحديد ما إذا كان هذا بسبب الاختلافات العالمية في مستويات النسخ بين كل دراسة ، قمنا بمقارنة قيم RPKM من كوموري وآخرون. مع قيم FPKM من دراستنا. استنتجنا معامل ارتباط بيرسون بمقدار 0.58 يشير إلى أن مستويات النص بين كل تجربة على حدة كانت متسقة إلى حد ما (ملف إضافي 23: الشكل S12D). ستكون هناك حاجة إلى تجارب إضافية لحل هذه التباينات الواضحة.

منشور حديث بواسطة جريسيل وآخرون. تميزت بروتينات سطح الخلية لخلايا CD4 + T الساذجة والمنشطة والتي استخدمت فيها استراتيجية تخصيب تستهدف البروتينات السطحية N-glycosylated لتحديد 173 بروتينًا على سطح الخلية عن طريق قياس الطيف الكتلي. تم استكمال ذلك بقياس التدفق الخلوي لتحديد 123 بروتينًا إضافيًا على سطح الخلية ، لما مجموعه 229 بروتينًا معبرًا على سطح خلايا CD4 + T الساذجة والمنشطة. بسبب التنميط البروتيني العميق لخلايا CD4 + T الساذجة في دراستنا ، سعينا إلى التكميل جريسيل وآخرون. أطلس السطح. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأننا أجرينا تحليلًا مقارنًا لخلايا CD4 + T للذاكرة الساذجة والراحة ، فقد أردنا تحديد التغييرات التي قد تكون عابرة أثناء تنشيط خلايا CD4 + T الساذجة ، وأي تغييرات بروتينية تستمر في حالة الذاكرة المريحة.

أولا ، للتوسع جريسيل وآخرون. الأطلس السطحي ، حددنا البروتينات من دراستنا باستخدام إستراتيجية المعلومات الحيوية الخاصة بهم للاحتفاظ بالبروتينات المشروحة على أنها "غشاء" أو "مُفرَز" في قواعد بيانات UniProtKB / Swiss-Prot. حدد هذا التحليل 1767 بروتينًا مرشحًا في مجموعة البيانات الخاصة بنا. لإجراء تقدير أكثر تحفظًا ، استخدمنا معيارًا إضافيًا للاحتفاظ بالبروتينات المشروحة على أنها غشاء أو خارج الخلية بواسطة شرح GO ، مما أدى إلى 1166 بروتينًا. طبقنا نفس المرشحات على جريسيل وآخرون. البيانات البروتينية ، ووجدت 146 بروتينًا تفي بهذه المعايير. بين مجموعات البيانات لدينا ، كان هناك تداخل من 104 بروتينات على سطح الخلية ، مع وجود 42 بروتينًا فقط في جريسيل وآخرون. و 1،062 بروتينًا حصريًا لبياناتنا (ملف إضافي 24: الشكل S13A). من المحتمل أن يكون التباين في العمق بسبب جريسيل وآخرون. اعتماد إستراتيجية تخصيب بروتين N-glycoprotein بدلاً من طرق التجزئة العميقة العالمية المستخدمة في دراستنا.

بعد ذلك ، قمنا بمقارنة التغييرات التي تم قياسها بواسطة جريسيل وآخرون. بعد تنشيط خلية CD4 + T الساذج باستخدام αCD3 / αCD28. جريسيل وآخرون. أبلغت عن مجموعة من 108 بروتينات مع زيادة تعبير سطح الخلية بعد 24 ساعة من التنشيط. في بياناتنا ، وجدنا أن تعبير البروتين عن هذه البروتينات البالغ عددها 108 بروتينات يزداد ، في المتوسط ​​، في ذاكرة الراحة CD4 + خلايا T (ملف إضافي 24: الشكل S13B). ترتبط العديد من هذه الجينات ارتباطًا وثيقًا بتمايز الخلايا التائية البشرية ووظائفها مثل الانتشار (على سبيل المثال ، جزيئات الأسرة الفائقة CD2 ، TNSFS14 ، CD147) ، ونقل جزيئات الطاقة (على سبيل المثال ، جينات GLU3 ، SLC) ، والالتصاق الخلوي والهجرة (على سبيل المثال ، CD29 ، CD226) ، ومكونات معالجة وعرض مستضد لتشمل CD74 (سلسلة ثابتة) وجزيئات HLA.


مناقشة

وحدات الاستجابة السريعة للملح المحددة زمنياً في جذور برموداغراس

يكشف تحليل النسخ السابق للنباتات عن استراتيجية الاستجابة التفاضلية في مراحل مختلفة من الإجهاد الملحي [31 ، 32]. على سبيل المثال ، تستجيب النباتات للإجهاد التناضحي الأولي عن طريق زيادة التركيزات داخل الخلايا للأسموليت [2]. بعد التعرض لكلوريد الصوديوم لمدة 24 إلى 72 ساعة ، يتم رفع سمية Na + إلى مهمة أكثر إلحاحًا [23 ، 24]. للتحقيق في تعديلات النسخ من جذور برموداغراس لصدمة الملح في المرحلة المبكرة ، تم اختيار ساعة واحدة أولاً لدراسة الاستجابة الفورية للملح. اخترنا بعد ذلك 6 ساعات كنقطة زمنية للعلاج للتحقيق في رد الفعل التالي الفوري بعد الاستجابة المبكرة للملح (ساعة واحدة) بناءً على الدراسة السابقة التي توضح أن فول الصويا واجه مرحلة إجهاد تناضحي أولية في 1 ساعة إلى 4 ساعات بعد معالجة الملح [2]. علاوة على ذلك ، لا يزال يتم اختيار 24 ساعة للتحقق مما إذا كانت استراتيجية الاستجابة للملح قد بدأت في التغيير في برموداغراس لأن 24 ساعة قد تكون نقطة تحول حيث قد تبدأ استراتيجية الاستجابة للملح في التغيير في بعض النباتات [23 ، 24].

في برموداغراس ، تم تنظيم حوالي 2.4 و 6 مرات أكثر من الجينات المستجيبة للملح المستمدة من فئات جينية مختلفة بشكل تفاضلي في الجذور المعرضة للملح لمدة ساعة واحدة مقارنة بتلك التي تعرضت للملح لمدة 6 ساعات أو 24 ساعة على التوالي ، مما يشير إلى استجابة سريعة بعد التعرض للملح (الشكل 3). على سبيل المثال ، تم اكتشاف العديد من مستقبلات الإشارة مثل كينازات (مثل LRR ، مثل thaumatin ، RLK1 ، DUF26 ، LLD ، LRK10 مثل ، PERK ، و WAK) على الفور وبشكل حصري في 1 ساعة (الشكل S4a). تستجيب كينازات مستقبلات الإشارة هذه دائمًا في وقت مبكر لتعمل في فسفرة البروتين وتعديله ، وهي خطوة مهمة في بدء مسارات إشارات استجابة الملح وتؤدي في النهاية إلى تنظيم النسخ [33 ، 34 ، 35 ، 36 ، 37]. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي إشارة الملح أيضًا على الفور إلى تحفيز مسارات هرمونات المصب ، والتي من المعروف أنها تشارك في استجابات الإجهاد في نطاق واسع [19 ، 38]. في هذه الدراسة ، تم إثراء الجينات المشاركة في التخليق الحيوي ABA وصناديق نقل الإشارة الفرعية (17.1.1 ، 17.1.2 ، 17.1.3) باستمرار في جميع النقاط الثلاث (على سبيل المثال NCED PP2C و ABFs) (الشكل 5 أ) ) ، مما يشير إلى الدور الثابت للاستجابة للملح [9]. ومع ذلك ، لاحظنا أيضًا أن النصوص المشاركة في عملية التمثيل الغذائي للتخليق الحيوي ونقل إشارة ETH (على سبيل المثال ACC synthase ACC oxidase و ERF) و JA (على سبيل المثال AOS1 و AOC4) ، تم تمثيلها بشكل مفرط بشكل مفرط عند 1 ساعة من التعرض للملح (الشكل 1 أ). 4 أ الجدول S2) ، مشيرًا إلى أن مسارات التمثيل الغذائي للهرمونات المستجيبة للملح قد تشارك في تقدم الاستجابة السريعة للملح في جذور البرمودا [32 ، 39 ، 40]. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ تحريض النصوص المشاركة في تدهور CTK و GA (الشكل 4 أ ، الجدول S2). تشير النصوص التي ترميز إنزيم gibberellin 2-oxidase المهين للجبريلين (متماثلان لـ At4g21200 و At1g75450 على التوالي) إلى أن نمو الخلية قد تم تثبيطه جزئيًا للبقاء على قيد الحياة تحت ضغط الملح البيئي. تم تنظيم التعبير عن 9 نسخ على الأقل من متماثلات AtCKX6 (At1g75450) (الجدول S2) ، والتي تشفر إنزيم السيتوكينين أوكسيديز / ديهيدروجينيز الذي يشارك في تحفيز تحلل السيتوكينات [41 ، 42]. تشير هذه النتائج إلى أن إشارات الهرمونات لا تعمل بمفردها أثناء التوسط في الاستجابة للملح ولكنها قد تعمل في شبكة تداخل متعددة مع هرمونات أخرى.

أحداث الفسفرة داخل الخلايا هي عبارة عن محولات استشعار أساسية في النباتات ، مثل CDPKs [9،10،11،12،13،14] و MAPK المتسلسل [43،44،45] ، والتي تم الإبلاغ عنها أنها محولات استشعار أساسية في النباتات. في هذه الدراسة ، استجاب بعض أعضاء الجينات المشاركة في إشارات الكالسيوم مباشرة بعد التعرض للملح لمدة ساعة واحدة (على سبيل المثال CDPK11 و CAM3 و CPK5 و CML43) (الشكل S4a ، الجدول S2). تم تمثيل بعض جينات ترميز ATPase الناقلة للكالسيوم بشكل مفرط عند ساعة واحدة ، مما قد يعزز النقل عبر الغشاء لـ Ca 2+ (الجدول S2). أ MAPK2 الجين (الكتلة -342،212.26954) ، وهو متماثل لـ At2g43790 ، تم تنظيمه أيضًا بشكل حصري عند ساعة واحدة (الشكل S2b) وقد يتفاعل مع ROS والهرمون في استجابة الملح [46 ، 47]. قد يؤدي التنظيم الفوري لهذه البروتينات المشفرة للجينات إلى تحفيز إعادة تكوين الترنسكريبتوم في اتجاه مجرى النهر للتعامل مع حالة الملح المجهدة [48].

في جذور برموداغراس ، حددنا أيضًا أكثر من عشر عائلات من عوامل النسخ ، والتي تم تحفيزها بشكل كبير في نقطة زمنية واحدة أو أكثر بعد التعرض للملح (الشكل S5). كان عدد TFs المستحث أكثر بكثير عند ساعة واحدة من النقاط الزمنية الأخيرة. من بين تلك TFs و AP2 و WRKY و bHLH و HB استحوذت على نسبة كبيرة من إجمالي عدد الصناديق المستحثة بالملح التي تم تحديدها وتم تحفيز العائلات الثلاث (MYB و HB و bZip) بشكل كبير في جميع النقاط الزمنية الثلاث (الشكل 5 ب). الجدول S2). تم التحقيق في عامل نسخ HSF واحد باعتباره الجين المحوري لشبكة التعبير المشترك brown4 في هذه الدراسة (الشكل 6 د). أظهر التعبير عن عامل نسخ HSF هذا منظمًا بواسطة الملح في جميع النقاط الزمنية الثلاث ويمكن أن يكون هدفًا جيدًا للدراسات المستقبلية (الشكل 7f S7). تمشيا مع الدراسات السابقة التي تشير إلى أن WRKY TFs يمكن أن تشارك بشكل إيجابي أو سلبي في تحمل الملح [49] ، لاحظنا أيضًا أن 20 من 23 WRKY TFs تم اكتشافها بشكل كبير استجابة لمعاملة الملح لمدة ساعة في الجذور (الشكل S5 ، الجدول S2) . تم الإبلاغ عن عائلة AP2 / EREBP أيضًا لتشمل بعض TFs المستجيبة للإجهاد [50]. لاحظنا أيضًا أن 16 من 17 نسخة من AP2 تم تنظيمها بعد 1 ساعة من معالجة الملح (الجدول S2). تحت ضغط الملح ، كانت عائلة TF الأخرى الأكثر تأثرًا في الجذور هي bHLH ، حيث تم إحداث 24 من 28 نسخة في ساعة واحدة و 10 من 19 تمت زيادتها في 6 ساعات بواسطة إجهاد الملح (الجدول S2). من بين هذه الصناديق المستحثة لـ bHLH ، بعض الأعضاء المهمين الذين تم الإبلاغ عن مشاركتهم بشكل إيجابي في استجابة الإجهاد الملحي مثل bHLH92 [51]. تم إثراء عائلات Aux / IAA بشكل كبير في النصوص المستجيبة للملح خاصة في ساعة واحدة مع جميع النصوص الـ 12 التي تم تنظيمها بالكامل بواسطة إجهاد الملح (على سبيل المثال IAA5 ، 12 ، 20 ، 24 ، 18 ، 23) (الجدول S2). هذه الاستجابة للملح جينات Aux / IAA لها دور مركزي في استجابة auxin وقد تعمل على دمج الإشارة من المحفزات البيئية في شبكة تنظيم الجينات المرتبطة بالأوكسين [52]. لذلك ، هنا ، لاحظنا أن بعض العمليات البيولوجية استجابت في المرحلة المبكرة من إجهاد الملح ، بما في ذلك بشكل أساسي نقل الإشارة ، والتمثيل الغذائي للهرمونات وتنظيم TFs. قد تشكل هذه الاستجابات السريعة بعد ذلك سلسلة لتفعيل سلسلة من عوامل الاستجابة النهائية.

آليات استجابة الملح الإيجابية الشائعة والمميزة في جذور البرمودا

طورت النباتات عائلات جينية متنوعة لإزالة السموم من أنواع الأكسجين التفاعلية التي تسببها البيئات القاسية مثل الملح [19 ، 20]. في دراستنا ، كان نشاط POD أعلى بشكل ملحوظ في جذور النباتات المعالجة بالملح لمدة ساعة و 6 ساعات مقارنة بتلك الموجودة في جذور التحكم الخاصة بكل منها (الشكل 1 ب). ومع ذلك ، أظهر نشاط SOD لمدة ساعة و 6 ساعات من الجذور المعالجة بالملح اتجاهًا تصاعديًا ، لكن الزيادة لم تكن كبيرة مقارنة بمصانع التحكم الخاصة بها (الشكل 1 ج). وفقًا لذلك ، تم تنظيم عدد قليل من أعضاء جينات ترميز POD ولكن لم يتم تنظيم جينات ترميز SOD في بيانات النسخ الخاصة بنا (الشكل 4 د ، الجدول S2). نظرًا لأن الإجهاد التأكسدي هو نتيجة لتدهور بيروكسيد الدهون (المشار إليه بواسطة MDA) الناتج عن ROS ، قمنا أيضًا بقياس محتوى MDA في الجذور. ومع ذلك ، فإن محتوى الجذور MDA أظهر قيمة أعلى من نباتات التحكم حتى تعرض الملح لمدة 24 ساعة (الشكل 1 أ) ، مما يشير إلى تراكم تدريجي مع زيادة وقت المعالجة. الأعضاء الآخرون من عائلات الجينات المشفرة لأكسيدازات النحاس ، الجلوتاثيون S ترانسلايز ، بيتا 1،3 جلوكان هيدروليز ، UDP جلوكوزيل وجلوكورونيل ترانسفيراز ، بروتينات شبيهة بالبلاستوسيانين (الشكل 4 د الجدول S2) تم تنظيمها أيضًا في نقطة زمنية واحدة أو أكثر إلى التعامل مع الإجهاد الملح. على سبيل المثال ، UDP glucosyl transferases UGT79B2 / B3 in أرابيدوبسيس تم الإبلاغ عن المساهمة في تحمل الإجهاد اللاأحيائي مثل الملح والجفاف من خلال التأثير على تراكم الأنثوسيانين وتعزيز إزالة أنواع الأكسجين التفاعلية [53]. تمشيا مع الدراسات السابقة في النباتات ، كانت بعض المستقلبات الثانوية النشطة بيولوجيًا في جذور البرموداغراس (مثل الكاروتينات والتوكوفيرول والفلافونيدات) [54،55،56] تم تمثيلها بشكل مفرط تحت الملح ويمكن أيضًا أن تكون بمثابة كاسحات ROS (الشكل 4 ب). الجدول S2). كما هو متوقع ، تم تنظيم الجينات المنظمة لمستويات المواد الواقية من التناضح بشكل كبير في هذه الدراسة. وقد اشتملت على جينات ترميز مركبات الجالاكتينول ، سينثاز رافينوز ، تريهالوز ، كالوز وجلاكتوز (الشكل S4d) ، والتي تم الإبلاغ عنها باعتبارها الجينات الأولى التي تسبب الإجهاد تحت ضغط الملح [23،24،25،26].

يتكون جدار الخلية النباتية من السليلوز ، والهيميسليلوز ، واللجنين ، والبكتين والعديد من البروتينات السكرية [57 ، 58] ويعتبر عاملاً مهمًا للإحساس بالإجهاد الملحي والاستجابة له. لاحظنا أيضًا أن الجينات المشاركة في تصنيع السليلوز (10.2) وتخليق الهيميسليلوز (10.3) وتخليق اللجنين (16.2.1) كانت ممثلة بشكل مفرط في جذور البرموداغراس المعالجة بالملح (الشكل 4f). تم تحفيز التعبير عن جينات عائلة جليكوسيد هيدرولاز (GH17) بشكل كبير تحت ساعة واحدة من إجهاد الملح (الشكل 4 د الجدول S2) ، مما يشير إلى أنه قد يشارك في التعديلات اللاحقة للترجمة للبروتينات المرتبطة بجدار الخلية ويؤدي إلى تغيير الخلية. مرونة الجدار [59 ، 60]. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت أيضًا عائلات الجينات الأخرى المرتبطة بجدار الخلية والتي تعمل في قابلية تمدد جدار الخلية تنظيمًا تفاضليًا في النصوص المستجيبة للملح. على سبيل المثال ، التعبير عن MUR4 تم العثور عليه منظمًا في جذور البرموداغراس (الشكل 4f) ، وأفيد بأنه يعمل في التخليق الحيوي لـ UDP-arabinose. طفرة في MUR4 يؤثر على سلامة جدار الخلية ويؤدي إلى التصاق خلوي خلوي معيب مع استطالة منخفضة للجذر تحت الملوحة العالية [61]. علاوة على ذلك ، تم العثور على العديد من جينات ترميز AGPs (بروتينات أرابينوجالاكتان) منظمة بالملح على مستوى النسخ في دراستنا (الشكل 4f). تم الإبلاغ أيضًا عن ارتباط AGPs على جدران الخلايا أو أغشية البلازما بنمو الخلايا [62 ، 63] ومن المعروف أن AGP (SOS5) يساهم في تحمل الملح في أرابديوبسيس [64]. لاحظنا أيضًا استجابة سابقة لعملية التمثيل الغذائي للدهون في جذور برموداغراس. على وجه الخصوص ، تم تنظيم التعبير عن الجينات المشاركة في تخليق واستطالة FA ، بينما تم تنظيم الجينات المشاركة في إزالة تشبع FA وتدهور الدهون بشكل كبير على الفور عند تعرضها للملح لمدة ساعة واحدة (الشكل S4b). أظهرت الدراسات أن FA desaturases تلعب دورًا مهمًا في الحفاظ على الوظيفة البيولوجية للأغشية في الخلايا النباتية في ظل ظروف مختلفة بما في ذلك الإجهاد الملحي [65 ، 66]. هنا ، أدى إجهاد الملح إلى تغيير ملحوظ في التعبير عن الجينات التي تشفر ω-3 FA desaturases والتي قد تؤدي إلى تغيير تركيبة FA (الشكل S4b ، الجدول S2). يمكن أن يوفر التنظيم الفوري لترميز الجينات لإعادة تركيب تركيبة الدهون رؤى جديدة لتحسين تحمل الملح لعشب البرمودا.

بخلاف الجينات المرتبطة بالتمثيل الغذائي الثانوي والتي شاركت بشكل كبير في تعديل جدار الخلية (الشكل 4f) ، تم تحفيز بعض مسارات التمثيل الغذائي الثانوية المهمة بشكل كبير في نقطة زمنية طويلة ، مما يشير إلى تفاعلات أبطأ قليلاً والتي قد تتضمن تعديل التمثيل الغذائي [67 ، 68]. على سبيل المثال ، تم تمثيل الصندوق الفرعي لتخليق البوليامين بشكل زائد فقط بعد 6 ساعات و 24 ساعة من معالجات الملح. تم تمثيل بعض الصناديق الفرعية المدرجة في التمثيل الغذائي الثانوي مثل الفينول البسيط والجلوكوزينات والأيسوفلافون والتخليق الحيوي توكوفيرول بشكل مفرط في 24 ساعة (الشكل 4 ب الجدول S2). تم الإبلاغ سابقًا عن مشاركة هذه الأيضات الثانوية في الاستجابة التأكسدية للنباتات في بعض الأنواع [67 ، 68]. على سبيل المثال ، تم العثور على التعبير عن جينات ترميز اللاكاز بشكل منظم للغاية خاصة عند التعرض للملح لمدة 24 ساعة ، والتي قد تشارك في أكسدة وتقليل الفينولات البسيطة في جذور البرموداغراس وتخفيف الإجهاد المؤكسد الناجم عن الإجهاد الملحي [69) ، 70].

فئات الجينات الخاضعة للتنظيم من خلال إجهاد الملح في جذور برموداغراس

في هذه الدراسة ، كانت الجينات الخاضعة للتنظيم أكثر وفرة في جميع النقاط الزمنية الثلاث على التوالي (الشكل 2 ج) ، مما يشير إلى تأثير التنظيم السلبي الهائل للنسخ على استقلاب النبات وعمله. في الواقع ، فئات الجينات المخصبة الهامة مثل التمثيل الغذائي للهرمونات ، عوامل النسخ ، متفرقات. واحتوى التمثيل الغذائي الثانوي أيضًا على عدد كبير من الجينات الخاضعة للتنظيم (الجدول S2). على سبيل المثال ، الجينات المشاركة في تخليق أو تدهور البراسينوستيرويد (مثل أفراد عائلة CYP450) ونقل الإشارة (مثل BRI) تم تنظيمها بشكل كبير عن طريق الإجهاد الملحي (الجدول S2) ، مما يشير إلى تفاعل الهرمونات للمشاركة في استجابة الملح في برموداغراس [71) ]. على الرغم من أن سلسلة من عائلات تمويل الإرهاب أظهرت التنظيم ، إلا أن عائلات تمويل الإرهاب الأخرى مثل ج2ح2 وأظهر HAP عددًا كبيرًا من الجينات الخاضعة للتنظيم في نقطة زمنية واحدة أو أكثر (الجدول S2). عامل نسخ HAP AtHAP3b و C2ح2 تم الإبلاغ سابقًا عن أن البروتين Zat7 يلعب أدوارًا رئيسية في استطالة الجذر الأولية لتعزيز تحمل الجفاف ومقاومة الملح في أرابيدوبسيس ، على التوالي [72 ، 73].

في الدراسات البروتينية السابقة ، قلل علاج كلوريد الصوديوم من ترجمة البروتين ، وهو ما يتوافق مع تقليل تنظيم النصوص المتعلقة ببروتينات الريبوسوم في هذه الدراسة (الشكل S3 ، الجدول S2) [27 ، 74]. لاحظنا أيضًا أن عدد DEGs بعد 1 ساعة من معالجة الملح كان أعلى نسبيًا من الرقم بعد 6 ساعات و 24 ساعة معالج بالملح (الشكل 2 ج ، د). المزيد من بروتينات الريبوسوم التي تشفر الجينات والجينات المرتبطة بعملية التمثيل الغذائي للبروتين كانت أيضًا ممثلة بشكل كبير في الجينات ذات التنظيم المنخفض فور تعرضها للملح لمدة ساعة واحدة ، مما يشير إلى أن المزيد من الجينات المشاركة في استقلاب البروتين أو الأحماض الأمينية تم تنظيمها بسرعة وسلبية.تم تنظيم الجينات المشاركة في تعديل نقل البروتين مثل كيناز ومسارات الانتشار (الشكل S3). والجدير بالذكر أن غالبية الجينات المرتبطة ببروتينات E3 RING و E3 SCF تم تحفيزها بشكل كبير عن طريق إجهاد الملح (الشكل S3 ، الجدول S2) ، مما يشير إلى أن هذه الإنزيمات قد تعمل بطرق قد تكون مستقلة عن البروتينات 26S أثناء الاستجابة للملح [75]. قد يؤدي تخليق البروتين المثبط وتحسين تحلل البروتين إلى زيادة تركيز الأحماض الأمينية الحرة ، وخاصة البرولين ، الذي يمكن أن يعمل كمواد واقية تناضحية. في هذه الدراسة ، تم تحفيز محتوى البرولين في جذور البرمودا بشكل كبير بعد التعرض لكلوريد الصوديوم (الشكل 1 د). يمكن لهذه الأحماض الأمينية الحرة أن تبدأ في تصنيع الديهيدرين أو البوليامين ، والذي قد يعمل في الحفاظ على بنية البروتين وغشاء الخلية تحت الملح [2]. ومع ذلك ، لم يتم تمثيل الفئة ذات الصلة بالبرولين التخليقي بشكل كبير ، مما يشير إلى أن الجينات المشاركة في استقلاب البرولين قد لا تتلقى تنظيمًا نسبيًا مهمًا في جميع نقاط المعالجة الزمنية في هذه الدراسة.

علاوة على ذلك ، قلل إجهاد الملح من التعبير عن الجينات المشاركة في دورة حمض الكربوكسيل (TCA) ، وهو المسار التنفسي الرئيسي في الكائنات الهوائية (الشكل S1a ، الجدول S2). على سبيل المثال ، تم إثراء الجينات التي تشفر البيروفات ديهيدروجينيز ، والتي تعمل في تحويل البيروفات إلى أسيتيل CoA وبالتالي تربط مسار التحلل السكري بدورة TCA ، بين فئات الجينات الخاضعة للتنظيم السفلي (الشكل S1a الجدول S2). أيضًا ، تم إثراء الجينات التي تشفر مكونات سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا مثل نازعات الهيدروجين NAD (P) H و F1-ATPase بشكل حصري بين فئات الجينات الخاضعة للتنظيم السفلي (الشكل S1b الجدول S2). هذا يشير إلى أن الميتوكوندريا قد تتضرر بسبب الإجهاد التأكسدي. أيضًا ، لاحظنا أن الجينات المشاركة في تخليق الحمض النووي وتنظيم الخلية كانت خاضعة للتنظيم السفلي خاصة عند الساعة 1 و 6 ساعات (الشكل S1c ، 1d). قد تعمل هذه الفئات الجينية معًا لتوفير الطاقات والمواد للحفاظ على نمو النباتات وتطورها تحت ضغط الملح. تم تقديم نموذج مقترح للفئات الرئيسية للجينات التي تتأثر سلبيًا وإيجابيًا بضغط الملح في جذور البرمودا (الشكل 8). بشكل عام ، الجينات التي تنتمي إلى مسارات الإشارة ، المشاركة في إدراك الإشارة ونقلها ، مثل مستقبل الإشارات كيناز والهرمونات ومسارات الإشارة ، تستجيب فورًا بعد التعرض لكلوريد الصوديوم. تعمل عوامل النسخ التي تستجيب في وقت مبكر بشكل إيجابي أو سلبي على تنظيم جينات استجابة المصب. في هذه الفئات الجينية المستجيبة للملح ، تستجيب بعض الفئات مثل التمثيل الغذائي للدهون وتخليق البروتين في وقت أبكر بكثير بينما تستجيب الفئات الأخرى المشاركة في التخليق الحيوي للمستقلب الثانوي في نقطة زمنية لاحقة [26 ، 76].

نموذج مقترح لفئات الجينات الرئيسية التي تأثرت معنويا بالملح في جذور برموداغراس. أشارت الأسهم الحمراء إلى الفئات الجينية الرئيسية التي تأثرت سلبًا بعد إجهاد الملح ، بينما أشارت الأسهم الخضراء إلى بعض فئات الجينات ذات التنظيم الإيجابي. أشار السهم الأزرق إلى المسار الزمني لاستجابة الملح من إدراك الإشارة ونقلها إلى استجابة الملح اللاحقة


StageR: طريقة عامة على مراحل للتحكم في معدل الاكتشاف الخاطئ على مستوى الجينات في التعبير التفاضلي واستخدام النسخ التفاضلية

تتضمن دراسات تسلسل الحمض النووي الريبي ذات التصميمات المعقدة وتحليلات دقة النسخ فرضيات متعددة لكل جين ، ومع ذلك ، تفشل الطرق التقليدية في التحكم في معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) على مستوى الجينات. نقترح stageR ، نموذج اختبار من مرحلتين يستفيد من القوة المتزايدة للاختبارات المجمعة على مستوى الجينات ويسمح بالتقييم اللاحق للجينات المهمة. توفر هذه الطريقة تحكم FDR على مستوى الجينات وتعزز القوة لاختبار تأثيرات التفاعل. في التحليل على مستوى النص ، يوفر إطارًا يقوم بإجراء اختبارات قوية على مستوى الجينات مع الحفاظ على التفسير البيولوجي بدقة على مستوى النص. هذا الإجراء قابل للتطبيق عندما يمكن تجميع الفرضيات الفردية ، مما يوفر إطارًا موحدًا للتجارب المعقدة عالية الإنتاجية.

الكلمات الدالة: التعبير التفاضلي استخدام النص التفاضلي تسلسل الحمض النووي الريبي اختبار المرحلة الحكيمة.

بيان تضارب المصالح

موافقة الأخلاق والموافقة على المشاركة
الموافقة على النشر
تضارب المصالح

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.

ملاحظة الناشر

تظل Springer Nature محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

الأرقام

منحنيات الأداء لتحليل DTU ...

منحنيات الأداء لتحليل DTU بناءً على دراستين للمحاكاة. الاكتشاف الخاطئ ...

نموذج الاختبار على مراحل. ن…

نموذج الاختبار على مراحل. ن ز الفرضيات تهم الجينات ز ...

نتائج دراسة محاكاة DGE لـ ...

نتائج دراسة محاكاة DGE لتحليل limma-voom بخمس مكررات في كل ...

نمط التعبير عن PDLIM5 ...

نمط التعبير عن PDLIM5 الجين في دراسة الحالة. الكسر المستخدم ...

منحنيات أداء FDP-TPR لـ DTE ...

منحنيات أداء FDP-TPR لتحليل DTE للبيانات المحاكاة. منحنيات زرقاء تركيز…


مراجع

كونيسا ، إيه وآخرون. جينوم بيول. 17, 13 (2016).

لو ، سي دبليو ، تشين ، واي ، شي ، دبليو & أمبير سميث ، جي كي. جينوم بيول. 15، R29 (2014).

Li ، B. ، Ruotti ، V. ، Stewart ، RM ، Thomson ، J.A. & أمبير ديوي ، سي. المعلوماتية الحيوية 26, 493–500 (2010).

ترابنيل ، سي وآخرون. نات. التكنولوجيا الحيوية. 28, 511–515 (2010).

Glaus، P.، Honkela، A. & amp Rattray، M. المعلوماتية الحيوية 28, 1721–1728 (2012).

Anders، S. & amp Huber، W. جينوم بيول. 11، R106 (2010).

Leng، N. et al. المعلوماتية الحيوية 29, 1035–1043 (2013).

روبنسون ، دكتور في الطب وأمبير سميث ، G.K. المعلوماتية الحيوية 23, 2881–2887 (2007).

Love، M.I.، Huber، W. & amp Anders، S. جينوم بيول. 15, 550 (2014).

براي ، إن إل ، بيمينتيل ، إتش ، ميلستيد ، بي آند أمبير باتشر ، إل. نات. التكنولوجيا الحيوية. 34, 525–527 (2016).

Turro، E.، Astle، W.J. & amp Tavaré، S. المعلوماتية الحيوية 30, 180–188 (2014).

ترابنيل ، سي وآخرون. نات. التكنولوجيا الحيوية. 31, 46–53 (2013).

تنج ، إم وآخرون. جينوم بيول. 17, 74 (2016).

في الأسفل ، د. وآخرون. بلوس واحد 6، e17820 (2011).

لابالاينن ، تي وآخرون. طبيعة سجية 501, 506–511 (2013).

سونسون ، سي ، لوف ، إم. & أمبير روبنسون ، (دكتور في الطب) F1000 4, 1521 (2016).

Kim، D.، Langmead، B. & amp Salzberg، S.L. نات. أساليب 12, 357–360 (2015).

Liao ، Y. ، Smyth ، G.K. & أمبير شي ، دبليو. المعلوماتية الحيوية 30, 923–930 (2014).

Langmead، B.، Trapnell، C.، Pop، M. & amp Salzberg، S.L. جينوم بيول. 10، R25 (2009).

Köster، J. & amp Rahmann، S. المعلوماتية الحيوية 28, 2520–2522 (2012).


يكشف تحليل مستوى الأنظمة عن التعقيد النسبي والبروتيني في المعى المتوسط ​​Ixodes ricinus والغدد اللعابية أثناء التعلق المبكر والتغذية

على الرغم من أن مسببات الأمراض تنتقل عادةً خلال الـ 24-48 ساعة الأولى من التعلق بقراد حبة الخروع Ixodes ricinus ، إلا أنه لا يُعرف سوى القليل عن الاستجابات البيولوجية للقراد في هذه المراحل المبكرة من الارتباط. يعتبر المعى المتوسط ​​والغدد اللعابية من الأنسجة الرئيسية المشاركة في تغذية القراد بالدم وانتقال العوامل الممرضة ، لكن المعلومات الجينومية المحدودة لـ I. ricinus تؤخر تطبيق الأساليب عالية الإنتاجية لدراسة علم وظائف الأعضاء. لقد استفدنا من أحدث التطورات في مجالات الجيل التالي من تسلسل الحمض النووي الريبي والبروتيوميات الكمية الخالية من الملصقات لتقديم وصف كمي غير مسبوق لديناميكيات التعبير الجيني في المعى المتوسط ​​والغدد اللعابية لناقل المرض هذا عند التعلق بالمضيف الفقاري. . ما مجموعه 373 من 1510 بروتينًا تم تحديده كان لديهم تعبير أعلى في الغدد اللعابية ، ولكن 110 فقط لديهم مستويات عالية من النسخ في نفس النسيج. علاوة على ذلك ، كان هناك تعبير خاص بالمعي المتوسط ​​لـ 217 جينًا على مستوى الترنسكربيتوم والبروتيوم. تم الكشف عن تراكم يعتمد على الأنسجة ، ولكن ليس البروتين ، لـ 552 من 885 جينًا. علاوة على ذلك ، اكتشفنا إثراء الغدد اللعابية للقراد بالبروتينات المشاركة في النسخ الجيني والترجمة ، والتي تتفق مع الدور الإفرازي لهذا النسيج ، وتتفق هذه النتيجة أيضًا مع اكتشافنا لتمثيل T-RNA المنخفض في الغدد اللعابية عند مقارنتها بـ المعى المتوسط. المعى المتوسط ​​، بدوره ، غني بالمكونات الأيضية والبروتينات التي تدعم سلامته الميكانيكية من أجل استيعاب واستقلاب الدم المبتلع. بالإضافة إلى فهم الأحداث الفسيولوجية التي تدعم تأكل الدم عن طريق الطفيليات الخارجية المفصلية ، اكتشفنا أكثر من 1500 بروتين يقع في الواجهة بين القراد ومضيف الفقاريات ومسببات الأمراض التي تنقلها القراد. وبالتالي ، فإن عملنا يحسن بشكل كبير معرفة الجينات الكامنة وراء دورة حياة انتقال هذا النوع من القراد ، وهي خطوة أساسية لتطوير طرق بديلة للتحكم بشكل أفضل في الأمراض التي تنقلها القراد.

© 2014 من قبل الجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية ، وشركة.


نظهر القوة النوعية والكمية لتحليل النسخ أحادية الخلية لتوصيف ديناميات النسخ في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC). يمكن لتحليل الخلية الواحدة تحديد الملامح الخلوية الفريدة بشكل منهجي لاستخدامها في فرز الخلايا وتحديدها ، وإظهار إمكانية زيادة النماذج الدائمة للتمايز الخلوي ، وتوضيح سلوك الخلايا الجذعية الخارجة من تعدد القدرات. باستخدام تحليل الخلية الواحدة لتمييز H9 hESC في ظل ظروف الثقافة الثلاثة ، كشفنا عن تعبير عابر لعلامات الأديم المتوسط ​​في جميع البروتوكولات الثلاثة ، متبوعًا بتعبير مستقر بشكل متزايد عن الأديم الباطن الجنيني وعلامات الأديم الباطن خارج الجنين. تكشف ملفات تعريف الخلية المفردة الخاصة بنا عن مجموعات مختلطة من أنواع الخلايا ، مع عدم التجانس النسخي والزمني الذي يميز التمايز في ظل جميع الظروف. ومن المثير للاهتمام ، أننا نلاحظ أيضًا تعبيرًا مشتركًا واسعًا وطويلًا للعلامات التي تنظم كل من تمايز السلالة وتعدد القدرات في جميع ظروف الثقافة ، ونجد أن نسخ علامات تعدد القدرات تظل قابلة للاكتشاف في غالبية الخلايا لعدة أيام. أخيرًا ، نوضح أن الخلايا المشتقة من مستعمرات hESC غير المتمايزة تعرض ملفات تعريف جينية متسقة تتميز بثلاث مجموعات من النصوص: رسائل موحدة وغائبة ومكتشفة بشكل متقطع ، وأن هناك ارتباطًا مذهلاً بين عضوية الجينات في هذه المجموعات وحالة كروماتين hESC الخاصة بهم. ، مع سيطرة المروجين ثنائي التكافؤ على النصوص المتفرقة.

  • التعبير الجيني
  • النسخ الجيني
  • الخلايا الجذعية الجنينية
  • الأديم الباطن
  • الخلايا الجذعية
  • عدم التجانس
  • أكتيفينز
  • فصل الخلايا
  • الكروماتينية
  • الجنين
  • التنميط التعبير الجيني
  • الجينات
  • المسرطنة


شاهد الفيديو: الأنسجة الطلائية. الفصل الأول المحاظرة الثالثة. مدرس علاء حسين الميالي (شهر نوفمبر 2021).