معلومة

هل يحتوي الرنا المرسال لبروتين السنبلة covid19 على أي إشارات توطين نووي


هل يحتوي تسلسل الأحماض الأمينية لبروتين covid19 ، كما هو مستخدم في لقاحات covid19 ، على إشارة توطين نووية. لأنه إذا فعلوا ذلك ، ألا توجد فرصة أن يجد الحمض النووي الريبي طريقه إلى نواة الخلية؟

في حالة لقاح AZ و J&J ، اللذان يستخدمان ناقل الحمض النووي للفيروس الغدي لتشفير البروتين الشائك. هل هناك فرصة لدمج الحمض النووي للقاح في الجينوم ، كما هو موضح هنا https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2570152/؟

هناك مناقشة أخرى لهذه المشكلة المحتملة هنا https://cassandravoices.com/science-environment/science/healthy-people-do-not-require-genetic-vaccination/


هل يحتوي الرنا المرسال لبروتين السنبلة covid19 على أي إشارات توطين نووي؟

أعتبر أنك تتحدث عن فيروس كورونا SARS-CoV-2 ، وتسأل عما إذا كان جينوم الحمض النووي الريبي الخاص به يحتوي على أي إشارات توطين نووي تعمل بعد الترجمة كإشارات لاستيراد البروتينات السنبلة على وجه التحديد إلى النواة. لا يمكنني العثور على أي تقارير تفيد بأن أيًا من بروتينات السنبلة مستوردة من النواة ، أي لا تحتوي بروتينات السنبلة على أي إشارة توطين نووي (عاملة) بقدر ما نستطيع أن نقول.

ومع ذلك ، يتم استيراد بعض البروتينات المشفرة داخل جينوم RNA إلى النواة. هذه ليست بروتينات سبايك بالرغم من ذلك.

إذا كنت مهتمًا بمكان توطين البروتينات داخل الخلية المصابة ، أقترح المقالة التالية كمكان بداية ممتاز جدًا: دراسة نظامية وجزيئية للتوطين الخلوي لبروتينات SARS-CoV-2

بالنسبة إلى mRNA ، لا يمكنني العثور على أي دليل على أنه يتمركز في النواة. ومع ذلك ، كانت هناك تقارير تفيد بأن mRNA الخاص بفيروس كورونا يمكن أن يتحول إلى النواة ، وأن CoV-1 يحتوي على فكرة تصدير نووية ، وأن الحمض النووي الريبي لفيروس كورونا يمكن أن يتوضع في مجمع المسام النووي للتدخل في الاتجار بين السيتوبلازم والفضاء النواة (أي. عند المدخل إلى النواة ، ولكن ليس بالداخل!). تم عرض هذا مرة أخرى على الأقل. ومع ذلك ، فهذه ليست بروتينات سبايك ، بل بروتينات مثلها Nsp1 (بروتين غير هيكلي 1) لا يتم تصنيفها على أنها بروتينات سبايك.

كانت هناك أيضًا طباعة مسبقة مثيرة للاهتمام تدور حول إمكانية اندماج SARS-CoV-2 في الجينوم البشري إذا أردنا إضافة نسخة عكسية (RNA -> إنزيم كتابة DNA) إلى المعادلة. من فضلك اقرأها بحذر ، لا أعرف أن الورقة تمت مراجعتها من قبل الأقران وللأسف لا يمكنني التعليق الآن على صحة البحث. إنه أيضًا ملف في المختبر التجربة التي أجريت في ظل ظروف غير موجودة لدى البشر ، لذا فإن الاستنتاجات لا تنطبق على المناقشات حول جائحة COVID-19 ؛ إنه مجرد إثبات لمفهوم قدرة الفيروس على التكامل ، بل هو دليل على حدوث ذلك في الجسم الحي.

هنا يأتي السؤال المتشابه:

هل سنجد في يوم من الأيام تسلسل ترميز البروتين المرتفع مدمجًا في جينومنا؟

ومع ذلك ، لا يمكن للبروتين الموجود داخل النواة أن يتكامل مع جينوم الحمض النووي. مع RNA ، قد تحتاج أيضًا إلى نسخة عكسية لدمجها في الحمض النووي ، وهو ما لا يمتلكه البشر. لذلك فإن احتمالات العثور على تسلسل ترميز البروتين في الجينوم ، خاصة في السلالة الجرثومية ، إذا كنت مهتمًا بالتأثيرات عبر الأجيال ، هي صفر تقريبًا وعمليًا.

تعديل:

أنت أيضًا تسأل في تعديلك عما إذا كان يمكن دمج الحمض النووي في لقاح AZ و J&J في الجينوم (أحداث التكامل). هذا مصدر قلق معروف لأنه يؤدي إلى التسرطن. أنت تسأل على وجه التحديد عن ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدة. أدناه أقتبس مقتطفًا من Ura et al. (2014) التطورات في اللقاحات الفيروسية القائمة على النواقل من جزء 3.3 ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدة:

بشكل عام ، يتم إنشاء ناقلات AAV المؤتلفة عن طريق حذف مناطق تشفير Rep و Cap بين لوائح الاتصالات الدولية. تستخدم هذه المناطق للتعبير عن الجينات الذاتية. بسبب حذف هذه المناطق ، لا يمكن أن تتكامل نواقل AAV في جينوم المضيف ، كما يستمر الحمض النووي الخاص بها في شكل عَرَضي. هذه الميزة المفضلة في نواقل AAV تعزز ملف الأمان الخاص بها ، عن طريق منع ظهور الأورام.

بعبارة أخرى ، يتم إعادة اتحاد الفيروس ويتم استبعاد قدرته على أداء تكامل الجينوم قبل أي اعتبارات تتعلق باستخدامه كناقل لتوصيل الجينات أو الجسيمات المسببة للمناعة ، مثل تلك التي قد تراها في لقاحات CoV-2.

أجريت أول تجربة إكلينيكية لناقل الفيروس الارتجاعي في عام 1990. وقد أثارت الدراسات السريرية اللاحقة مخاوف جدية بشأن السمية الجينية ، ويرجع ذلك أساسًا إلى تكامل الجينوم الفيروسي المحتمل. يمتلك ناقل AAV القدرة على التعبير عن الجينات الورمية دون دمج نفسه في جينوم المضيف ، وبالتالي تمت الموافقة عليه من قبل EMA للاستخدام السريري.

كما ترون ، كان هذا في الاعتبار الأول منذ عقدين من الزمن ، وبالطبع ليس من المحتمل أن تتجاهل الهيئات التنظيمية أو الباحثون أو الشركات المنتجة للقاحات هذه القضية.


توطين البروتينات السكرية لفيروس القرم والكونغو الحمى النزفية (CCHF) داخل الخلايا

فيروس الحمى النزفية القرم والكونغو (CCHFV) ، وهو عضو في الجنس نيروفيروس، أسرة بونيافيريدي، هو أحد مسببات الأمراض التي تنتقل عن طريق القراد ويسبب مرضًا شديدًا لدى البشر. لفهم دورة حياة CCHFV بشكل أفضل واستكشاف استراتيجيات التدخل المحتملة ، درسنا التخليق الحيوي والاستهداف داخل الخلايا للبروتينات السكرية ، والتي يتم ترميزها بواسطة قطاع جينوم M.

نتائج

بعد تحديد تسلسل الجينوم الكامل للسلالة المرجعية CCHFV IbAr10200 ، أنشأنا بلازميدات تعبير للتعبير الفردي عن البروتينات السكرية Gن وجج، باستخدام محفزات CMV والدجاجة التي تحركها الأكتين. تمت مقارنة التوطين الخلوي للبروتينات السكرية CCHFV المعبر عنها بشكل متجانس مع البروتينات السكرية الأصلية المعبر عنها أثناء الإصابة بالفيروس باستخدام مقايسات التألق المناعي غير المباشر ، والتجزئة الفرعية / فحوصات اللطخة الغربية والفحص المجهري متحد البؤر. لتوضيح إشارات الاستهداف / الاحتفاظ المحتملة داخل الخلايا للبروتينات السكرية ، تم تحليل بروتينات الانصهار GFP التي تحتوي على أجزاء مختلفة من البروتين السكري CCHFV لاستهدافها داخل الخلايا. بروتين سكري N- طرفي Gن مترجمة إلى مجمع جولجي ، وهي عملية تتوسط فيها إشارة (إشارات) الاحتفاظ / الاستهداف في المجال السيتوبلازمي والمجال الخارجي لهذا البروتين. في المقابل ، فإن بروتين سكري C- طرفي Gج بقيت في الشبكة الإندوبلازمية ولكن يمكن إنقاذها في مجمع جولجي بالتعبير المشترك عن Gن.

استنتاج

تتوافق البيانات مع الاستهداف داخل الخلايا لمعظم البروتينات السكرية لفيروس بونيا وتدعم النموذج العام لتجميع وتبرعم جسيمات فيروس بونيا في حجرة جولجي.


لقاح SARS-CoV-2 للهندسة العكسية

في هذه المقالة ، سنلقي نظرة فاحصة على تقنية mRNA المستخدمة في لقاح SARS-CoV-2 من موديرنا. سنقوم بفك تشفير التسلسل الذي تم الكشف عنه بواسطة براءة اختراع Moderna ومراجعته شيئًا فشيئًا. سوف نتعلم أساسيات شفرتنا الجينية ولماذا يكون لقاح mRNA فعالًا وآمنًا للاستخدام البشري.

انتظر - قلت إننا نذهب لفك تشفير تسلسل - لماذا ذلك؟ بشكل عام ، اللقاح عبارة عن سائل يتم حقنه في ذراعك. حسنًا ، هذا سؤال جيد للبدء به. لكن للإجابة عليه ، نحتاج إلى الحصول على القليل من أساسيات الحمض النووي الريبي.

DNA و RNA: الأساسيات

يشبه الحمض النووي إلى حد كبير الشفرة الرقمية. في أجهزة الكمبيوتر ، نقوم بتخزين المعلومات في 0 و 1 (قليلاً) - أو وجود أو عدم وجود رسوم. هذا هو التدفق الأساسي لكيفية نقل المعلومات في الأنظمة الرقمية.

تخزن الطبيعة معلوماتها الأساسية في 4 جزيئات مختلفة: A و C و G و U / T - "النيوكليوتيدات". هذه النيوكليوتيدات الأربعة تصنع سلاسل DNA أو RNA:

في أجهزة الكمبيوتر ، نقوم بتجميع 8 بتات (0 أو 1) على هيئة بايت واحد. البايت هو الوحدة المشتركة التي يتم فيها معالجة المعلومات. تاريخيًا ، كان البايت هو عدد البتات المستخدمة لتشفير حرف واحد من النص أو رمز في الكمبيوتر.

تقوم الطبيعة بتجميع 3 نيوكليوتيدات في "كودون" ، وهي وحدة معالجة نموذجية في الطبيعة. الكودون هو عدد النيوكليوتيدات المستخدمة للتشفير في واحد من 20 حمض أميني بروتيني مختلف. تشكل هذه الأحماض الأمينية كل واحد من البروتينات والإنزيمات الخاصة بنا.

تخزن الطبيعة هذه الرموز في حمضها النووي في نواة كل خلية. إذا كانت المعلومات مطلوبة يتم "نسخها" إلى رسول RNA (mRNA). هذه نسخة قصيرة العمر إلى حد ما من حمضنا النووي ، مخطط يمكن لآلاتنا البروتينية قراءته لتخليق الأشياء التي نصنعها: البروتينات.

كيف تعمل اللقاحات؟

لفهم رمز mRNA الخاص بشركة Moderna ، يجب علينا أولاً أن نفهم كيفية عمل اللقاحات: فاللقاحات تعلم جهاز المناعة كيف يبدو العامل الممرض حتى يتمكن من تطوير أجسام مضادة ضده.

مسببات الأمراض هي بكتيريا أو فيروسات أو فطريات أو طفيليات يمكن أن تسبب المرض داخل أجسامنا. تتكون هذه العوامل الممرضة من عدة أجزاء فرعية ، تسمى المستضدات ، تكون فريدة لكل عامل ممرض محدد. يمكن أن يتعلم جهاز المناعة لدينا التعرف على هذه الأجزاء الفرعية الصغيرة من مسببات الأمراض وإنتاج الأجسام المضادة في استجابة مناعية. ستلتصق هذه الأجسام المضادة الصغيرة بالعوامل الممرضة وتساعد خلايانا المناعية على محاربتها.

الفكرة من وراء اللقاحات هي تعليم جهاز المناعة لدينا كيف يبدو المستضد ، دون مواجهة العامل الممرض أو الإصابة بالمرض. تاريخيا ، تم القيام بذلك باستخدام مسببات الأمراض المعطلة أو الضعيفة ، أو أجزاء من الممرض (المستضدات) التي تؤدي إلى استجابة مناعية. تحتوي اللقاحات الحديثة على مخطط (مثل mRNA) للمستضد ، بدلاً من المستضد نفسه. ثم "خلايانا"منقولة"مع مخطط المستضد باستخدام نظام توصيل الأدوية النانوية (LNP). بهذه الطريقة يمكن لخلايانا أن تنتج المستضد بنفسها مؤقتًا وتحفز جهاز المناعة لدينا على الاستجابة وإنتاج أجسام مضادة ضده.

يعد لقاح BNT162b2 من BioNTech ولقاح mRNA-1273 من شركة Moderna اثنين من هذه اللقاحات الجديدة "المخطط". يحتوي كلا اللقاحين على مخطط جيني متطاير - mRNA - لتشفير بروتين السارس- CoV-2 المعروف باسم "سبايك". وهذا البروتين المرتفع SARS-CoV-2 هو المستضد لتحفيز الاستجابة المناعية.

ومع ذلك ، فإن خلايانا غير متحمسة للغاية بشأن المخططات الجينية الأجنبية التي ألقيت عليها ، لذلك كان هناك الكثير من التعديل والتكنولوجيا اللازمة لجعل المخطط يعمل. لذلك دعونا نلقي نظرة فاحصة على براءة اختراع mRNA لشركة Moderna.

الكود: لقاح mRNA-1273 SARV-CoV2 من موديرنا

على عكس BioNTech ، لم تنشر Moderna الكود الدقيق للقاح mRNA الخاص بها. لكن موديرنا تحمل براءة اختراع لقاحها ، الذي يتم نشره ويحتوي على معظم المعلومات حول التكنولوجيا. ومن ثم يمكن إجراء هندسة عكسية لهيكل اللقاح بدقة جيدة.

توضح لنا نظرة فاحصة على براءة الاختراع الأمريكية 10702600 ما يلي:

يستخدمون مرنا معدلاً للغاية يشفر بروتين ارتفاع SARS-CoV-2 كامل الطول جنبًا إلى جنب مع بعض العناصر الوظيفية الأخرى ، وسوف نلقي نظرة فاحصة عليها لاحقًا. إذا رسمنا مخططًا يحتوي على جميع العناصر التي تغطيها براءة الاختراع ، فسنحصل على هذا:

هذا هو رمزنا على مستوى عال. ولكن ماذا يعني كل ذلك؟

الغطاء: يميز الحمض النووي الريبي على أنه ما هو عليه

سنبدأ بالغطاء الذي تم تصويره على شكل قبعة صغيرة. يحتوي الغطاء على التكوين التالي:

في بعض النماذج ، يكون الغطاء الطرفي 5 بوصات هو 7 م ج (5 بوصات) ppp (5 بوصات) N1mpNp.

7 مجي(5 ′) ppp (5 ′)ن1 ميجابكسلنيترجم p إلى رمز النوكليوتيدات التالي: GNN ، في حين يتم تغيير G (7 ميثيل) ، يتم تغيير N (1 ميثيل) و N مجرد أي نيوكليوتيد محتمل.

هذا التسلسل القياسي ثلاثي النوكليوتيدات موجود فعليًا في جميع حقيقيات النوى (مثل الحيوانات والنباتات والفطريات) ومعظم الفيروسات وهو تعديل محفوظ تطوريًا لـ mRNA. يحتوي غطاء mRNA على وظائف متعددة: فهو ضروري لبدء الترجمة - وبالتالي فإن بداية تخليق البروتين من المخطط. علاوة على ذلك ، فإنه يجعل mRNA يبدو شرعيًا لخلايانا ويمنعها من التدهور. إنه يشير إلى أن mRNA قادم من نواة الخلية ، ومع ذلك ، هذا ليس هو الحال بالنسبة للقاح لدينا.

يمكن مقارنة الغطاء بالعلم الموجود على السفينة: تحديد مصدره وما هو. مثلما يستخدم القراصنة أعلامًا أخرى ، تستخدم الفيروسات علمنا الطبيعي للخداع والتخفي.

"المنطقة الخمسة الأولية غير المترجمة" (5’-UTR)

منطقة 5’-UTR هي مجرد تسلسل قياسي آخر موجود في كل mRNA. يشير الرقم 5 إلى اتجاه قراءة التسلسل. تمامًا كما نقرأ من اليسار إلى اليمين ، تتم قراءة mRNA من 5 "إلى 3".

في بعض النماذج ، يشفر قالب النسخ في المختبر منطقة 5 'غير مترجمة (UTR) ، ويحتوي على إطار قراءة مفتوح ، ويشفر 3' UTR وذيل polyA.

تعني المنطقة غير المترجمة أن هذا الجزء من الكود لا يترجم في أي جزء من البروتين ، ولكن سيتم تركه بدون ترجمة. ومع ذلك ، فإن وظيفتها الرئيسية هي توفير تسلسل يمكن لمصنع البروتين لدينا (الريبوسوم) أن يمسك به ويثبته: موقع الربط (الريبوسوم). علاوة على ذلك ، يحتوي على تسلسل البدء لبدء تخليق البروتين: تسلسل كوزاك.

إشارة الببتيد

علينا أن نمر بطبقة أخيرة من التسلسل المعلوماتي قبل أن نواصل مع المستضد نفسه.

بمجرد أن ينتج الريبوسوم البروتين ، يظل البروتين بحاجة للذهاب إلى مكان ما. وهذه هي وظيفة إشارة الببتيد. يتم توصيل ببتيد الإشارة بالبروتين ويحتوي على معلومات حول المعالجة الإضافية (مثل القطع والطي وخروج الخلايا) في قسم ما بعد إنتاج الخلايا - الشبكة الإندوبلازمية.

في حالة الفيروس ، يرسل "ببتيد إشارة البروتين السكري S" البروتين على الفور في الشبكة الإندوبلازمية لمزيد من المعالجة وبعد ذلك إلى غشاء الخلية لتجميع الفيروس.

يستخدم لقاح BioNTech إشارة ببتيد الفيروس الطبيعي للبروتين. على العكس من ذلك ، يستخدم لقاح موديرنا إشارة ببتيد مختلفة ولكنها تعرض نفس الوظائف. يستخدم واحدًا مما يلي:

ببتيد إشارة HuIgGk IgE ، ببتيد إشارة epsilon-1 ثقيل السلسلة ، تسلسل إشارة التهاب الدماغ الياباني PRM ، تسلسل إشارة بروتين VSVg أو تسلسل إشارة التهاب الدماغ الياباني JEV.

هذه الببتيدات الإشارة إما مشتقة من خلايانا (IgE & amp IgG) أو من فيروسات مختلفة. تكون ببتيدات الإشارة المستخدمة أقصر وتعرض تجميعًا عالي الكفاءة وإفرازًا للجسيمات الفيروسية المنتجة. أثناء هذه العملية ، يتم شق الببتيد الإشارة من البروتين بواسطة الإنزيمات.

بروتين سبايك الفعلي (المعدل)

حتى هذه النقطة ، واجهنا للتو تسلسلات مفيدة لتحديد البروتين وإنتاجه ومعالجته وإفرازه. الآن دعنا ننتقل إلى المستضد الفعلي: بروتين السارس- CoV-2 سبايك. يجلس البروتين السنبلة في الغشاء الدهني (بشكل أساسي قطرة دهنية) للفيروس ويرتبط بمستقبل الخلية المضيفة للحث على اندماج الأغشية.

لذلك نشرت موديرنا هنا التسلسل الدقيق لبروتين السارس- CoV2 سبايك. (يمكن التحقق منه في قاعدة بيانات UniProt باستخدام المعرف P59594)

لكن التسلسل المصور الذي تراه ليس تسلسل الرنا المرسال (تذكر: A و C و G و U) ، ولكن التسلسل الناتج من الأحماض الأمينية.

لذلك ، إذا كان mRNA هو مخططنا ، فإن هذا التسلسل هو المنتج النهائي وليس الكود الأساسي بعد الآن. السبب وراء اختيار Moderna نشر تسلسل الأحماض الأمينية بدلاً من تسلسل mRNA هو أنهم لا يريدون الكشف عن جميع تفاصيل الكود الخاص بهم.

ولكن مجرد استخدام تسلسل تم نشره بالفعل ، لن يكون ابتكارًا رائعًا. لذا أجرت شركة Moderna ثلاث تغييرات على الأقل من التغييرات الفنية في تسلسلها والتي يمكن العثور عليها في براءة الاختراع:

1. التعديل: تمويه mRNA

أنشأ جسم الإنسان نظامًا قويًا لمكافحة الفيروسات. خلايانا غير سعيدة للغاية بشأن الحمض النووي الريبي الغريب وتبذل قصارى جهدها للتخلص منه قبل أن تفعل أي شيء.

هذه هي المشكلة الرئيسية في استخدام mRNA كلقاح - فهو يحتاج إلى التسلل عبر جهاز المناعة لدينا. التغلب على هذا التحدي هو أحد حيل البيع للعديد من شركات تكنولوجيا RNA.

إذن كيف تتسلل Moderna إلى mRNA الخاص بها عبر نظام مكافحة الفيروسات؟ الجواب موجود في براءة الاختراع وهو جزء ذكي بشكل استثنائي:

في بعض النماذج ، يحتوي 100٪ من اليوراسيل في إطار القراءة المفتوح على تعديل كيميائي. في بعض النماذج ، يكون التعديل الكيميائي في الموضع 5 من اليوراسيل. في بعض النماذج ، يكون التعديل الكيميائي عبارة عن N1- ميثيل سودوريدين.

تم استبدال كل Uracil ("U") بـ 1-methyl-3’-pseudouridine. يتم تعديله كيميائيًا بشكل طفيف لتقليل قابليته للتحلل بواسطة إنزيماتنا. لا يمكن مهاجمتها عن طريق الإنزيمات المهينة (نوكليازات) لأن التغيير جعلها زلقة بالنسبة لهم. ومع ذلك ، فإن آلية البروتين لدينا (الريبوسوم) ليست صعبة الإرضاء عندما يتعلق الأمر بتخليق البروتين ولا تزال قادرة على استخدامها:

يعد استخدام 1-methyl-3’-pseudouridine حاليًا أكثر البدائل الواعدة للنيوكليوتيدات التي تتفوق بشكل كبير على جميع النيوكليوتيدات المعدلة الأخرى التي تمت دراستها.

2. التعديل: يحافظ على البروتينات التركيب الطبيعي

يعد التعديل التالي أيضًا ذكيًا بشكل خاص. في براءة الاختراع ، وجدنا ادعاءات بأن تسلسل الأحماض الأمينية المستخدمة يمكن أن يختلف بنسبة تصل إلى 20٪ عن التسلسل الطبيعي.

في بعض التجسيدات ، يكون تسلسل الحمض الأميني لبولي ببتيد مستضد SARS-CoV ، أو يكون جزءًا ، أو متماثلًا أو متغيرًا يحتوي على 80٪ على الأقل (على سبيل المثال 85٪ ، 90٪ ، 95٪ ، 98٪ ، 99٪) الهوية إلى ، تسلسل الأحماض الأمينية المحددة بواسطة أي واحد من معرفات التسلسل رقم 29 أو 32 أو 34.

لسوء الحظ ، لم يتم الكشف عن مدى اختلافها من خلال براءة الاختراع. لسبب واحد ، لأنهم لا يريدون الكشف عن تفاصيل التكنولوجيا الخاصة بهم وكذلك لتوسيع نطاق براءة الاختراع.

ولكن من المحتمل أنهم استخدموا أحدث التغييرات في تسلسل البروتين نفسه أو المشابه لتلك المستخدمة من قبل BioNTech. إذا ألقينا نظرة على تسلسلها ، وجدنا أن اثنين من الأحماض الأمينية - ليسين وحمض فالين - تم استبدالهما باثنين من البرولين.

اتضح أن هذين التغيرين لا مفر منهما للحفاظ على كفاءة اللقاح. لما ذلك؟ إذا نظرنا إلى صورة المجهر الإلكتروني ، نرى أن بروتين سبايك عادة ما يكون مدمجًا في غلاف الفيروس مع بعض البروتينات الأخرى.

في حالة اللقاح ، كل هذه الأجزاء المهمة من الفيروس الطبيعي مفقودة. يؤدي هذا إلى تشكيل أو شكل مختلف لبروتين السنبلة في خلايانا. هذا الشكل المتغير يؤدي إلى خسارة كبيرة في كفاءة اللقاح. سيطور جسمنا استجابة مناعية ضد بروتين خاطئ الشكل ، وبالتالي لن يكون قادرًا على تحديد البروتين الفيروسي عند مواجهته.

لمنع ذلك ، قامت شركة موديرنا بتغيير نوعين من الأحماض الأمينية للحفاظ على التركيب الطبيعي للبروتين.

3. تحسين تخليق البروتين

يُطلق على التغيير الأخير من تسلسل النوكليوتيدات الأصلي الذي تم إجراؤه بواسطة Moderna اسم "Codon Optimization". لقد قاموا بتحسين التسلسل لتحقيق معدل إنتاج أعلى بكثير من بروتين سبايك. تذكر أن الهدف من اللقاح هو جعل الخلية تنتج كميات كبيرة من بروتين السارس- CoV-2 ، لتحفيز استجابة مناعية عالية مع الحد الأدنى من الرنا المرسال المطلوب.

لذلك دعونا نعود سريعًا إلى الأساسيات: تقوم الطبيعة بتجميع 3 نيوكليوتيدات في كودون واحد لترجمته إلى واحد من 20 حمضًا أمينيًا بروتينيًا مختلفًا. لكن انتظر ، مع 4 نيوكليوتيدات محتملة (A ، C ، G و U / T) وطولها 3 ، لدينا 4³ = 64 تركيبة ممكنة ، ولكن فقط 20 من الأحماض الأمينية للتشفير. هذا يعني أنه يمكن ترميز العديد من الكودونات لنفس الحمض الأميني. غالبًا ما يوصف هذا على أنه الشفرة الوراثية لتكون متدهورة أو زائدة عن الحاجة ، لأن حمض أميني واحد يمكن ترميزه بأكثر من كودون واحد.

لهذا السبب ، من الممكن تغيير الكودون (ثلاثي) ولكن لا يزال يتم ترميزه لنفس الحمض الأميني.

لكن لماذا يغير شخص ما الكود ، إذا كانت النتيجة ، البروتين المترجم ، ستظل كما هي؟

اتضح أن التغييرات في أحرف RNA يمكن أن تجعل آليتنا (الإنزيمات) تترجم الشفرة بشكل أسرع وأكثر دقة. أحد أسباب ذلك هو أن أجهزتنا تستخدم مجموعة من "كتل النقل" (تجمع tRNA) ، التي تنقل الحمض الأميني الصحيح بناءً على الكودون المطابق. ومع ذلك ، فإن بعض كتل النقل هذه أكثر وفرة وأكثر استخدامًا ، وبالتالي تسريع الترجمة.

ولكن هناك العديد من الأسباب الأخرى ، على سبيل المثال يتم تحويل RNA بكميات أعلى من "G" و "C" بشكل أكثر كفاءة إلى بروتينات.

ولكن لماذا لا تستخدم الطبيعة دائمًا الكود الأكثر كفاءة ودقة؟

هناك العديد من الأسباب التي تجعل الطبيعة تستخدم نمط تسلسل غير فعال. إحدى الطرق التي تنظم بها خلايانا عدد البروتينات التي يتم تصنيعها هي ببساطة عن طريق تغيير سرعة الإنتاج. سبب آخر هو أن تخليق البروتين يتناسب مع شبكة معقدة من العمليات الأخرى ، بعضها أبطأ أو يحتاج إلى مزيد من الوقت (مثل طي البروتين). نظرًا لأن العديد من العمليات متسلسلة ، فقد يكون من المفيد إبطاء الأمور حتى لا تهدر الموارد.

ومع ذلك ، ليس هذا هو الحال بالنسبة للقاح Moderna. يحتاج اللقاح إلى إظهار كفاءة عالية لإنتاج مستضد كافٍ لتحفيز استجابة مناعية. قامت Moderna بتحسين الكودون باستخدام الخوارزميات والخدمات من GeneArt (تقنيات الحياة) و DNA2.0 (مينلو بارك كاليفورنيا).

"المنطقة غير المترجمة المكونة من ثلاثة أجزاء" (3’-UTR)

مثلما احتاجت آلية الريبوسوم الخاصة بنا إلى نقطة انطلاق للقيادة إلى التسلسل (5’-UTR) - نجد تسلسلًا مشابهًا في نهاية RNA - المنطقة 3’-غير المترجمة. تمامًا مثل 5’-UTR ، لا تتم ترجمة هذه المنطقة إلى أي جزء من البروتين ولكنها تحتوي على العديد من العناصر التي تلعب دورًا مهمًا في التعبير الجيني عن طريق "التأثير على توطين واستقرار وتصدير وكفاءة ترجمة mRNA.يمكن قول العديد من الكلمات حول مجموعة متنوعة من الآليات الخاصة بكيفية عمل 3’-UTR ، ولكن ربما تكون أكثرها شيوعًا هي تسلسل يمكن استهدافه بواسطة RNA صغير متداخل (siRNA). تحتوي جزيئات siRNA الصغيرة هذه على تسلسل مكمل وبالتالي يمكنها أن تتداخل مع mRNA وتمنعه ​​- نسمي هذا "إسكات".

ومع ذلك ، فإن بعض تسلسلات 3’-UTR ناجحة جدًا في تعزيز تعبير البروتين وزيادة استقرار الحمض النووي الريبي. هذه التسلسلات هي إضافة لطيفة لأي علاج من أنواع الحمض النووي الريبي ، وكما هو موصوف في براءة الاختراع ، فمن المحتمل أن موديرنا اختارت بعضها.

نهايته: AAAAAAAA

نهاية كل مرنا بشري هي مادة عديد الأدينيلات. هذا يعني أن التسلسل ينتهي عند العديد من AAAAAAAs أو أنه يحتوي على ذيل بولي (A). يعتبر ذيل بولي (A) مهمًا للتصدير النووي والترجمة واستقرار mRNA. إنها علامة أخرى على الرنا المرسال تحددها كما هي وتساعدها على الخروج من نواة الخلية. ولكن ربما تكون أهم وظيفة له هي إعطاء RNA تاريخ انتهاء الصلاحية ، في حين أنه كلما كان الذيل أقصر كلما زادت احتمالية انتهاء صلاحيته. يتم تقصير ذيل بولي (A) بمرور الوقت ، وعندما يكون قصيرًا بدرجة كافية ، تنتهي صلاحية mRNA ويتحلل إنزيميًا.

من خلال هذا ، نعرف كيف تم تصميم لقاح Moderna mRNA لعرض إنتاج فعال من بروتين سبايك SARS-CoV-2. وبالنسبة لمعظم الأجزاء ، نفهم سبب استخدامها. إذا أضفنا وظيفة كل عنصر من عناصر mRNA إلى مخططنا الأول من mRNA ، فسيبدو كما يلي:

يعرض لقاح mRNA المعرفة المذهلة التي جمعها الباحثون على مدار السنوات الماضية ومنتجًا يعتبر آمنًا وفعالًا للاستخدام البشري.

لكن انتظر ، أحد المخاوف التي أثيرت بشكل شائع لم تتم معالجته حتى الآن: هل يمكن للقاح الرنا المرسال أن يتدخل أو يغير معلوماتنا الجينية ، حمضنا النووي؟ هذه حجة بعيدة المنال وهناك العديد من الأسباب التي تجعلها غير قادرة على:

حتى لو كان الحمض النووي الريبي والحمض النووي متشابهين كيميائيًا ، فإن الحمض النووي الريبي مختلف جدًا بحيث لا يمكن دمجه في مجموعتنا الجينية: وحيد الشريطة مقابل مزدوج الشريطة ، واليوراسيل مقابل الثايمين للإشارة إلى بعض الاختلافات. في أكثر من 60 عامًا من أبحاث الحمض النووي الريبي ، لم يتم ملاحظة أن الرنا المرسال يمكن أن يندمج في حمضنا النووي.

لا يمكن نقل الحمض النووي الريبي الإضافي إلى الحمض النووي بسهولة وهناك استثناءات قليلة لتلك العقيدة المركزية للبيولوجيا الجزيئية. أحدهما هو فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) الذي يمكنه عكس تشفير الحمض النووي الريبي الخاص به إلى الحمض النووي. لكنها لا تفعل ذلك بشكل عشوائي لكل مرنا. يجب أن تكون العناصر المحددة والجزيئات المساعدة (البادئات) موجودة حتى يعمل هذا.

ولكن حتى لو تمكن الحمض النووي الريبي من القيام بذلك ، فلن يكون ذا صلة بنا على الإطلاق. معلوماتنا الجينية آمنة تمامًا في نواتنا. كل ما يفعله الفيروس وكل ما يفعله اللقاح يحدث خارج النواة. كما نتذكر ، تم تمييز mRNA عدة مرات للنقل خارج النواة ولا يحتوي على أي عناصر يمكن أن توفر مدخله في النواة المغلقة بإحكام.

ولكن حتى لو تمكن الحمض النووي الريبي من فعل كل ذلك والتغلب أيضًا على الحاجز الأخير لخلايانا والدخول إلى نواتنا الثمينة ، فلن يكون ذلك مناسبًا لنا. في النهاية ، لا يحتوي إلا على عناصر RNA طبيعية مع عدد قليل من عناصر الحمض النووي الريبي الفيروسي - وهو نفس الشيء الذي تواجهه خلايانا مع كل نزلة برد أو تحتوي بشكل طبيعي. إذا كنت تخشى دخول الحمض النووي الريبي إلى خلاياك ، فقد فات الأوان لذلك: في هذه اللحظة بالذات ، تدخل مئات الآلاف من الحمض النووي الريبي الفيروسي إلى خلايانا وتخرج منها - ولا تضر الحمض النووي على الإطلاق. لقاح mRNA ليس استثناءً من ذلك.

أولئك الذين يزعمون أن التطعيم يمكن أن يغير جيناتنا يجب عليهم أيضًا الادعاء بأن الإصابة بفيروس SARS-CoV-2 نفسه أو أي فيروس آخر يمكن أن يغير جيناتنا. نحن لا نتحول إلى طفرات وراثية إذا أصابنا فقط بنزلة برد.

إذا كنت تريد أن تسمع المزيد عن هذه التكنولوجيا المدهشة ، فقط أخبرني. سأقوم بكتابة الجزء الثاني عن لقاح mRNA الخاص بشركة Moderna والذي يغطي جميع المواد المساعدة والسواغات الإضافية لإدخال RNA في خلايانا.

أخيرًا ، أود أن أشيد بالمؤلف بيرت هوبرت ، الذي كتب مؤخرًا مقالًا مشابهًا حول لقاح BioNTech mRNA ، والذي قدم لي أساسًا لهذه المقالة. أنا أوصي قراءته.


نتائج

يشكل LINE-1 فئة رئيسية من m 6 A-methylated RNAs في الخلايا البشرية

لقد طورنا طريقة جديدة لفحص m 6 A منظر طبيعي على RNAs الوليدة ، والتي نشير إليها على أنها م 6 أ أناnscribe نصعود تينص تسلسلتسريع (MINT-Seq) (معلومات تكميلية ، مواد وطرق الشكل S1a). استندت هذه الطريقة إلى وضع العلامات الأيضية 4-thiouridine (4SU) للـ RNAs الوليدة ، متبوعًا بالتنقية الترادفية باستخدام حبات الستربتافيدين والجسم المضاد m 6 A ، وقمنا بإضافة عناصر تحكم مزدوجة الارتفاع للتحقق من كفاءة التنقية والحساسية. تم استخدام جزء صغير من الحمض النووي الريبي الناشئ الذي يحمل علامة 4SU المنقى من البيوتين لتسلسل النسخ العابر (TT-Seq) ، والذي كان بمثابة مدخلات لـ MINT-Seq (معلومات تكميلية ، الشكل S1a-c). كشف تحليل اقتران MINT-Seq و TT-Seq في خلايا K562 عن 59،706 م 6 قمم على RNAs الوليدة التي تم نسخها في أقل من 5 دقائق ، مقارنة بـ 19306 قمم موجودة على RNAs ذات الحالة المستقرة (على سبيل المثال ، بواسطة MeRIP-Seq التقليدي مع المجموع. RNA-seq كمدخلات) (معلومات تكميلية ، الشكل S1d والجدول S1). تم العثور على عدد ملحوظ من قمم m 6 A فقط في RNAs الوليدة (& gt 40k ، معلومات تكميلية ، الشكل S1d ، e) ، وهي مواقع غير مميزة إلى حد كبير m 6 A لا يمكن اكتشافها بقوة بواسطة دراسات MeRIP العادية (معلومات تكميلية ، الشكل. . S1h). تم العثور على نمط مماثل في خلايا هيلا (معلومات تكميلية ، الشكل S1f). تم اكتشاف قمم RNA m 6 A الناشئة جزئيًا بسبب إثرائنا القوي لـ RNAs الوليدة ، كما يتضح من نسبة intron / exon عالية للغاية في TT-Seq (معلومات تكميلية ، الشكل S1g). اللافت للنظر ، مرتفع جدًا (

30٪) النسبة المئوية للقمم الوليدة RNA m 6 A تتداخل مع الينقولات العكسية المشروحة بما في ذلك الينقولات غير LTR (على سبيل المثال ، LINEs) و retrotransposons LTR (على سبيل المثال ، ERVs) ، وهي أعلى بكثير من المتوقع (الشكل 1 أ ، اليسار مقابل اليمين). من بين هؤلاء ، أظهرت LINEs أعلى عدد من قمم MINT-Seq (22.4 ٪ من جميع القمم) ، مما يمثل إثراءًا قويًا لقمم m 6 A (

4 أضعاف أعلى مما كان متوقعًا ، معلومات تكميلية ، الشكل S2a). باستمرار ، تحتوي L1 RNAs على أعلى مستويات m 6 A بين RTEs عن طريق حساب نسب FPKM بين MINT-Seq و TT-Seq (معلومات تكميلية ، الشكل S2b). أظهرت الينقولات العكسية LTR مثل ERVs مستويات معتدلة من m 6 A لكن SINEs لم تظهر أي ذروة تخصيب m 6 A ومستوى مثيلة منخفض بشكل عام (معلومات تكميلية ، الشكل S2a ، ب) ، كما يتضح من Alu (نوع رئيسي من SINEs الخاصة بالرئيسيات ) ، بما يتفق مع مكوناتها المنخفضة A / T بشكل عام. 13 هذا الإثراء القوي لـ m 6 A على L1s (الشكل 1 أ ، المعلومات التكميلية ، الشكل S2a ، ب) يشير إلى دوره الذي لم يُقدَّر بعد في التحكم في التعبير L1 أو التعبئة.

أ مخططات دائرية توضح التوزيع الجيني لقمم m 6 A على عناصر non-LTR (LINE ، SINE) و LTR retrotransposon استنادًا إلى K562 MINT-Seq. اليسار ، التوزيع الجينومي لقمم MINT-Seq m 6 A. اليمين ، التوزيع المتوقع لقمم MINT-Seq m 6 A. تم حساب هذه النسب المئوية المتوقعة بناءً على فرضية صفرية مفادها أن أي مناطق مكتوبة في الجينوم لها فرص متساوية لاحتواء قمم m 6 A. وبالتالي ، من قراءة TT-Seq المعينة لعناصر LINE و SINE و LTR في الجينوم المرجعي (hg19) ، يمكننا استنتاج القمم المتوقعة من هذه المناطق. ب لقطة من مسارات مستعرض الجينوم لبيانات TT-Seq و MINT-Seq و H3K36me3 ChIP-Seq في خلايا K562 ، جنبًا إلى جنب مع تعليقات LINE والجينات في الجينوم hg19 (أسفل المسارات). الجين RefSeq RNA LINC00534 يظهر أنه يحتوي على العديد من قمم intronic m 6 A القوية المتداخلة تمامًا L1s (الأسهم). (+) و (-) في مسارات البيانات تشير إلى خيوط Watson و Crick. ج مخطط شريطي يُظهر عددًا من L1s intronic التي تكون بمعنى - (أزرق) أو مضاد - (أخضر) موجه إلى الجينات المضيفة. تشير "المتوقع" إلى الأرقام المحسوبة باستخدام جميع intronic L1s ، بينما "تمت ملاحظتها" باستخدام intronic L1s المتداخلة m 6 A قمم MINT-Seq. ص- تم حساب القيمة من خلال اختبار فيشر الدقيق. د مخطط كثافة يوضح النسبة المئوية لتوزيع L1 استنادًا إلى طول كل hg19 L1s المشروحة (رمادي) أو m 6 بعلامة L1s (أحمر). ه قطعة أرض تُظهر مستويات m 6 A النسبية (MINT-Seq / TT-Seq) عبر جميع MILs (intronic L1s التي تتداخل مع قمم MINT-Seq). تم تحديد مجموعة فرعية من MILs التي تؤوي مستويات عالية بشكل استثنائي من m 6 A على أنها Super-MILs (ن = 393) ، يتحقق باستخدام منحدر منحنى التوزيع (يشير الخط الأزرق والنقطة الخضراء إلى الحدود بين Super-MILs و MILs النموذجية). Fح تعرض Boxplots ميزات Super-MILs و MILs النموذجية و Control L1s (نسخ L1s مكتوبة بدون قمم m 6 A) ، من حيث تباعد التسلسل مقارنة بإجماع L1 (F)، الطول (ز) وكثافة m 6 A عزر (RRACH) (ح). ص- تم حساب القيم مع مان ويتني يو الاختبارات. أنا, ي Boxplots من نفس المجموعات الثلاث من L1s كما في اللوحات السابقة ، تظهر مستويات نصها (أنا) ، واستقرار RNA النسبي (محسوبًا بأخذ النسبة بين RNA-Seq و TT-Seq FPKM ، لوحة ي). ص- تم حساب القيم مع مان ويتني يو الاختبارات.

إشارات m 6 A قوية بشكل خاص على L1s الموجودة في الجينات introns (الشكل 1 ب ، المعلومات التكميلية ، الشكل S2c). على سبيل المثال ، بالنسبة لجين LINC00534 RNA ، بينما يعرض TT-Seq نمطًا واسعًا و "مسطحًا" عبر وحدة النسخ بأكملها ، فإن إشارات MINT-Seq تثري إلى "جزر" عديدة ، والتي تتداخل تمامًا مع L1s المشروحة (الشكل 1 ب). توزع متواليات Intronic L1 إما في نفس الاتجاه أو الاتجاه العكسي مثل الجينات المضيفة (أي ، الإحساس مقابل مضاد المعنى) ، بمعدل 1: 2 تقريبًا (الشكل 1 ج). ومن المثير للاهتمام ، أن m 6 A كان متحيزًا بشدة لتمييز intronic L1s الموجه نحو الجينات المضيفة ، مما يشير إلى أن ترسب m 6 A من المحتمل أن يسترشد بتسلسلات L1 RNA بدلاً من تسلسلات L1 DNA أو حالة الكروماتين المرتبطة (الشكل 1 ج ، انظر أدناه) ومناقشة). نظرًا لأن m 6 A هي علامة على RNAs ، فقد استخدمنا m 6 بعلامة L1s للإشارة إلى نصوص RNA كلما أمكن ذلك ، استخدمنا مناطق L1 للإشارة إلى التسلسلات الجينية.

لقد قارنا طول m 6 بعلامة L1s مع جميع L1s المشروحة في الجينوم البشري ووجدنا أن m 6 A-methylated L1s أطول عمومًا وتثري L1s كامل الطول (الشكل 1 د). استنادًا إلى قمم m 6 A في MINT-Seq (FDR & lt 0.01 بواسطة MACS2) وإشارات النسخ (TT-Seq و FPKM & gt 0.1) ، حددنا 4315 م 6 أ- ميثيل أناntronic إل1s (MILs) في خلايا K562 (المعلومات التكميلية للمواد والطرق ، الجداول S2 ، S3). من بين هؤلاء ، تحتوي مجموعة فرعية من MILs على مستويات عالية بشكل استثنائي من m 6 A ، تذكرنا بالمستوى العالي بشكل استثنائي من هيستون acetylation H3K27ac في مناطق محسن محددة صاغت مفهوم المعززات الفائقة أو الممتدة 51،52 (على سبيل المثال ، الأسهم في الشكل . 1 ب). لذلك استخدمنا استراتيجية حسابية مماثلة لتصنيف MILs استنادًا إلى مستويات m 6 A ، مما سمح بتحديد مجموعة فرعية من MILs بمستويات عالية بشكل استثنائي m 6 A والتي أشرنا إليها باسم Super-MILs (الشكل 1 هـ ، المواد والطرق). مقارنةً بـ L1s المنسوخة الأخرى بدون علامة m 6 A (أي Control L1s) ، تمتلك Super-MILs و MILs تباعدًا منخفضًا في التسلسل مقارنة بتسلسل إجماع L1 ، كما أنها تتحمل طولًا أطول ، مما يشير إلى أنها أصغر سنًا من الناحية التطورية 53 (الشكل 1). . 1 و ، ز). Super-MILs هي الأقل تباعدًا (أي الأصغر) ، في حين أن طولها مماثل بشكل عام لطول MILs. أجرينا تحليلات تصميم الحمض النووي الريبي de novo لقمم m 6 A على MILs ، ووجدنا أن الشكل العلوي كان "AAAGAC" ، مشابهًا لعنصر m 6 A المعروف "RRACH" (حيث R = A / G ، و H = A / C / U) 54،55 (معلومات تكميلية ، الشكل S2d). في الواقع ، كان المستوى L1 م 6 A مرتبطًا بشكل إيجابي بكثافة عزر RRACH ، والتي كانت مرتفعة بشكل خاص في Super-MILs ، ومرتفعة بشكل معتدل في MILs النموذجية ومنخفضة في L1s المنسوخة الأخرى بدون m 6 A (الشكل 1 ح). غالبًا ما توجد في أنواع الخلايا البشرية التي درسناها

200-400 Super-MILs (الشكل 1 هـ المعلومات التكميلية ، الشكل S2f). ومن المثير للاهتمام ، أن المناظر الطبيعية لكل من MILs و Super-MILs أظهرت درجات قوية جدًا من خصوصية نوع الخلية (معلومات تكميلية ، الشكل S2e ، f) ، وهي ليست مجرد نتيجة للنسخ الخاص بنوع الخلية مع الأخذ في الاعتبار حقيقة أن غالبية هذه يتم نسخ MILs أو Super-MILs في أنواع الخلايا الأخرى (معلومات تكميلية ، الشكل S2g) ، مما يشير إلى أن مستويات ترسب m 6 A لا تعتمد فقط على تسلسل L1 RNA. بشكل عام ، تشير هذه النتائج إلى أن مجموعة من الشباب L1s تطوريًا ترسبوا بمستوى عالٍ من m 6 A في نسخهم في مرحلة مبكرة جدًا من إنتاج الحمض النووي الريبي الناشئ.

في حين لا يمكن اكتشاف العديد من MILs إلا في مرحلة RNA الوليدة ، أي فقط بواسطة MINT-Seq (الأسهم في المعلومات التكميلية ، الشكل S2c) ، غالبًا ما يمكن اكتشاف Super-MILs بسهولة في حالة RNA المستقرة methylome بواسطة MeRIP-Seq (أصفر) يسلط الضوء في المعلومات التكميلية ، الشكل S2c). من خلال تحليل إجمالي RNA-Seq ، وجدنا أن وفرة RNA لـ Super-MILs كانت أعلى بكثير من وفرة MILs و intronic L1s الأخرى (الشكل 1i). تشير هذه النتائج إلى أن مستويات m 6 A ترتبط بشكل إيجابي باستقرار L1 RNA. في الواقع ، من خلال استنتاج استقرار الحمض النووي الريبي عن طريق حساب نسبة الإشارة بين نصوص المرحلة الثابتة (RNA-Seq) والنصوص الوليدة (TT-Seq) ، وجد أن Super-MILs أكثر استقرارًا من MILs النموذجية أو L1s الأخرى (الشكل 1j) . سمحت لنا قابلية الاكتشاف العالية لمعظم Super-MILs وبعض MILs أيضًا باستخدام بيانات MeRIP-Seq المنشورة لتحليل L1 RNA m 6 A methylome (انظر أدناه).

RNA m 6 التعديل هو سمة تطورية لنصوص L1 الصغيرة

قمنا بفحص المسار التطوري لعائلات فرعية L1 مختلفة في البشر ولاحظنا وجود علاقة قوية بين مستويات m 6 A والأعمار التطورية L1 (r = −0.958 ، ص & lt 1.45e − 09 ، الشكل 2 أ) ، مع أصغر العائلات الفرعية L1 56 مثل L1HS (الملقب ، L1PA1) ، L1PA2 و L1PA3 هما الأكثر ميثيلًا (الشكل 2 أ). لقد توصلنا إلى هذا الاستنتاج إما باستخدام قراءات أحادية الخريطة للتحليلات ، أو عن طريق خوارزمية تعظيم التوقعات (EM) الخاصة بـ نص يقرأ خط الأنابيب لتضمين الخرائط غير الفريدة 2،57 (معلومات تكميلية ، الشكل S3a ، مواد وطرق). ومن المثير للاهتمام ، أن كثافات شكل "RRACH" في متواليات الإجماع للعائلات الفرعية L1 المختلفة مرتبطة أيضًا بالأعمار التطورية لـ L1s: العائلات الأصغر لديها كثافة أعلى (الشكل 2 أ ، خريطة الحرارة الجانبية اليمنى). بالنظر إلى MILs في الأنواع الأخرى ، قمنا بتحليل MeRIP-Seq من الحمض النووي الريبي النووي من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (mESCs) وحددنا 2033 فأر MILs (معلومات تكميلية ، الشكل S3b). تمشيا مع MILs البشرية ، تعد MILs الفأرية أطول أيضًا من المتوسط ​​وتحمل تسلسلات أقل تباينًا من الإجماع (معلومات تكميلية ، الشكل S3c ، د). العلاقة بين مستويات m 6 A والأعمار التطورية L1 محفوظة بشكل عام في الفئران 59 (الشكل 2 ب). العائلات الفرعية الأصغر والأكثر نشاطًا بشكل رجعي ، L1Md_T و L1Md_A و L1Md_Gf ، ميثلة بدرجة عالية ، وهي أيضًا ذات وفرة أعلى من الحمض النووي الريبي (الشكل 2 ب).معًا ، دعمت هذه النتائج أن ارتفاع RNA m 6 A هو سمة محفوظة لـ L1s الأصغر تطوريًا التي لوحظت عبر الأنواع.

أ تُظهر مؤامرة الشريط المصنفة مستويات نسبية من m 6 A (النسب بين MINT-Seq FPKM و TT-Seq FPKM) على عائلات فرعية L1 بشرية مختلفة ، وأعمارها التطورية المقدرة (النقاط المتصلة بالخط الأصفر). تُظهر خريطة الحرارة الموجودة على اليمين كثافات عزر RRACH على متواليات إجماع L1 (من Dfam ، https://dfam.org/) لكل عائلة فرعية (تشير الأرقام إلى تعداد الحافز لكل 100 نيوكليوتيد). Myr ، ملايين السنين. قيمة r (معامل الارتباط) و ص- تشير القيمة إلى ارتباط رتبة سبيرمان بين مستويات مثيلة m 6 A والأعمار المقدرة للعائلات الفرعية L1. ب تم إنشاء مخطط شريط مصنّف بنفس الطريقة كما في اللوحة أ ولكن بالنسبة للفأر L1s ، باستخدام مستويات m 6 A النسبية المحسوبة من البيانات المنشورة (RNA MeRIP-Seq FPKM / RNA-Seq FPKM ، Wen et al. 58). قيمة r و ص- تشير القيمة إلى ارتباط رتبة سبيرمان بين مستويات مثيلة m 6 A والأعمار المقدرة للعائلات الفرعية L1. ج رسم تخطيطي يوضح ميزات L1s ، بما في ذلك L1 المختصة بالانتقال الرجعي (RC-L1 ، الأخضر) و L1s الأخرى التي لم تعد قادرة على التحويل (L1s الميتة ، الأصفر) التي تتميز بالقطع (الحواف الإسفينية) والطفرات (النجوم الحمراء). في الجزء السفلي ، رسم تخطيطي لـ

يتم عرض تسلسل L1 كامل الطول بحجم 6 كيلو بايت مع ميزات معروفة. د مخطط كثافة يُظهر موضع النوكليوتيدات الأول "النسبي" لنهايات MILs '5' محاذاة تسلسل الإجماع لـ L1s. ه لقطة لمسارات مستعرض الجينوم لـ MCF7 H3K4me3 ChIP-Seq و MINT-Seq (±) و MeRIP-Seq (±) ودرجة قابلية التعيين (من ENCODE) لـ Chr22-q12.1 L1HS-Ta (في إنترون TTC28 الجين في اتجاه مضاد المعنى). يشير الضوء الأزرق إلى منطقة L1HS-Ta والأصفر TTC28 للجين TSS. F رسم تخطيطي يوضح الأسئلة التي أثيرت من خلال النتائج التي توصلنا إليها ، مع متابعة بعضها في الجزء التالي من هذه الورقة. يشير النص الأحمر إلى بعض الأمور المجهولة المهمة.

لقد استفسرنا عن ميزات الجينات المضيفة لهذه الجينات الفتية L1s تطوريًا. لا تُظهر MILs أي تفضيل واضح من حيث المواقع في جينات المضيف (على سبيل المثال ، نحو 5 ′ أو 3 نهايات المعلومات التكميلية ، الشكل S3e). حدد تحليل الإثراء الوظيفي لجينات الاستضافة في خلايا K562 "تنظيم إصلاح كسر الخيط المزدوج" (معلومات تكميلية ، الشكل S3f) باعتباره المصطلح الأكثر إثراءً. تم تحديد مصطلحات وظيفية مماثلة أيضًا لجينات استضافة MIL في HeLa و MCF7 و ESCs بالماوس (معلومات تكميلية ، الشكل S3f).

M 6 A ترسبات في كل من RC-L1s المستقل و L1s الميتة المنسوخة بشكل مشترك

في معظم الأنسجة الجسدية ، يتم إسكات L1s الحية جينيًا عبر مثيلة الحمض النووي 5-السيتوزين (5mC) و / أو مثيلة هيستون H3 (H3K9me3). 14،15،16،60،61 سألنا ما هي السمات اللاجينية في المناطق الجينومية لـ MILs. باستخدام بيانات تسلسل الجينوم الكامل المنشورة (WGBS) في K562 ، وجدنا القليل من الإثراء للحمض النووي 5mC في ترميز المناطق الجينومية لـ MILs (معلومات تكميلية ، الشكل S4a). تم الإبلاغ عن أن بعض intronic L1s يتم قمعها بواسطة مجمع HUSH ، مما يسهل ترسيب H3K9me3 وقمع النسخ. وجد تحليل 63،64 لبيانات ChIP-Seq إثراءًا خفيفًا لمكونات H3K9me3 أو HUSH (أي MORC2 و MPP8 و TASOR) في المناطق الجينومية لـ MILs (معلومات تكميلية ، الشكل S4a). فقط جزء صغير من MILs يتداخل مع قمم H3K9me3 (معلومات تكميلية ، الشكل S4b) ، وعدد أصغر يتداخل مع ربط HUSH المعقد (معلومات تكميلية ، الشكل S4c). علاوة على ذلك ، تم ترسيب H3K9me3 في كثير من الأحيان إلى intronic L1s التي تعتبر معادية للجينات المضيفة (معلومات تكميلية ، الشكل S4d) ، بينما حدد MORC2 كلا من المعنى ومضاد المعنى L1s بشكل مشابه (معلومات تكميلية ، الشكل S4e) ، مما يشير إلى عدم تفضيل الاتجاه. على النقيض من ذلك ، يفضل m 6 A بشدة أن يتم ترسيبه لاستشعار L1s (الشكل 1 ج). تم الإبلاغ عن ترسب m 6 A في مناطق الجينات عن طريق تعديل H3K36me3 المرتبط بالاستطالة. 65 من خلال فحص مسارات المستعرض ، لم نجد تداخلات قوية بين إشارات m 6 A على قمم L1s و H3K36me3 (الشكل 1 ب) ، والتي تنطبق بشكل عام على جميع MILs (المعلومات التكميلية ، الشكل S4a).

تستخدم L1s المختصة بالانتقال الرجعي (RC-L1s) المروجين المستقلين بالقرب من 5 لتوجيه نسخ

6 كيلو بايت طويلة من الحمض النووي الريبي. تم إيداع 66،67 علامة هيستون المميزة المرتبطة بالمروج H3K4me3 و H3K27ac في مروجي RC-L1. لم يحدد تحليل 67،68 لـ ChIP-Seq المنشور أي إثراء لهذه العلامات في الأطراف الخمسة لتشفير المناطق الجينومية لـ MILs ، مما يشير إلى أن معظم MIL RNAs لا يتم نسخها بشكل مستقل (معلومات تكميلية ، الشكل S4a). في الواقع ، تم اقتطاع معظم MILs وتحورها مقارنة بتسلسلات الإجماع (الشكل 2 ج ، د) ، وفقدت معززاتها أو 5’UTR (3390 من أصل 4315 فقدوا مناطقهم 0-1 كيلو بايت ، الشكل 2 د). تحليلات ATAC-Seq و GRO-CAP و ChIP-Seq الأخرى من RNA polymerase II (RNAPII) أو عوامل النسخ / المُنشّطات التي تم الإبلاغ عنها لربط مروج L1 (على سبيل المثال ، YY1 و MYC و EP300) لم يُظهر 67،69،70 أي إثراء على 5 'نهايات ترميز المناطق الجينومية لـ MILs ، والتي يمكن تمثيلها من خلال اثنين من Super-MILs (كلاهما & gt 6 kb ويقعان في introns of PSMA1 و ZRANB3 الجينات ، على التوالي) في حين أن الإشارات عالية على معززات الجينات البشرية المشروحة / TSS (معلومات تكميلية ، الشكل S5a ، b). استخدمنا بشكل تجريبي نظام تداخل CRISPR (CRISPRi) (dCas9-KRAB جنبًا إلى جنب مع التحكم السلبي أو جرنة محددة) لقمع نسخ PSMA1 المروج 71 ووجد ما يصاحب ذلك من انخفاض في كل من PSMA1 mRNA و Super-MIL المقيمين في intron (معلومات تكميلية ، الشكل S5c ، د). تشير هذه النتائج معًا إلى أن غالبية MILs لا يتم نسخها عبر مروجين مستقلين ، بدلاً من ذلك يتم نسخها بشكل مشترك مع جينات الاستضافة.

تم الإبلاغ عن أن بعض intronic L1s يتم تقطيعها بشكل خاطئ لاستضافة mRNAs. 29 لاختبار القواسم المشتركة لهذا السلوك مع MILs ، استخدمنا طريقة تجميع نسخة de novo ، سترينجتي، لتحديد النصوص من بيانات RNA-Seq ، وفحص تواتر MILs التي يتم تقطيعها في نصوص mRNA (معلومات تكميلية ، الشكل S5e). كما هو متوقع ، أظهرت معظم نصوص de novo المتداخلة في جينات GENCODE المشروحة exons متعددة (معلومات تكميلية ، الشكل S5e ، f). على النقيض من ذلك ، عندما تتداخل نسخ de novo التي تسمى نسخ RNA مع MILs ، فهي في الأساس exonic فردية ، ومعظم نصوص de novo المحتوية على MIL (346 من أصل 400) لا تحتوي على أي exons لترميز البروتين GENECODE ، مما يشير إلى أن MILs نادرًا ما يتم تقطيعها في الجين المضيف mRNAs (معلومات تكميلية ، الشكل S5e ، g). يمكن تمثيل هذه النتيجة من خلال بيانات RNA-Seq الأولية المحاذاة مع ZRANB3 منطقة Super-MIL: بينما يتم تقطيع exons الذي يحيط بـ Super-MIL معًا بشكل عام ، لا يتم تقسيم قراءات Super-MIL إلى exons (معلومات تكميلية ، الشكل S5h).

لقد درسنا أيضًا ما إذا كانت مثيلة m 6 A عالية تنطبق على RC-L1s ، والتي تنتمي في البشر إلى L1HS ، ومعظمها مجموعة فرعية L1HS-Ta (Ta: نسخ مجموعة فرعية أ). 21،73 في حين أن الطبيعة المتكررة للغاية لـ L1HS تمنع المحاذاة الكاملة عن طريق تسلسل القراءات القصيرة ، إلا أن هناك عددًا قليلاً يمكن اكتشافه استنادًا إلى المناطق الفريدة القابلة للتعيين في جسم L1 والتسلسلات النهائية المباشرة. 68 خط خلايا سرطان الثدي MCF7 يؤوي واحدًا من هذا النوع RC-L1 في الإنترون الأول من TTC28 الجين في الاتجاه المضاد للمعنى (الملقب ، Chr22-q12.1 L1HS-Ta) 68 (الشكل 2 هـ). هذا هو L1 الأكثر نشاطًا في السرطانات البشرية المسؤولة عن ما يقرب من ربع جميع حالات الإصابة بالسرطان المرتبط بالسرطان (لا سيما في سرطانات الثدي التي يسببها.

70٪ من أحداث التحويل الرجعي). كشفت 22 MINT-Seq في خلايا MCF7 أن هذا L1HS-Ta RNA عالي m 6 ميثيل (الشكل 2 هـ). في هذه الحالة ، على النقيض من معظم MILs الأخرى ، يمكن رؤية ذروة H3K4me3 القوية على مروجها لأن RC-L1s هي وحدات نسخ مستقلة (الشكل 2 هـ).

مجتمعة ، أظهرت هذه البيانات ما يلي: 1) ، تتكون فئة MILs في الغالب من L1s الميتة رجعيًا ، والتي لا ترتبط أو ترتبط بشكل ضعيف بالحالات اللاجينية / الكروماتين التقليدية (مثيلة الحمض النووي 5mC ، هيستون H3K9me3 ، H3K36me3 ، أو H3K4me3 ) 2) ، نادرًا ما يتم تقطيع Super-MILs و MILs إلى الجينات mRNAs المجاورة ، والتي تشير مع حقيقة أن RNAs الخاصة بهم أكثر استقرارًا من الإنترونات المرافقة (الشكل 1i ، المعلومات التكميلية ، الشكل S5b) إلى أنه تتم معالجتها بعد النسخ من الإنترونات (انظر المناقشة) 3) هناك ميثيل مرتفع م 6 A لميثيل L1HS-Ta واحد نشط في Chr22q12.1 (الشكل 2 هـ) ، مما يشير إلى أن RC-L1s تشترك في ميزات RNA m 6 A مماثلة مثل MILs / Super- ميلس. تطرح هذه البيانات عدة أسئلة مهمة (الشكل 2 و): ما هي قارئات m 6 A المحتملة لـ L1 RNAs الميثيل؟ كيف ستؤثر علامة m 6 A وقرائها على L1s ، أي للتعبير أو التحويل الرجعي لـ RC-L1s ، أو لـ MILs الميتة للتأثير المحتمل على جينات الاستضافة؟ ما هو تأثير هذه العمليات على التنمية البشرية أو الأمراض؟

تلتزم MILs بـ RBPs غير المتجانسة

لتحديد البروتينات التنظيمية المحتملة لـ MIL RNAs ، قمنا بتحليل مجموعة كبيرة من بيانات الربط المتقاطع والترسيب المناعي (eCLIP-Seq) المُحسَّنة التي تم إنشاؤها بواسطة اتحاد ENCODE في خلايا K562 74 (معلومات تكميلية ، الجدول S5). من خلال المقارنة غير المتحيزة لمواقع ربط eCLIP الخاصة بـ

150 RBPs مع قمم m 6 A MINT-Seq على MILs ، حددنا أكثر من عشرة RBPs التي أظهرت ارتباطًا قويًا بشكل خاص مع MILs ، بما في ذلك عامل مرفق السقالة B2 (SAFB2) ،

70 ٪ paralogue paralogue SAFB و RBM15 ، وهو بروتين محول نووي يجند m 6 A methyltransferase إلى زيست lncRNA 75 (الشكل 3 أ). باستثناء RBM15 ، لم يتم اقتراح أي من MIL-RBPs الأخرى لتكون m 6 A المنظمين / القراء ، وأدوارهم مثل RBPs سيئة التمييز ، خاصة بالنسبة لـ SAFB2 و SAFB و HLTF و UCHL5 و PPIL4 و LARP4 و BUD13 و ZNF622 ( الشكل 3 أ). يظهر الإثراء القوي لـ SAFB2 و RBM15 و SAFB على MILs من خلال تحليلات metagene لإشارات eCLIP-Seq (الشكل 3 ب) ، ويتجلى في DNAH14 موضع (الشكل 3 ج). كعنصر تحكم ، RBP آخر وفير في النواة ، hnRNPU (ويعرف أيضًا باسم SAF-A) ، لا يعرض أي ارتباط مع MILs (الشكل 3 ب). يكشف الارتباط المتقاطع مع الأشعة فوق البنفسجية الذي يستخدمه eCLIP-Seq في الغالب عن تفاعلات البروتين والحمض النووي الريبي ، 74،76 لذلك ، تشير هذه النتائج إلى أن MILs مرتبطة بمجموعة كبيرة من RBPs (والتي سنشير إليها باسم MIL-RBPs). يشير الارتباط القوي لـ m 6 A-MILs بواسطة RBPs ، ولكن ليس بواسطة أي RBPs النووية الوفيرة الأخرى مثل hnRNPU ، إلى أنها قد تكون بروتينات ربط جديدة مفترضة m 6 A-RNA (أي القراء). لم يتم تضمين بروتين قارئ واحد معروف m 6 A ، YTHDC1 ، 44 في مجموعات بيانات ENCODE eCLIP-Seq. أظهرت إعادة تحليل بيانات iCLIP-Seq المنشورة 75 أن YTHDC1 يربط أيضًا MILs (معلومات تكميلية ، الشكل S6a). أكد RIP-qPCR الخاص بنا باستخدام جسم مضاد أصلي ضد YTHDC1 أنه مرتبط بـ m 6 بعلامة L1s ، بما في ذلك L1HS وبعض Super-MILs (معلومات تكميلية ، الشكل S6b). طبقنا تحليل eCLIP-Seq مشابهًا على الجين 3 'UTRs ، مواقع m 6 A الأساسية على mRNAs. كشف هذا التحليل عن قائمة أخرى من RBPs ، بما في ذلك قراء m 6 A المبلغ عنها مؤخرًا IGF2BP1 و IGF2BP2 (معلومات تكميلية ، الشكل S6c). 77 نشير إلى هذه المجموعة من RBPs على أنها 3UTR-m 6 A-RBPs ، والتي أظهرت تداخلًا محدودًا مع MIL-RBPs. RBM15 هي واحدة من RBPs الموجودة في كلتا القائمتين (الشكل 3 أ ، المعلومات التكميلية ، الشكل S6c) ، مما يشير إلى أنه محول مشترك لترسيب m 6 A في كلا الموقعين. 75 لم يتم العثور على بعض أفضل MIL-RBPs في 3UTR-m 6 A-RBPs ، مثل SAFB و HLTF و UCHL5 و LARP4 و RBFOX2. يشير عدم ارتباط MIL-RBPs بـ 3’UTRs إلى أن تفاعلاتهم مع MILs لا تعتمد فقط على إشارات m 6 A.

أ مخطط شريط مُصنَّف يُظهر عدد قمم m 6 A على L1s التي تتداخل مع قمم RBP eCLIP (مجموعات بيانات ENCODE K562). تشير الأشرطة الزرقاء إلى الأرقام المرصودة ، وتشير الأشرطة الخضراء إلى الأرقام المتوقعة المحسوبة باستخدام مناطق عشوائية. تم حساب الدلالة الإحصائية لكل عملية تخصيب RBP على MILs من خلال مقارنة الأرقام المرصودة بالأرقام المتوقعة ص-تم تصنيف القيم (النقطة الحمراء) بناءً على المقياس الموضح أعلى اللوحة (اختبارات فيشر الدقيقة). أول اثنين من RBPs (SAFB2 و HLTF) كان لهما أهمية كبيرة ص- القيم التي سيتم تضمينها في المقياس (على سبيل المثال ، -Log10 من ص-values ​​& gt 600) ، لذلك لم يتم عرض نقطة حمراء. ب مؤامرات ملف تعريف Metagene لإشارات eCLIP-Seq تُظهر ارتباط SAFB و RBM15 و SAFB2 و hnRNPU على MILs ، مع إشارات من عناصر التحكم في إدخال نفس الجزيء (الرمادي) المرسومة كخلفية. تركزت كثافة القراءة على قمم intronic L1 m 6 A (± 3 kb). ج لقطة لمتصفح الجينوم لبيانات TT-Seq و MINT-Seq وبيانات eCLIP-Seq المتعددة في DNAH14 المكان. يشير الضوء الأصفر إلى منطقة Super-MIL. د مخطط مربع يوضح شدة ربط SAFB (يقرأ eCLIP المقيس إلى المدخلات) على Super-MILs و MILs النموذجية و Control L1s (نفس المجموعات في الشكل 1). ص- القيم: مان ويتني يو اختبار. ه اللطخات الغربية من SAFB و SAFB2 و YTHDC1 بعد سحب الحمض النووي الريبي المنسدلة بيولوجيًا باستخدام الحمض النووي الريبي المركب في المختبر (مع أو بدون م 6 أ) ضد محلول الخلية الكاملة K562. كانت RNAs إما م 6 علامة (+) أو غير ميثيل (-). F توزيع مواقع ربط SAFB eCLIP-Seq على تسلسل إجماع L1HS. يتم عرض طول وموضع ستة شظايا L1HS (F1 إلى F6) ويتم استخدامها لسحب RNA في اللوحة ز. ز البقع الغربية من SAFB بعد سحب RNA باستخدام شظايا L1 RNA المركبة في المختبر. اللوحة السفلية: التقدير الكمي للبقع الغربية الذي يظهر تقارب الربط بين الطول الكامل L1HS وشظاياها مع SAFB. ح تلطيخ Coomassie الأزرق للبروتينات في RNA المنسدلة حيوياً باستخدام L1HS RNA المركب في المختبر (مع أو بدون m 6 A) ضد بروتين SAFB كامل الطول المؤتلف المعبر عنه في الحشرات. تُظهر صورة الهلام السفلية كمية متساوية من L1HS RNAs المستخدمة في السحب لأسفل.

من بين MIL-RBPs ، نختار التركيز على SAFB ، الذي تم الإبلاغ عنه مؤخرًا لتنظيم التحويل الرجعي L1 من خلال فحص CRISPR. 63 هذا أيضًا بسبب أدواره القوية الفريدة في التأثير على تعبير L1 RNA والانتقال الرجعي (انظر أدناه ، الشكل 4). SAFB هو بروتين مرتبط بالمصفوفة النووية ، 78،79 هيكل يعتبر مهمًا للحفاظ على بنية الكروماتين عالية الترتيب وتنظيم الجينات ، على الرغم من الجدل الذي قد يكون موجودًا. 80،81 أظهر تحليل بيانات eCLIP أن SAFB عرض تقاربًا أعلى بكثير لـ Super-MILs من MILs النموذجية أو غير m 6 A ملحوظ L1s (الشكل 3 D) ، مما يشير إلى أن SAFB من المحتمل أن يكون قارئ m 6 A-L1-RNA . استخدمنا تجارب سحب الحمض النووي الريبي المعامل بيوتينيلات في المختبر لدراسة ارتباطها. تم نسخ الحمض النووي الريبي المسمى بـ أو بدون m 6 A في المختبر لسحبها لأسفل ضد محللات الخلية K562. أظهرت اللطخات الغربية التي أعقبت هذه التجربة أن SAFB يرتبط على وجه التحديد بـ L1HS RNA ولكن ليس بـ RNA الضابط المطابق للطول (الشكل 3 هـ). الأهم من ذلك ، تم تعزيز تقارب SAFB إلى L1HS بشكل كبير من خلال وجود m 6 A ، في حين أظهر RNA الضبط ارتباطًا ضئيلًا من SAFB بغض النظر عن حالة m 6 A (الشكل 3 هـ). أظهر SAFB2 ، على غرار SAFB ، تقاربًا أقوى مع m 6 A ملحوظ L1HS (الشكل 3 هـ). على النقيض من ذلك ، قام قارئ m 6 A الكنسي ، YTHDC1 ، بربط كل من RNAs في أشكالهما المميزة بعلامة m 6 A ، لكنه أظهر تقاربًا ضئيلًا مع RNAs غير الميثيل (الشكل 3 هـ). اختبرنا أيضًا الارتباط بين SAFB و Super-MIL في جين PSMA1 ، باستخدام L1HS ومنطقة intronic غير L1 كعناصر تحكم (معلومات تكميلية ، الشكل S6d والجدول S4). أظهرت النتائج أن SAFB يربط Super-MIL و L1HS بتقارب مماثل ، ويعرض ارتباطًا أقوى بـ M 6 A المسمى L1s ، لكنه لا يربط non-L1 RNA بغض النظر عن وجود m 6 A (المعلومات التكميلية ، الشكل 1 أ). . S6d).

أ خريطة حرارية تُظهر تغييرات تعبير RNA للعائلات الفرعية L1 بعد هدم البروتينات المستهدفة (بناءً على إعادة تحليل بيانات ENCODE K562 RNA-Seq). استندت تغييرات الطية إلى المقارنة مع عناصر تحكم sgRNA أو shRNA ذات الصلة. ب, ج خرائط التمثيل اللوني تظهر السجل2 تغيير أضعاف في وفرة L1 RNA (ب، تقاس من خلال إجمالي RNA-Seq المستنفد ريبو) ونسبة m 6 A (ج، تم قياسه بواسطة FPKM لـ MeRIP-Seq / FPKM من RNA-Seq) لعائلات فرعية L1 مختلفة بعد استنفاد METTL3 و METTL14 بواسطة siRNAs (siMETTL3 / 14). تم استخدام RNA-Seq بعد تعداء عن طريق التحكم في التدافع SiRNA (siCTL) كعنصر تحكم. د مخطط خط يوضح استقرار الحمض النووي الريبي لـ L1HS بعد علاج فلافوبيريدول في الوقت المحدد. تم حساب وفرة الحمض النووي الريبي بواسطة RT-qPCR وتم تطبيعها إلى 0 ساعة زمنية في كل مجموعة. ه مستويات تعبير RNA طبيعية لـ L1HS-Ta نشط (Chr22-q12.1) بعد استنفاد METTL3 و YTHDC1 و SAFB بواسطة siRNA في خلايا MCF7. F مخطط شريطي يُظهر نشاط النقل الرجعي L1-Neo الطبيعي في الخلايا ذات البروتينات المستهدفة المحددة المستنفدة بواسطة siRNAs. تم حساب أرقام مستعمرة الخلايا ومقارنتها بمجموعة التحكم. تظهر الصور التمثيلية لمستعمرات الخلايا التي تنمو في طبق مزرعة على اليمين. ز مقارنة التسلسل بين بناء مراسل الإجماع L1 (Con ، أشرطة رمادية) وبناء متحولة L1 RRACH (موت ، أشرطة زرقاء). يتم عرض أرقام نموذج RRACH في كل حاوية 500 نقطة أساس في L1HS. ح RT-qPCR التالية m 6 A RIP (meRIP) تُظهر المستويات النسبية m 6 A للمراسل L1HS RNAs (تم تعيين Con على أنه 1). تم تطبيع مستويات م 6 أ مع ارتفاع اصطناعي م 6 A-RNA. أنا على غرار لوحة د، تم قياس استقرار الحمض النووي الريبي لـ Con L1HS و Mut L1HS RNAs. ي على غرار لوحة F، اختبار مراسل L1-Neo يُظهر نشاط التحويل الرجعي لـ Con L1HS و Mut L1HS. ك الأشعة فوق البنفسجية-اختبار RIP باستخدام جسم مضاد أصلي ضد SAFB يظهر الارتباط الطبيعي بين SAFB و Con / Mut L1HS RNAs. ل تغييرات التعبير عن Con L1HS أو Mut L1HS RNAs بعد هدم SAFB. جميع بيانات qPCR تعني ± SD. *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 ، للطالب ر-اختبار.

قد يعتمد ربط SAFB بنصوص m 6 A-L1 على مناطق أو أشكال معينة من الحمض النووي الريبي. لتحديد هذه المناطق / الأشكال التي قد تفسر التقارب العالي لربط SAFB ، قمنا بإعادة محاذاة مواقع ربط SAFB eCLIP-Seq لجينوم زائف لتسلسل إجماع L1HS (الشكل 3f المواد والطرق).وجدنا عددًا قليلاً من مناطق L1HS التي يبدو أنها متواليات "عالية التقارب" (على سبيل المثال ، 5’UTR ونهاية ORF1 والجزء الأوسط من ORF2 ، الشكل 3f). بناءً على ذلك ، قمنا بتقسيم L1HS إلى 6 شظايا لإجراء الفحص المنسدل للحمض النووي الريبي المعزز بيولوجيًا (الأجزاء من 1 إلى 6 ، أو F1 إلى F6 ، الشكل 3f). كشفت هذه التجربة أن أيا من الشظايا أظهرت ارتباطًا قويًا مع SAFB (الشكل 3g) ، على الرغم من أن F4 (

3000–4300 nt من توافق L1HS) يمتلك مستوى ارتباط يمكن اكتشافه (الشكل 3g). سعينا إلى تحديد أشكال ربط SAFB المفترضة من مواقع ربط eCLIP الخاصة بها على L1s ، باستخدام أداة اكتشاف عزر CLIP-Seq مخصصة (على سبيل المثال ، GraphProt). 82،83 حدد هذا فكرة SAFB مفترضة 5-mer تتكون من خماسيات مخصبة A / G (على سبيل المثال ، GAAAA ، المعلومات التكميلية ، الشكل S6e) ، بما يتوافق مع تقرير سابق من iCLIP. 84 ومع ذلك ، أظهر هذا الفكرة المفترضة حدوثًا واسعًا في تسلسل L1 (معلومات تكميلية ، الشكل S6f). تظهر كثافة هذه الأشكال الخماسية متشابهة في الطول الكامل L1HS مقارنة بشظايا L1 (معلومات تكميلية ، الشكل S6f). تشير هذه النتيجة إلى أن كثافة الأشكال الخماسية لا يمكن أن تفسر الارتباط الانتقائي لـ SAFB بالطول الكامل L1 RNA بدلاً من شظايا L1 (الشكل 3g). بالإضافة إلى ذلك ، لم نعثر على أي ارتباط بين كثافة هذه البنتاميرات في كل MIL وتقارب ربط SAFB eCLIP-Seq ذي الصلة (معلومات تكميلية ، الشكل S6g). تشير هذه البيانات إلى أنه من غير المحتمل أن يتم التوسط بين L1 و SAFB بواسطة عزر RNA قصير ، ولكن على الأرجح بواسطة هياكل RNA اعتمادًا على التسلسلات الطويلة.

لدراسة الارتباط المباشر بين SAFB / L1-RNA ، قمنا بتوليد بروتين SAFB كامل الطول المؤتلف وخلطناه مع L1HS RNAs في المختبر. هذا يؤكد أنهم يربطون بعضهم البعض بشكل مباشر وأن m 6 A يعزز تفاعلهم (الشكل 3 ح). أجرينا كذلك اختبارًا لمنافسة RNA لتوصيف تقارب الربط بين SAFB و L1 RNAs. في هذا الاختبار ، تعرض مجمع SAFB / L1-RNA المعطل للمنافسة من خلال أشكال مختلفة من L1HS RNA أو L1HS RNA أو RNA المطابق لطول التحكم (معلومات تكميلية ، الشكل S6h). تحققت نتائجنا من أن SAFB تربط L1 RNA في كل من الأشكال المعدلة من non-m 6 A- أو m 6 A ، ولكنها تظهر تقاربًا أعلى بنموذج m 6 A (معلومات تكميلية ، الشكل S6i ، j). لم يُظهر SAFB أي ارتباط يمكن اكتشافه مع L1 RNA في اتجاه عكسي أو مع RNA تحكم ، بغض النظر عما إذا كانت علامة m 6 A أم لا (معلومات تكميلية ، الشكل S6i). بشكل جماعي ، تشير نتائجنا إلى أن SAFB هو قارئ m 6 A-L1 RNAs ، ولكن ليس قارئًا لـ m 6 A علامة يعتمد سلوك "القارئ" هذا على وجود تسلسلات L1 RNA طويلة وقد تم تحسينه بواسطة m 6 A. يختلف هذا الارتباط عن الارتباط الكنسي m 6 A / القارئ مثل ارتباط YTHDC1 ، الذي يتعرف على علامة m 6 A 85 (الشكل 3f المعلومات التكميلية ، الشكل S6d).

م 6 تعديل مقابل SAFB: أدوار معاكسة في التحكم في تعبير L1 والانتقال الرجعي

درسنا بعد ذلك أدوار تعديل m 6 A و MIL-RBPs. أظهر تحليل ENCODE RNA-Seq الذي تم إنشاؤه في خلايا K562 74،86 أن استنفاد أعلى MIL-RBPs أدى إلى تغييرات متغيرة في تعبير L1 RNA (الشكل 4 أ). أدى استنفاد RBM15 ، وهو محول نووي يجند m 6 A methyltransferase ، 75 إلى انخفاض ملحوظ في مستويات RNA للعديد من العائلات الفرعية L1 (الشكل 4 أ). الضربة القاضية للقارئ m 6 A-L1 الذي تم تحديده حديثًا ، SAFB ، زاد تعبير L1 RNA بقوة (الشكل 4 أ) ، مما يشير إلى أنه يعمل بمثابة مثبط L1 63 بينما تسبب ضربة قاضية لـ SAFB2 ، وهو آخر أعلى من MIL-RBP ومماثل SAFB ، تأثيرات ضئيلة (الشكل 4 أ). أكدنا هذه التغييرات على L1HS واثنين من Super-MILs بواسطة RT-qPCRs (معلومات تكميلية ، الشكل S7a ، ب). بالنسبة إلى MIL-RBPs الأخرى التي تم تحديدها حديثًا ، تم العثور على بعضها أيضًا لتنظيم تعبير L1 RNA ، أي UCHL5 و KHDRBS1 و PPIL4 ، لكن نطاقات زيادات L1 عند الضربة القاضية لم تكن قوية مثل تلك التي شوهدت بعد استنفاد SAFB (الشكل 4 أ) . لاحظنا أن تأثير استنفاد SAFB و RBM15 على L1s كان أكثر وضوحًا بالنسبة للشباب L1s (أي ، L1PA1-6 ، الشكل 4 أ) ، والذي يرتبط جيدًا بمستوياتهم الأعلى م 6 أ (الشكل 2 أ). في الواقع ، أثرت ضربة قاضية لهذين العاملين بشكل بارز على Super-MILs لأنها تحمل أعلى مستويات m 6 A (معلومات تكميلية ، الشكل S7c). جنبًا إلى جنب مع البيانات المتعلقة بالارتباط الإيجابي بين ثبات m 6 A و L1 (الشكل 1 ي) ، اقترحت هذه النتائج أن ترسب m 6 A يعزز تعبير L1 RNA أو استقراره ، في حين يقاوم قارئ L1 الجديد SAFB مثل هذه الأدوار.

لقد درسنا هذه الفرضية ، أولاً ، من خلال استنفاد m 6 A methyltransferase (أي الكاتب) المركب METTL3 و METTL14 باستخدام siRNAs (معلومات تكميلية ، الشكل S7d ، e). أدى ذلك إلى انخفاض كبير في مستوى m 6 A بالإضافة إلى وفرة RNA لـ L1s (الشكل 4 ب ، ج معلومات تكميلية ، الشكل S7d ، f) ، مما يشير إلى الدور الإيجابي لـ m 6 A في تعبير L1. كانت التغييرات في وفرة L1 التي أظهرها RNA-Seq أكثر وضوحًا بالنسبة لـ m 6 A الذي يحمل علامة L1 RNAs مقارنة بـ L1 RNAs بدون هذه العلامة ، مما يشير إلى اعتماد m 6 A (معلومات تكميلية ، الشكل S7g). من الجدير بالذكر أن تخفيض m 6 A على L1s بعد ضربة قاضية للكاتب كان كبيرًا ولكنه غير مكتمل (الشكل 4 ج معلومات تكميلية ، الشكل S7f) ، بما يتوافق مع اقتراح سابق بأنه حتى الكميات المتبقية من مجمع METTL3 / 14 قد تكون كافية لتوليد مستوى كبير من m 6 A على العديد من RNAs. 87 تعديل آخر للـ RNA ، ن يمكن أيضًا التعرف على 6 ، 2-O-dimethyladenosine (m 6 am) بواسطة الجسم المضاد لـ m 6 A أثناء MeRIP أو MINT-Seq. لم تؤثر ضربة قاضية 88،89 لـ PCIF1 ، 90،91 على ميثيل ترانسفيراز لـ m 6 Am ، على مستويات التعبير لـ L1 RNAs (معلومات تكميلية ، الشكل S7b) ، مما يشير إلى أن هذه العلامة لم تكن متورطة بشكل مباشر في التحكم L1.

لتأكيد هذه النتائج ، قمنا بإعادة تحليل سلسلة من بيانات RNA-Seq التي تم نشرها مؤخرًا ، 58،92،93،94،95،96،97 ووجدنا أن استنفاد الكتاب أو القارئ m 6 A (METTL3 ، METTL14 ، ZC3H13 ، YTHDC1) بشكل عام ، خفضت مستويات الحمض النووي الريبي الصغير L1 في كل من الخلايا البشرية والفأرية (معلومات تكميلية ، الشكل S8a-f) ، مما يشير إلى الدور الإيجابي لـ m 6 A في تعبير L1. في الماوس ، تعد L1Md_T و L1Md_A و L1Md_Gf أصغر العائلات الفرعية وهي أيضًا المجموعات الرئيسية المعروفة بأنها نشطة بشكل انتقالي. 59،98 تم تقليل وفرة الحمض النووي الريبي لهذه العائلات الفرعية الأصغر سناً بشكل ملحوظ في ESCs الماوس عند الضربة القاضية (KO) من كتاب m 6 A (معلومات تكميلية ، الشكل S8a-d) ، المرتبطة بمستوياتهم الأعلى m 6 A الموضحة أعلاه ( الشكل 2 ب). على النقيض من ذلك ، فإن وفرة بعض RNAs L1 الأقدم نسبيًا ، مثل L1Md_F ، زادت بشكل معتدل أو لم تتغير في العديد من مجموعات البيانات (معلومات تكميلية ، الشكل S8a-d). تمشيا مع فرضيتنا ، تم تقليل استقرار L1 RNA عالميًا في غياب كاتب m 6 A ، كما يتضح من إعادة تحليل مجموعة بيانات RNA-Seq ذات الدورة الزمنية المنشورة بعد ضربة قاضية METTL14 65 (معلومات تكميلية ، الشكل S8g). على النقيض من ذلك ، تم زيادة استقرار L1 بواسطة ضربة قاضية SAFB (الشكل 4 د). تشير هذه النتائج إلى أن m 6 A وقارئها SAFB يتحكمان بشكل معاكس في تعبير L1 RNA ، على الأقل جزئيًا ، عن طريق تعديل استقرار RNA.

L1 RNA هو الوسيط الرئيسي لنقله الرجعي. لقد استجوبنا سؤالًا مهمًا ورد ذكره سابقًا (الشكل 2f): كيف تؤثر علامة m 6 A على نشاط التحويل الرجعي L1؟ باستخدام بادئات RT-qPCR محددة تستهدف L1HS-Ta المذكورة أعلاه في Chr22-q12.1 (الشكل 2 هـ) ، RC-L1 الأكثر نشاطًا في السرطانات البشرية ، 22 قمنا بفحص تعبيرها عند استنفاد SAFB و METTL3 و YTHDC1 في خلايا MCF7 حيث يكون L1HS-Ta نشطًا. كشفت هذه التجربة عن تقليل هذا L1 الحي المفرد (الشكل 4 هـ) ، بطريقة مشابهة لـ pan-L1HS (كامل L1HS في الجينوم) أو L1s الميتة الأخرى. الأهم من ذلك ، من خلال اختبار مراسل النقل الرجعي L1-neo الراسخ 99 (معلومات تكميلية ، الشكل S9a) ، وجدنا أن نشاط التحويل الرجعي L1 قد زاد بشكل ملحوظ بعد استنفاد SAFB ، ولكنه أضعف بضربة قاضية YTHDC1 و METTL3 (الشكل 4f المعلومات التكميلية ، الشكل 4f). . S9b). لم تُعزى هذه التغييرات في نشاط التحويل الرجعي إلى كفاءة تعداء مختلفة أو معدلات تكاثر لأن البنية المقاومة للبيروميسين المنقولة بشكل مشترك أدت إلى معدلات بقاء الخلية مماثلة (معلومات تكميلية ، الشكل S9c). لم يُظهر RT-qPCR عبر إنترونات أو إكسونات جين نيومايسين في المراسل أي انخفاض في التضفير ، مستبعدًا أن التأثيرات كانت ناتجة عن تغيير التضفير في RNA المراسل (معلومات تكميلية ، الشكل S9d). تمشيا مع زيادة التحويل الرجعي L1 في فحوصات المراسل ، بعد زراعة الخلايا المستنفدة لـ SAFB لمقاطع & gt 20 ، وجدنا عددًا أكبر بكثير من L1HS في الحمض النووي الجيني الخاص بهم (معلومات تكميلية ، الشكل S9e). لم يكن هناك أي تغيير في عائلة L1 غير نشطة ، L1PA2 (معلومات تكميلية ، الشكل S9e) ، مما يدعم أن تغييرات التحويل الرجعي L1 كانت تأثيرات محددة. تم إلغاء زيادة نسخة L1 في وجود مثبط للنسخة العكسية ، لاميفودين (3TC) (معلومات تكميلية ، الشكل S9f) ، مما يشير إلى أحداث التحويل الرجعي الحسن النية. أشارت هذه البيانات معًا إلى أن الكاتب / القارئ المعروف m 6 A عزز بشكل إيجابي التحويل الرجعي L1 ، بينما قام SAFB بقمع ذلك على وجه التحديد.

الأدوار المباشرة والإيجابية لـ m 6 A في تعبير L1 RNA والانتقال الرجعي

على الرغم من أن هذه البيانات متسقة للغاية ، إلا أن ضربة قاضية لكتاب m 6 A يمكن أن تؤثر على الجينات الأخرى وقد تؤثر على L1s بشكل غير مباشر. سعينا إلى تعزيز الدور المباشر لـ m 6 A في التحكم L1. m 6 A رواسب لعنصر RRACH على mRNAs ، 54،55،89،101 ووجدنا هذا متسقًا في L1s (معلومات تكميلية ، الشكل S2d). لذلك أجرينا تجربة "m 6 A mutagenesis" عن طريق إنشاء بناء مراسل L1-neo باستخدام

تحور 35 ٪ (من 141 إلى 92) من أشكال RRACH الخاصة بها لتفقد "RAC" (الشكل 4g معلومات تكميلية ، الشكل S9a). نحن نضمن أن هذا "m 6 A mutagenesis" أدخل الحد الأدنى من تغيير تسلسل L1 RNA (& lt1٪ ، أي 55 من

6000 nt) ولا يوجد فرق في الأحماض الأمينية. فيما يلي نتحرى عن الوظيفة السببية لـ m 6 A بمقارنة m 6 A-موتمراسل النملة L1-neo (أي موت) للمراسل الأصلي مع يخدعتسلسل Sensus L1HS (أي Con) (الشكل 4g معلومات تكميلية ، الجدول S4).

تمشيا مع التنبؤ ، أعرب مراسل موت عن L1HS RNA بمستوى أقل م 6 أ مقارنة بمستوى مراسل كون (الشكل 4 ح). كان RNA Mut L1HS أيضًا أقل استقرارًا (الشكل 4i) ، بما يتوافق مع الدور الإيجابي لـ m 6 A على استقرار L1 RNA (الشكل 1i ، المعلومات التكميلية ، الشكل S8g). الأهم من ذلك ، أظهر Mut L1HS نشاطًا أقل من التحويل الرجعي مقارنةً بـ Con L1HS (الشكل 4 ي). أظهرت اللطخة الشمالية ملف تعريف RNA مشابهًا لمراسل L1 RNAs (معلومات تكميلية ، الشكل S9g) ، مستبعدًا أن طفرات RRACH قد تتسبب في الإنهاء المسبق للنسخ أو التضفير الشاذ لـ L1 RNAs. أظهرت هذه النتائج دورًا مباشرًا لـ m 6 A في تعزيز استقرار L1 RNA ونشاط التحويل الرجعي. قمنا أيضًا بتقييم ما إذا كان ارتباط أو أدوار SAFB على L1s يعتمد بشكل مباشر على m 6 A. أظهر مقايسة الترسيب المناعي RNA المتشابك (UV-RIP) أنه مقارنةً بـ Con L1HS ، كان Mut L1HS أقل ارتباطًا بـ SAFB (الشكل 4 كيلو بايت) ). يتوافق هذا مع التخفيض الكمي m 6 A على Mut L1HS (الشكل 4 ح) ، مما يؤكد أن ربط SAFB-L1 يتم بوساطة مباشرة بواسطة مستويات m 6 A (انظر أيضًا الشكل 3). نتيجة لربط SAFB المنخفض ، كان RNA L1HS أقل تأثرًا باستنفاد SAFB مقارنةً بـ Con L1HS RNA (الشكل 4 لتر).

مجتمعة ، أظهرت هذه البيانات أن m 6 A هي علامة فريدة تفيد التعبير L1 (كل من RC-L1 و L1s الميت) وإعادة التحويل (RC-L1s) ، والتي تم التوسط فيها جزئيًا على الأقل عن طريق التحكم في استقرار الحمض النووي الريبي. على النقيض من ذلك ، فإن SAFB هو عامل مضيف يتعارض مع هذه الأدوار المفيدة لـ m 6 A من خلال الربط المباشر m 6 A-L1s لتقليل وفرتها ، بما يتوافق مع دوره كمثبط L1 تم تحديده في فحص CRISPR. 63

تعد MILs فئة جديدة من العناصر التنظيمية التي غالبًا ما تقمع نسخ الجينات المضيفة

العدد الكبير من MILs التي حددناها في كل نوع خلية (

2000 إلى & gt 4000 لكل نوع خلية) موجهة في الغالب إلى الإحساس لاستضافة الجينات (الشكل 1 ج) ، يتم نسخها بشكل مشترك بدون محفزات مستقلة ، وغالبًا ما تكون مستقرة تمامًا ولكنها غير مقسمة إلى مضيف mRNAs (معلومات تكميلية ، الشكل S5) ، مما يثير تساؤلات حول ما هي آثارها على التعبير الجيني المضيف (الشكل 2f). الأهم من ذلك ، يمكن أن تكون intronic L1s موجودة مسبقًا / مشروحة في الجينوم البشري أو يتم إنشاؤها عن طريق إدخال de novo L1. 22،30،31،32،33،34 لقد لاحظنا بالفعل أن MILs تميل إلى التواجد في الجينات المضيفة المرتبطة بإصلاح أضرار الحمض النووي والاستجابة لها (جينات DDR ، المعلومات التكميلية ، الشكل S3f). بعد فحص الجينات البشرية التي تستضيف MIL ، وجدنا أن لها متوسط ​​طول يبلغ 100 كيلو بايت ، وهو أطول بكثير من جميع جينات RefSeq ، أو الجينات التي تستضيف non-m 6 A-L1s (الشكل 5 أ). ومن المثير للاهتمام ، أن جينات DDR البشرية (معلومات تكميلية ، الجدول S6) أطول بشكل عام من المتوسط ​​، والمجموعة الفرعية من الجينات التي تستضيف MILs طويلة بشكل خاص (الشكل 5 ب). تم الافتراض أن النسخ المعطل للجينات الطويلة يكمن وراء مسببات المرض ، 39،41،102 لكن الآليات الأساسية بعيدة المنال. لذلك نحن فضوليون لاختبار فرضية أن MILs الموجودة في الجينات الطويلة قد تنظم تعبيرها ، مما يمثل آلية تفاعل L1 مع مضيف غير مقدَّر (الشكل 2f).

أ مخطط مربع يوضح أطوال الجينات البشرية التي تستضيف Super-MILs و MILs النموذجية و Control L1s. يتم أيضًا رسم طول جميع جينات hg19 RefSeq للمقارنة. ب مخطط مربع يوضح أطوال جينات إصلاح تلف الحمض النووي البشري (DDR ، ن = 448) وجينات DDR التي تستضيف MILs (ن = 37). يظهر أيضًا طول جميع الجينات البشرية RefSeq. ج رسم تخطيطي يوضح استراتيجية حساب TBI لـ intronic L1s استنادًا إلى بيانات TT-Seq. يشير الفهرس الأصغر إلى دور حظر أقوى ، بينما يشير الرقم القريب من 1 إلى عدم وجود حظر. د مخطط مربع يعرض TBIs لـ Super-MILs و MILs النموذجية و Control L1s التي تشير إلى تأثيرها على جينات الاستضافة المعنية (بناءً على K562 TT-Seq باستخدام المعادلة في اللوحة ج). ه لقطات مستعرض الجينوم تظهر تصميم KO لثلاثة L1s مختلفة في إنترونات ZRANB3: مضاد L1 (AS-L1 ، لا m 6 A في MINT-Seq) ، و MIL (منخفض م 6 أ) و Super-MIL (قوي م 6) أ). تُظهر الإبرازات الصفراء مواقع هذه المناطق في ZRANB3 الجين (أسفل هذه اللوحة). كما تظهر مناطق مرنا المستهدفة بواسطة الاشعال qPCR. F تظهر نتائج RT-qPCR مستويات التعبير عن ZRANB3 مرنا بعد ضرب ثلاث مناطق مختلفة L1 (كما في اللوحة ز). ز لقطة متصفح الجينوم لـ TT-Seq تظهر زيادة نسخ ملفات ZRANB3 الجين بعد Super-MIL KO. يشير MINT-Seq إلى مستويات m 6 A من Super-MILs. يشير خط الشرطة إلى حذف نهاية 3 من Super-MIL. WT ، wildtype KO # 1 / # 2 ، نسختان من خلايا خروج المغلوب. تم تصنيف TBI لـ Super-MIL المحسوب بواسطة كل TT-Seq. ح تظهر نتائج RT-qPCR مستويات التعبير عن PSMA1 mRNA بعد الضرب أو عكس منطقة Super-MIL (انظر اللوحة أنا). أنا على غرار لوحة ز. لقطة متصفح الجينوم لـ TT-Seq تظهر زيادة نسخ ملفات PSMA1 الجين بعد Super-MIL KO و / أو الانقلاب. WT ، wildtype KO # 1 / # 2 ، اثنان من استنساخ خلية بالضربة القاضية Inversion # 1 / # 2 ، نسختان من الخلايا المقلوبة Super-MIL. تم تصنيف TBI لـ Super-MIL المحسوب بواسطة كل TT-Seq. يشار إلى الاشعال ل mRNA RT-qPCR. لجميع قطع الصندوق ، ص- تم حساب القيم مع مان ويتني يو اختبار ويتم تمييزها في كل لوحة. بالنسبة لنتائج RT-qPCR ، فإن إظهار البيانات يعني ± SD. *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 ، للطالب ر-اختبار.

بالاستفادة من TT-Seq ، قمنا بتطوير إستراتيجية حسابية أشرنا إليها على أنها رالفدية بقفل أناndex (TBI) لقياس نشاط النسخ لجينات الاستضافة بعد كل intronic L1 مقارنةً بالنشاط السابق (الشكل 5 ج). TBI هي دالة لفرد L1s تعكس كميًا مدى قوتها في التأثير على نسخ جيناتها المضيفة ، مع وجود رقم قريب من 1 يشير إلى نقص الوظيفة ، وكلما انخفض مؤشر الإصابات الدماغية ، كلما كان تأثير منع النسخ أقوى (الشكل 1 ب). 5 ج). بشكل ملحوظ ، كشف هذا التحليل أن MILs أظهرت تأثيرًا كبيرًا في منع النسخ على الجينات المضيفة أكثر من ذلك الذي يمنحه التحكم intronic L1s بدون علامات m 6 A (الشكل 5 د). ترتبط تأثيرات الحجب لـ MILs بمستويات m 6 A الخاصة بهم ، أي ، أظهرت Super-MILs انخفاض ملحوظ في إصابات الدماغ الرضحية مقارنةً بـ MILs النموذجية (الشكل 5 د). تشير هذه الملاحظة إلى أن MILs قد تمثل فئة كبيرة لم يتم تقديرها سابقًا من عناصر النسخ لتنظيم الجينات البشرية.

للتحقق من صحة هذه النتيجة وظيفيًا ، قمنا بإخراج العديد من مناطق الجينوم L1 لترميز MIL RNAs أو التحكم في L1s بواسطة CRISPR / Cas9. اخترنا ZRANB3 الموضع لأنه لا يحتوي فقط على Super-MIL ، ولكن أيضًا منطقتين أخريين من L1 بطول مماثل ، والتي تختلف مع ذلك في وجود m 6 A (a MIL) أو عدم وجود m 6 A (وهو مضاد للإحساس intronic L1 ZRANB3 الجين ، AS-L1) (الشكل 5 هـ). أدى KO of the Super-MIL إلى زيادة التعبير بشكل ملحوظ عن ZRANB3 مرنا (

2.8 أضعاف) في نسختين مستقلتين من الخلايا (الشكل 5 هـ ، و). على النقيض من ذلك ، لم يتسبب حذف منطقة AS-L1 التي لا تولد m 6 A-RNA في حدوث تغيير ثابت / مهم في ZRANB3 التعبير في ثلاث خلايا مستنسخة (الشكل 5f). زاد KO لـ 6 A MIL منخفضة م (MIL-KO ، الشكل 5 هـ) بشكل معتدل ZRANB3 تعبير mRNA مقارنة بخلايا WT (الشكل 5f). أجرينا TT-Seq في الخلايا البرية و Super-MIL KO لاختبار أساس النسخ ZRANB3 upregulation (الشكل 5g). دعماً لدور Super-MIL كـ "حاجز نسخي" ، تمت زيادة TBI بحوالي 0.543 في خلايا WT (الشكل 5g ، مقارنة إشارات TT-Seq إلى اليسار مقابل تلك الموجودة على يمين الخط المتقطع) إلى

1.06 بعد حذف Super-MIL بشكل ملحوظ ، تمت استعادة النسخ المصب إلى Super-MIL إلى مستوى مماثل لمنطقة المنبع (الشكل 5g ، مقارنة إشارات KO و WT على يسار الخط المتقطع). يتوافق "إلغاء الحظر" النسخي مع التنظيم الكبير لـ ZRANB3 مرنا (الشكل 5f). لاحظنا نتائج متسقة للغاية لـ Super-MIL آخر يقع في PSMA1 intron ، أي الحذف الجيني لهذا Super-MIL زاد بشكل كبير من التعبير عن PSMA1 مرنا (

2 أضعاف) في نسختين من الخلايا (الشكل 5 ح). في هذه الحالة ، أظهر TT-Seq أن TBI قد زاد من

0.7 (الشكل 5i). ال PSMA1 كانت زيادة mRNA بسبب إزالة "حاجز النسخ" كما يتضح من TT-Seq أن زيادات النسخ كانت خاصة بمناطق المصب من Super-MIL (يسارًا للخط المتقطع ، الشكل 5i) ، بينما يمكن أن يكون هناك اختلاف بسيط وجدت للمناطق المنبع منه (الجانب الأيمن من منطقة KO في الشكل 5i).

يدعم كل من تحليلنا العالمي والحذف الخاص بالموقع للعديد من L1s (الشكل 5d-i) أن تشفير L1s لاتجاه المعنى فقط لـ Super-MIL RNAs تميل إلى العمل كحواجز نسخية قوية. لتأكيد هذا الاستنتاج بشكل أكبر ، ولتحديد ما إذا كان يجب أن تُنسب تأثيرات حذف Super-MIL إلى m 6 A-L1 RNA أو منطقة DNA ، أجرينا تجربة انعكاس L1. حددنا نسختين من الخلايا تم فيهما قلب منطقة Super-MIL الأصلية. يمكن التحقق من ذلك من خلال وجود إشارات TT-Seq المعكوسة الاتجاه من الخيط الآخر والتي لم يتم رؤيتها في خلايا WT (الشكل 5i). في الخلايا ذات انعكاس L1 ، PSMA1 لا يزال التعبير مرنا يزداد بنسبة

ضعفين مقارنةً بـ WT ، والذي يبدو أنه لا يمكن تمييزه عن Super-MIL KO (الشكل 5 ح) باستمرار ، أظهر TT-Seq أنماطًا متطابقة تقريبًا من النسخ ومستويات TBI مماثلة في الخلايا ذات L1 KO أو الانعكاس (الشكل 5i).

علاوة على ذلك ، قمنا بتطوير نظام "m 6 A eraser" عن طريق دمج Cas13d 103 الميت حفزيًا (أي dCasRx) إما مع m 6 A demethylase FTO (dCasRx-FTO) أو متحولة FTO بدون نشاط إنزيمي (H231A / D233A ، 104 dCasRx-FTO-mut) (معلومات تكميلية ، الشكل S10a). مستهدفة m 6 A التحرير بواسطة wildtype FTO لكن ليس متحولة FTO قيد التشغيل ZRANB3 خفضت Super-MIL مستوى وتعبيرها m 6 A ، مما أدى إلى زيادة ZRANB3 تعبير mRNA (معلومات تكميلية ، الشكل S10b-d). أظهرت هذه السلسلة من البيانات معًا عن طريق حذف أو عكس L1s وعن طريق تحرير dCasRx-FTO أن Super-MILs تخفف من التعبير الجيني المضيف عن طريق منع نسخها ، ويعتمد تأثير الحجب على اتجاه L1 RNA ومستوى m 6 A.

يحمي SAFB / B2 النسخ الجيني الطويل عن طريق استعداء MILs كحواجز طريق نسخية

على الرغم من أن ضربة قاضية SAFB2 وحدها تسببت في تأثيرات ضئيلة على تعبير L1 (الشكل 4 أ ، معلومات تكميلية ، الشكل S7b) ، إلا أنها أدت إلى تفاقم زيادة L1HS في الخلايا المستنفدة من SAFB (الشكل 6 أ). يقترح هذا الاكتشاف تعويضًا وظيفيًا جزئيًا بين هذين البروتينين المتماثلين في التحكم MIL RNA ، تذكرنا بظاهرة مماثلة لقراء YTHDF على التحكم في الرنا المرسال. 105 وفقًا لذلك ، تحقق RNA-Seq من صحة هذا القمع التعاوني لـ L1 RNAs بواسطة SAFB و SAFB2 حيث تسبب siSAFB و ampB2 في زيادة وفرة L1 أقوى من siSAFB وحده (الشكل 6 ب). أثرت الضربة القاضية المزدوجة على وجه التحديد على L1s بعلامة m 6 A (معلومات تكميلية ، الشكل S10e) ، بما يتوافق مع ارتباطها التفضيلي بـ m 6 A-L1 RNAs.

أ تظهر نتائج RT-qPCR تغيرات التعبير عن L1HS بعد هدم SAFB أو SAFB2 في خلايا K562 بواسطة siRNA. تظهر أيضًا مستويات mRNA لـ SAFB و SAFB2. يشير siSAFB أو siSAFB2 إلى ضربة قاضية مفردة يشير siSAFB & ampB2 إلى استنفاد مزدوج. ب خريطة حرارية توضح وفرة RNA لعائلات فرعية L1 مختلفة بعد استنفاد SAFB (siSAFB) أو استنفاد SAFB و SAFB2 (siSAFB & ampB2) بواسطة siRNAs. البيانات من RNA-Seq وتشير إلى السجل2 أضعاف التغييرات في التعبير في مجموعة الضربة القاضية مقارنة بمجموعة siCTL. ج مخطط مربع يوضح TBIs (انظر الشكل 5 ج) للتحكم L1 أو Super-MILs أو MILs النموذجية على جينات الاستضافة الخاصة بهم. تستند البيانات إلى TT-Seq في خلايا K562 بنفس مجموعات الضربة القاضية كما في اللوحة ب. ص- تم احتساب القيم مع إقران الطالب ر-اختبار. د لقطة متصفح الجينوم تعرض إشارات TT-Seq فوق PSMA1 (علوي) أو ZRANB3 موضع الجين (السفلي) في السيطرة أو خلايا ضربة قاضية محددة كما هو محدد. يشير مسار MINT-Seq الموجود أعلى كل قطعة أرض إلى إشارات m 6 A للحصول على إشارات Super-MILs القوية. تشير خطوط الشرطة إلى النهاية 3 لمناطق Super-MIL. تشير النقاط البارزة باللون الأصفر إلى المناطق التي بها تغيير نصي قوي. تم تصنيف TBI لـ Super-MIL في كل TT-Seq. تظهر نتيجة RT-qPCR تقليل mRNA لـ ZRANB3 (ه) و PSMA1(F) بعد استنفاد SAFB (siSAFB) أو الاستنفاد المشترك لـ SAFB و SAFB2 (siSAFB & ampB2) في خلايا K562 من النوع البري (WT) أو خلايا خروج المغلوب Super-MIL المقابلة. ز خرائط الحرارة التي تم إنشاؤها عن طريق تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي لخلايا siCTL و siSAFB و siSAFB و ampB2 K562 ، والتي تُظهر التغييرات الطية للجينات المضيفة لـ MIL والتي هي جينات DDR. تظهر أشرطة المقياس على اليمين (على سبيل المثال ، الجينات المنتظمة بألوان زرقاء). ح على غرار لوحة ز، لكن هذه المؤامرات تُظهر تغييرات أضعاف في جينات استضافة MIL والتي تعتبر مثبطات L1 مفترضة (بواسطة Liu et al. ، اللوحة اليسرى 63 و Mita et al. ، اللوحة اليمنى 11). أنا مخطط انحدار يوضح العلاقة بين طول الجين وتغير تعبيرها بعد استنفاد SAFB أو SAFB & ampB2 في خلايا K562. تم تقسيم الجينات التي تستضيف MIL إلى خمس مجموعات متساوية العدد حسب الطول (x-محور) ، وتظهر تغييرات الطيات لكل مجموعة (تشير النقاط إلى تغيرات الطيات المتوسطة لجينات كل مجموعة ، وتشير الخطوط الرأسية إلى فاصل ثقة 95٪ لمتوسط ​​تغيرات الطية). تُظهر الخطوط انحدارًا خطيًا وتشير المناطق المظللة من الألوان المتطابقة إلى فاصل ثقة بنسبة 95٪ لهذا الانحدار. هناك 422 جينًا طويلًا (و 200 كيلو بايت) تؤوي MILs. استندت بيانات siSAFB أو siSAFB & ampB2 في هذا الشكل إلى polyA المحدد RNA-Seq. لجميع qPCRs ، عرض البيانات يعني ± SD. *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 ، للطالب ر-اختبار.

لقد أتاح "الإفراط في التنشيط" الواسع لـ MILs بعد استنفاد SAFB و ampB2 فرصة لفحص أدوارهم التنظيمية في نسخ الجينات المضيفة بطريقة عالمية. أجرينا TT-Seq في الخلايا المستنفدة من SAFB وحده أو من كل من SAFB و ampB2 ، وحسبنا TBI لـ intronic L1s على الجينات المضيفة (الشكل 5 ج). كشف هذا التحليل أن ضربة قاضية لـ SAFB قللت من إجمالي إصابات الدماغ في Super-MILs و MILs ، مما يشير إلى "حظر النسخ" لجينات الاستضافة بواسطة Super-MILs (الشكل 6 ج). بالتوافق ، أدت ضربة قاضية مزدوجة siSAFB و ampB2 إلى تفاقم هذا التأثير (الشكل 6 ج). قمنا بتصنيف جميع MILs بناءً على دلتا TBI الخاصة بهم (TBI في siSAFB و ampB2 - TBI في siCTL) ، وإيجاد تخفيض عام بواسطة siSAFB و ampB2 ، مع

37٪ من MILs تظهر انخفاضًا في الإصابات الدماغية الرضية أكبر من 0.1 (معلومات تكميلية ، الشكل S10f ، g). تعد MILs مع انخفاض TBI أعلى من مستويات M6 A من تلك التي لا تظهر تغييرات واضحة (المعلومات التكميلية ، الشكل S10h) ، لدعم التنظيم المعتمد على m 6 A لـ TBIs بواسطة SAFB & ampB2. كأمثلة ، يتم عرض مسارات TT-Seq لاثنين من Super-MILs بتنسيق PSMA1 و ZRANB3 الإنترونات ، والتي أوضحت أنها أصبحت "حصارًا نسخيًا" قويًا (الشكل 6 د). تم تخفيض TBIs وفقًا لذلك (تم وضع علامة على قطع الأرض) بعد استنفاد SAFB / SAFB2. يتوافق الحظر المعزز بواسطة MILs المفرط النشاط إلى حد كبير مع فقدان الحجب عند MILs KO في الشكل 5g ، i. أظهرت هذه النتائج معًا أن مجموعة كبيرة من MILs عبارة عن حواجز نسخ نصية متداخلة ، تعمل بطريقة تعتمد على وظائفها m 6 A من SAFB و SAFB2 بطريقة تعاونية لتصحيح عيوب النسخ لجينات المضيف التي تسببها مثل هذه الحواجز.

تفاعل L1- مضيف جديد بين MILs و SAFB / B2 والجينات المضيفة

نتيجة "الحصار النسخي لـ MIL" ، مستويات mRNA لاستضافة الجينات مثل PSMA1 و ZRANB3 انخفض بشكل كبير عن طريق ضربة قاضية SAFB أو SAFB & ampB2 (النصفين الأيسر من الشكل 6 هـ ، و) ، وهو ما يتوافق مع الزيادات التي تم الحصول عليها بواسطة MIL KO (الشكل 5f ، h). الأهم من ذلك ، أن هذين الجينين المضيفين لم يتأثروا أو أقل بـ siSAFB أو siSAFB & ampB2 عندما تم حذف Super-MILs (النصف الأيمن من الشكل 6 هـ ، و) ، مما يشير إلى أن SAFB و SAFB / B2 يعملان على هذه الجينات مباشرة عبر Super-MILs .

ذكّرتنا الأدوار القمعية الواضحة لـ MIL بالسمات المثيرة للاهتمام لجينات استضافة MIL وجينات إصلاح تلف الحمض النووي (DDR) والجينات الطويلة (الشكل 5 أ ، ب معلومات تكميلية ، الشكل S3f). تم تحديد فحص جينات DDR التي تستضيف MIL ZRANB3, SMARCAL1, ATR, ATRX, RB1, FANCC, FANCD2, FANCI (معلومات تكميلية ، الجدول S6) ، وكثير منهم من الأوصياء المهمين في الجينوم الذين قد يمنعون تعبئة L1. 11،19،20،63 على سبيل المثال ، ZRANB3 عبارة عن حاوية شفافة للحمض النووي ضرورية لصيانة شوكة النسخ المتماثل ، 106 وقد تم الكشف عنها مؤخرًا على أنها مثبط لنقل L1 retrotransposition. 11 وقد تبين على نطاق واسع أن هذا الجين يؤوي MILs قوية وتم قمعه من قبلهم (الأشكال 5e-g ، 6d ، e). على الصعيد العالمي ، تعرض جينات DDR التي تستضيف MILs بشكل عام تعبيرًا منخفضًا عند ضربة قاضية SAFB أو SAFB & ampB2 في RNA-Seq (الشكل 6g). كان التأثير أقوى بعد استنفاد SAFB و ampB2 المشترك (الشكل 6 جم) ، بما يتوافق مع زيادة أكثر دراماتيكية في تعبير MIL (الشكل 6 أ-ج).). هذا التحليل غير المتحيز لم يكشف فقط عن انخفاض عدد الجينات القليلة المذكورة سابقًا (ZRANB3, SMARCAL1, ATR, FANCD2، و FANCC) ، 106 ولكنهم حددوا أيضًا جينات DDR الأخرى على أنها مضيفة لـ MILs ، وتم قمعها بواسطة MILs ، مثل سبايدر, 107 ERCC6L2 108 و بريب 1 (البروتين المتفاعل BRCA1 ، المعروف أيضًا باسم ، FANCJ 109) (الشكل 6 ز ، اللوحة اليسرى). قمنا مباشرة بتجميع قائمتين منفصلتين من الجينات المستضيفة لـ MIL التي تم تحديدها على أنها مثبطات L1. أظهر عدد منهم تعبيرًا مثبطًا بشكل كبير عند الإفراط في تنشيط MIL (أي بواسطة SAFB أو SAFB & ampB2 استنفاد) (الشكل 6 ح). تم العثور على التعبير المخفض لجينات DDR التي تستضيف MIL بواسطة ضربة قاضية SAFB & ampB2 باستمرار في أنواع الخلايا الأخرى التي فحصناها (معلومات تكميلية ، الشكل S10i).

الميزة الرئيسية الأخرى لجينات استضافة MIL هي أنها طويلة جدًا (الشكل 5 أ ، ب). لاختبار ما إذا كانت الجينات الطويلة أكثر عرضة لحظر MIL ، قمنا بالتخطيط لطول الجينات المضيفة مقابل تغييرات تعبيرها بعد ضربة قاضية SAFB أو SAFB & ampB2. أظهر هذا التحليل اتجاهًا مثيرًا للاهتمام يتمثل في أن الجينات الطويلة كانت تفضيلية ، وأكثر قمعًا بشكل ملحوظ (الشكل 6i) ، لدعم الفكرة القائلة بأن MILs هي منظمات مهمة للجينات البشرية الطويلة. بالإضافة إلى ذلك ، تحمل الجينات الأطول في المتوسط ​​عددًا أكبر من MILs (معلومات تكميلية ، الشكل S10j) ، مما قد يساهم في التغييرات الأقوى للجينات الطويلة بواسطة siSAFB & ampB2. على سبيل المثال ، الإنسان ZRANB3 يبلغ طوله 336 كيلو بايت ، وتم تقليل تعبيره بمقدار

60٪ بعد استنفاد SAFB & ampB2 (الشكل 6 هـ) ، بينما زاد Super-MIL KO التعبير بمقدار

3 أضعاف (الشكل 5 ح). كعناصر تحكم ، استبعدنا أن الضربة القاضية العابرة لـ SAFB & ampB2 قد تؤثر على حالة الكروماتين الكلية التي تسببت بشكل غير مباشر في تغيرات التعبير عن L1 RNAs أو جينات المضيف ، على سبيل المثال ، H3K9me3 ، تعديل هيستون المرتبط غالبًا بقمع heterochromatin و RTE ، لم يتأثر (تكميلي المعلومات ، الشكل S10k).

يؤثر SAFB / B2 و MILs على الجينات الطويلة المشاركة في الوظائف العصبية / المشبكية الحاسمة

هذا الحديث المتبادل المثير للاهتمام بين MILs وعوامل DDR والجينات الطويلة يذكرنا بإثراء / تنظيم الجينات الطويلة الملحوظة في الدماغ ، 38،39 خاصة لأن نشاط DDR 110،111 و L1 7،32،33،37 كان حاسمًا بشكل فريد في هذا الانسجة. ترتبط الجينات الطويلة بوظائف الخلايا العصبية الحيوية وتشارك في NNDs. 38،39،40 ومن ثم استجوبنا الأدوار المحتملة لـ MILs كعناصر تنظيمية غير مقدرة في الدماغ البشري. من خلال تحليل مجموعات بيانات MeRIP-Seq المنشورة في الأنسجة البشرية للجنين ، حددنا عددًا كبيرًا من MILs في كل نسيج ، ومن بينها يحتوي دماغ الجنين على واحد من أكبر (ن = 3339) (الشكل 7 أ). يتم إثراء الجينات المستضيفة لـ MIL في دماغ الجنين للمصطلحات الوظيفية "النظام العصبي" و "إسقاط الخلية" و "تنظيم المشبك" و "الجينات المشبكية" (الشكل 7 ب) ، وعدد كبير منها ضروري للوظائف العصبية والمتشابكة. كأمثلة ، تم إيواء MILs القوية في الجينات العصبية / النمائية العصبية الرئيسية GPHN (جفيرين) ، 113 UBE3Aو 114 و CTNND2 (delta2-catenin) 115 (مثالان معروضان في الشكل 7 ج) ، في الجينات المشبكية مثل DLG2 (ترميز بروتين ما بعد المشبكي - 93) ، 33 في ترميز الجينات لجزيئات الغشاء الحاسمة (CNTNAP4 و CTNNA2) ، 116117 وفي جينات مستقبلات الناقل العصبي الرئيسية مثل مستقبلات GABA من النوع A γ3 (GABRG3) ومستقبلات الجلوتامات AMPA من النوع 4 (GRIA4) (معلومات تكميلية ، الجدول S7). تم إثراء جينات DDR أيضًا كمضيفات MIL في دماغ الجنين ، لكنها لم تكن في مرتبة عالية مثل الجينات العصبية أو المشبكية (غير معروضة). من حيث طول الجين ، تعد الجينات العصبية / المشبكية أطول من المتوسط ​​(الشكل 7 د) ، وهي ميزة معروفة ، لكن الجينات العصبية / المشبكية التي تؤوي MILs طويلة بشكل استثنائي (الشكل 7 د معلومات تكميلية ، الجدول S7) .

أ شريط يوضح أرقام MIL المحددة بواسطة MeRIP-Seq في 8 أنسجة بشرية جنينية (Xiao et al. 112). ب أعلى فئات الجينات الوظيفية التي تستضيف الجينات MIL في دماغ الإنسان للجنين يتم إثرائها ضد الجينات المعبر عنها في دماغ الجنين (RNA-Seq FPKM & gt 0.1) (بواسطة Metascape ، انظر المواد والأساليب). ج لقطات مستعرض الجينوم تظهر مسارات دماغ الجنين RNA-Seq و MeRIP-Seq في مواقع CTNND2 و GPHN. يتم تمييز MILs. د مربع يوضح أطوال أربع مجموعات من الجينات. جميع الجينات ، وجميع جينات RefSeq العصبية ، والجينات المرتبطة بوظائف الخلايا العصبية أو المشبكية ، ومضيفي MIL ، وجينات دماغ الجنين التي تستضيف مضيفي MILs MIL والخلايا العصبية الأمبيرية ، المجموعة المشتركة بين هذين (قوائم الجينات في المعلومات التكميلية ، الجدول S7). ه مخطط مربع يوضح مستويات التعبير عن MILs بعد الاستنفاد المشترك لـ SAFB و SAFB2 مقارنةً بالتحكم (siCTL). تم إنشاء البيانات من polyA RNA-Seq في خلايا NPC البشرية. F مربع يعرض التغييرات التعبير عن DDR التي تستضيف MIL أو الجينات العصبية / المشبكية بعد ضربة قاضية siSAFB و ampB2. ال ذ-المحور يشير إلى السجل2 أضعاف التغييرات على أساس hNPC RNA-Seq. ز مخطط انحدار يوضح العلاقة بين طول الجين وتغير تعبيرها بعد استنفاد SAFB & ampB2 في الشخصيات البشرية غير القابلة للعب ، على غرار الشكل 6i. ح مخطط يظهر الأعداد المرصودة أو المتوقعة من جينات الدماغ التي تستضيف MIL والتي تتداخل مع الجينات المرتبطة بالتوحد في سفاري. تم حساب الرقم المتوقع بناءً على أن جميع الجينات المعبر عنها في hNPCs (ن = 19286) لديهم فرصة أن تكون جينات سفاري ص-قيمة ونسبة الأرجحية: اختبار فيشر الدقيق. أنا مؤامرة الكمان تظهر السجل2 أضعاف التغييرات في جينات استضافة MIL المدرجة في قاعدة بيانات سفاري (المجموعة الحمراء في اللوحة ح) بعد استنفاد SAFB و ampB2. يتم تصنيف أكثر 20 جينًا خاضعًا للتنظيم. ي شكل نموذجي يوضح النتائج الرئيسية لهذا العمل: 1) ، m 6 A على RC-L1s يعزز نشاط النسخ الرجعي لهذه L1s الحية 2) ، m 6 A على MILs الميتة رجعيًا يتوسط أدوارهم في العمل كحواجز طريق نسخية تعيق بشكل تفضيلي الجينات البشرية الطويلة ، والتي تشمل جينات DDR والجينات العصبية / المشبكية 3) ، تمثل قارئات m 6 A-L1 SAFB و SAFB2 نظام دفاع مضيف يربط من ناحية RC-L1s لتثبيط تعبيرها والانتقال الرجعي ، ومن ناحية أخرى تقلل اليد من تعبير MIL لحماية نسخ الجينات البشرية الطويلة 4) ، تمثل MILs فئة كبيرة غير معترف بها من عناصر النسخ الخاصة بنوع الخلية لتنظيم الجينات في الصحة أو الأمراض. تشير الكائنات المستديرة الملونة إلى m 6 A-L1-RBPs التي ترتبط غالبًا بالمصفوفة النووية. تشير الأسهم إلى تنظيم إيجابي أو اتجاه Pol2 ، بينما تشير "---- |" يشير إلى التنظيم السلبي أو القمع. ال ص-قيمة للوحة د حسبت بواسطة مان ويتني يو اختبار ص- القيم في اللوحات ه و F تم حسابها مع الطالب المقترن ر- الاختبارات (siSAFB & ampB2 مقابل siCTL). البيانات الواردة في هذا الرقم من hNPC بعد siSAFB & ampB2 استندت إلى polyA المحدد RNA-Seq.

من المعروف أن الخلايا السلفية العصبية البشرية (hNPCs) تحتوي على نشاط L1 عالي. 118 لتأكيد أدوار MILs / SAFB & ampB2 في خلايا الدماغ ، قمنا بتوليد hNPCs من الخلايا الجذعية البشرية المحفزة (iPSCs) بدرجة نقاء عالية ، كما هو موضح من خلال التعبير عن جينات العلامة نستين, SOX1 و SOX2 في التألق المناعي (معلومات تكميلية ، الشكل S11a). أظهر استنفاد SAFB و ampB2 في hNPCs وظيفتهما المحفوظة للغاية كما وجدنا في الخلايا المحولة الأخرى (الشكل 6). أولاً ، تسبب استنفادهم المشترك بقوة في L1 RNAs ، إلى مستوى أعلى من ذلك بواسطة ضربة قاضية SAFB وحدها (المعلومات التكميلية ، الشكل S11b) وأكدت تحليلات RNA-Seq زيادة عالمية في MILs (الشكل 7 هـ). ثانيًا ، كان تنظيم MILs مصحوبًا بانخفاض كبير في جيناتها المضيفة ، بما في ذلك جينات DDR وفئة كبيرة من الجينات العصبية / المشبكية (الشكل 7f). تم إثراء الجينات التي تم تنظيمها بواسطة ضربة قاضية SAFB و ampB2 (FDR & lt 0.05 بواسطة EdgeR) بشكل كبير للوظائف المتعلقة بتطوير الجهاز العصبي (معلومات تكميلية ، الشكل S11c). ثالثًا ، عندما صنفنا جينات استضافة MIL في NPCs حسب طولها ، كان من الواضح أن الجينات الطويلة ، خاصة تلك & gt100 kb ، تميل بشكل خاص إلى التثبيط (الشكل 7g).

يحتوي دماغ الإنسان أيضًا على عدد لا يحصى من الخلايا غير العصبية التي لا تختلف عن الشخصيات غير القابلة للعب. الخلايا الدبقية الصغيرة هي الضامة المقيمة في الدماغ الحاسمة في التطور والأمراض ، 119120 لكن تعبير L1 ووظيفته في هذا النوع من الخلايا أقل استكشافًا. أجرينا TT-Seq / MINT-Seq في خلايا HMC3 ، وهو نوع من الخلايا الأولية المتحولة من الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية الجنينية ، 121122 والتي حددت 1607 ميلًا (معلومات تكميلية ، الشكل S11d). على عكس الدماغ البشري للجنين ، فإن مصطلحات GO لجينات استضافة MIL في HMC3 تشبه تلك الموجودة في خطوط الخلايا الجسدية الأخرى ، مثل جينات DDR (معلومات تكميلية ، الشكل S11e) ، مما يشير إلى برنامج فريد من MILs في الخلايا من النسب العصبية. باستمرار ، أظهر RT-qPCR أن SAFB قام أيضًا بقمع تعبير L1 RNA في الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية (معلومات تكميلية ، الشكل S11f). أسست هذه النتائج معًا آلية عامة قامت SAFB و ampB2 بقمع MILs في الجينات الطويلة لحماية مخرجاتها النصية ووظائفها الحرجة.

تورط MILs في أمراض النمو العصبي

لوحظ نشاط L1 الشاذ على نطاق واسع في NNDs. 31،34،43 من الجينات المتأثرة بـ MILs / SAFB & ampB2 ، يرتبط عدد كبير بـ NNDs.قمنا بفحص قائمة الجينات التي جمعتها قاعدة بيانات سفاري المتورطة في اضطراب طيف التوحد (ASD) 123 (https://www.sfari.org/resource/sfari-gene/). هناك ارتباط قوي بين الجينات المرتبطة بالتوحد والجينات المضيفة لـ MIL في دماغ الجنين (170 من أصل 861 جينة سفاري هي مضيفات MIL ، اختبار فيشر الدقيق ، ص-القيمة & lt 6.19e − 31 ، الشكل 7 ح). والجدير بالذكر أن جينات SFARI التي تستضيف MILs يتم تنظيمها إلى حد كبير في hNPCs بعد استنفاد SAFB و ampB2 (الشكل 7i ، المعلومات التكميلية ، الشكل S12a) ، بما في ذلك العديد من الجينات المذكورة أعلاه الحاسمة في الوظائف المتشابكة والعصبية (أعلى 20 جينة خاضعة للتنظيم السفلي كما هو موضح في الشكل. . 7i). لم تتأثر جينات SAFRI بدون MILs إلى حد كبير (معلومات تكميلية ، الشكل S12b) ، مما يدعم أن تأثيرات SAFB & ampB2 على الجينات العصبية / المشبكية يتم توسطها على وجه التحديد بواسطة MILs.


نتائج

كانت Sas4p هي الوحدة الفرعية الأساسية الضامة لمجمع SAS-I

يتكون مجمع الخميرة SAS-I من ثلاث وحدات فرعية على الأقل ، كما ورد سابقًا (Meijsing and Ehrenhofer-Murray ، 2001 Osada et al. ، 2001). من أجل التحقيق عن كثب في تفاعلات البروتين البروتين داخل مجمع SAS-I ، استخدمنا عدة فحوصات مختلفة. في اختبار الخميرة ثنائي الهجين ، تفاعل اندماج Sas4 في مجال ربط الحمض النووي Gal4 مع الفرائس Sas2p و Sas5p (الشكل 1 أ) ، ولكن ليس مع المتجه الفارغ. باستخدام Sas5p كطعم في شاشة ثنائية الهجين (Fromont-Racine et al. ، 1997) ، SAS4 تم عزله ست مرات على ثلاث أجزاء متداخلة ، مما حد من منطقة التفاعل مع Sas5p إلى الجزء C- الطرفي (بيانات الأحماض الأمينية 318-381 غير معروضة).

تفاعلات البروتين والبروتين داخل مجمع SAS-I. (أ) تفاعل Sas4p مع Sas2p و Sas5p في النظام ثنائي الهجين كما يتضح من النمو أو عدم نمو سلالة المراسل في غياب الهيستدين. GBD ، Gal4 مجال ربط الحمض النووي (pAS-BC) GAD ، مجال تنشيط Gal4 (pACTIIst) انظر الجدول 2 للحصول على تفاصيل البلازميد. (ب) تحليل ترسيب كويمونوبريشن لـ Sas5p-HA3/ myc6-Sas2p ، Sas4p-myc9/ Sas2p و Sas5p-HA3/ myc6تفاعلات -Sas4p. تم تحليل البروتينات المرتبطة على 12.5 ٪ من المواد الهلامية SDS بولي أكريلاميد ، مناعي ومسحوق بأجسام مضادة α-myc أو α-Sas2. 2Δ ، SAS2Δ 4Δ ، SAS4Δ 5Δ ، SAS5Δ. (C) مقايسة المنسدلة GST لتحديد التفاعلات المباشرة داخل مجمع SAS-I. تم تجميد بروتينات الانصهار المنقى GST-Sas على حبات الجلوتاثيون agarose واحتضانها ببروتينات SAS-I المُترجمة في المختبر (المختصرة 2 و 4 و 5) أو لوسيفيراز (L ، تحكم سلبي). تشير علامة النجمة إلى نواتج تحلل مادة Sas4p ذات العلامات الإشعاعية. تمت إزالة الخرز المغسول باستخدام محلول عينة ، وفصله على 12.5 ٪ من المواد الهلامية SDS بولي أكريلاميد ، وتم تصور العصابات باستخدام PhosphoImager.

تفاعلات البروتين والبروتين داخل مجمع SAS-I. (أ) تفاعل Sas4p مع Sas2p و Sas5p في النظام ثنائي الهجين كما يتضح من النمو أو عدم نمو سلالة المراسل في غياب الهيستدين. GBD ، Gal4 مجال ربط الحمض النووي (pAS-BC) GAD ، مجال تنشيط Gal4 (pACTIIst) انظر الجدول 2 للحصول على تفاصيل البلازميد. (ب) تحليل ترسيب كويمونوبريشن لـ Sas5p-HA3/ myc6-Sas2p ، Sas4p-myc9/ Sas2p و Sas5p-HA3/ myc6تفاعلات -Sas4p. تم تحليل البروتينات المرتبطة على 12.5 ٪ من المواد الهلامية SDS بولي أكريلاميد ، مناعي ومسحوق بأجسام مضادة α-myc أو α-Sas2. 2Δ ، SAS2Δ 4Δ ، SAS4Δ 5Δ ، SAS5Δ. (C) مقايسة المنسدلة GST لتحديد التفاعلات المباشرة داخل مجمع SAS-I. تم تجميد بروتينات الانصهار GST-Sas المنقى على حبات الجلوتاثيون agarose واحتضانها ببروتينات SAS-I المُترجمة في المختبر (المختصرة 2 و 4 و 5) أو لوسيفيراز (L ، تحكم سلبي). تشير علامة النجمة إلى نواتج تحلل مادة Sas4p ذات العلامات الإشعاعية. تمت إزالة الخرز المغسول باستخدام محلول عينة ، وفصله على 12.5 ٪ من المواد الهلامية SDS بولي أكريلاميد ، وتم تصور العصابات باستخدام PhosphoImager.

لم يتم الكشف عن أي تفاعل مباشر بين Sas2p و Sas5p في الاختبار ثنائي الهجين ، مما يشير إلى أن Sas4p كانت وحدة التجسير بين Sas2p و Sas5p. تم تأكيد هذه الملاحظة من خلال فحصين آخرين. حدث ترسيب Coimmunoprecration لـ Sas2p مع Sas5p فقط عندما كان Sas4p موجودًا ، في حين أن حذف Sas5p أو Sas2p لم يكن له أي تأثير على التفاعل بين Sas4p و Sas2p أو Sas5p و Sas4p ، على التوالي (الشكل 1 ب). تم دعم هذه الملاحظة من خلال تنقية TAP لمجمع SAS-I مع مقتطفات محضرة من النوع البري و sas4Δ سلالات تم فيها تمييز SAS5 وراثيًا بعلامات TAP. في مقتطفات من النوع البري ، تمت تنقية Sas2p و Sas4p معًا مع Sas5-TAP على النقيض من ذلك ، لم يتم استرداد Sas2p في غياب Sas4p (البيانات غير معروضة). بالإضافة إلى ذلك ، في اختبار منسدل GST مع وحدات فرعية SAS-I ذات العلامات الإشعاعية المترجمة في المختبر ، لاحظنا تفاعلات مباشرة بين GST-Sas2p و Sas4p المشع ، بين GST-Sas4p وكلاهما Sas2p و Sas5p ، وبين GST-Sas5p و Sas4p (الشكل. 1 ج). يبدو أيضًا أن GST-Sas2p و GST-Sas4p يتفاعلان مع أنفسهم (Sas2p و Sas4p المشع إشعاعًا ، على التوالي) ، ولكن ليس مع عنصر التحكم السلبي (Luciferase ، الشكل 1C). يتفاعل Sas2p مع نفسه في فحوصات ثنائية الهجين (Meijsing و Ehrenhofer-Murray ، 2001) علاوة على ذلك ، لا يمكننا استبعاد احتمال أن يتضاءل Sas4p في ظل ظروف معينة. تم ربط Sas2p أو Sas5p ذي العلامات الإشعاعية الصغيرة بواسطة GST-Sas5 أو GST-Sas2p ، على التوالي. تدعم هذه البيانات معًا فكرة أن Sas4p هي القطعة المتصلة بين Sas2p و Sas5p.

تفاعل Sas2p و Sas5p مع المستوردين Pse1p و Kap123p

استخدمنا شاشة خميرة ثنائية الهجين (Fromont-Racine et al. ، 1997) لتحديد البروتينات التي تتفاعل مع Sas5p. من بين الحيوانات المستنسخة الإيجابية التي تفاعلت مع الطعم Sas5p ، قمنا بعزل ثمانية أضعاف ORF لـ YMR308c ، والذي يتوافق مع PSE1 الجين. حدث تفاعل Sas5p و Pse1p خلال ثلاث شظايا متداخلة للطرف C من Pse1p (الشكل 2 أ). ينتمي Pse1p إلى عائلة مستقبلات النقل النووي المسماة karyopherins (Kaps) أو importins وقد تم الإبلاغ سابقًا عن دعم الاستيراد النووي لعدد من عوامل النسخ (Chook and Blobel ، 2001). Pse1p هو متماثل لـ Kap123p ، ومثل Kap123p ، فهو زائد وظيفيًا في التوسط في الاستيراد النووي لبروتينات الريبوسوم (روت وآخرون ، 1997) ، والبروتينات المرتبطة بالريبوسوم (فرانك وآخرون ، 2001) والهستونات H3 و H4 (Mosammaparast et al. ، 2002 أ). ومن ثم ، فقد كنا مهتمين أيضًا باختبار التفاعل المادي بين مجمع SAS-I و Kap123p.

تفاعل Sas2p و Sas5p مع المستوردين Pse1p و Kap123p. (أ) المجالات في Pse1p. يشير الشريط الأزرق إلى مجال تجانس importin الذي يحتوي على تكرار Armadillo (ARM ، أحمر). يتم توضيح الأجزاء الطرفية C من Pse1p التي تتفاعل مع Sas5p في الاختبار ثنائي الهجين بخطوط سوداء. (ب) تحليل Coimmunopreclusion لـ Sas5p-myc9/ Pse1p-HA3، Sas5p-myc9/ Kap123p-HA3، myc6-Sas2p / Pse1p-HA3 و myc6-Sas2p / Kap123p-HA3 التفاعلات. تم فصل البروتينات المربوطة على 12.5٪ من المواد الهلامية SDS بولي أكريلاميد ، وتم فحصها بواسطة جسم مضاد α-HA. Pse1p-HA3 coimmunoprecipitated مع Sas5p-myc9 أو myc6-Sas2p (اللوحات العلوية) ، و Kap123p-HA3 شارك في الترسيب مع Sas5p-myc9 أو myc6-Sas2p (اللوحات السفلية).

تفاعل Sas2p و Sas5p مع المستوردين Pse1p و Kap123p. (أ) المجالات في Pse1p. يشير الشريط الأزرق إلى مجال تجانس importin الذي يحتوي على تكرار Armadillo (ARM ، أحمر). يتم توضيح الأجزاء الطرفية C من Pse1p التي تتفاعل مع Sas5p في الاختبار ثنائي الهجين بخطوط سوداء. (ب) تحليل Coimmunopreclusion لـ Sas5p-myc9/ Pse1p-HA3، Sas5p-myc9/ Kap123p-HA3، myc6-Sas2p / Pse1p-HA3 و myc6-Sas2p / Kap123p-HA3 التفاعلات. تم فصل البروتينات المربوطة على 12.5٪ من المواد الهلامية SDS بولي أكريلاميد ، وتم فحصها بواسطة جسم مضاد α-HA. Pse1p-HA3 coimmunoprecipitated مع Sas5p-myc9 أو myc6-Sas2p (اللوحات العلوية) و Kap123p-HA3 شارك في الترسيب مع Sas5p-myc9 أو myc6-Sas2p (اللوحات السفلية).

أجرينا تجارب الترسيب المناعي المشترك من أجل التحقق من التفاعل الثنائي الهجين بين Sas5p و Pse1p في الجسم الحي ، ولاختبار تفاعلات Sas2p و Sas5p مع Kap123p أو Pse1p. لهذا الغرض ، تم تمييز الوحدات الفرعية لمجمع SAS-I أو Pse1p أو Kap123p. في مقايسات الترسيب المناعي مع الوحدات الفرعية SAS-I الموسومة بـ myc والمجمدة على الخرز ، والرواسب المشتركة الهامة لـ Pse1p-HA3 و Kap123p-HA3 تم الكشف عنها باستخدام Sas5p-myc9 و myc6-Sas2p ، على التوالي ، ولكن ليس مع myc6-Sas4p (الشكل 2 ب ، والبيانات غير معروضة). بعض الربط غير المحدد لـ Pse1p-HA3 و Kap123p-HA3 إلى الجسم المضاد myc لوحظ أيضًا ، ولكن بدرجة أقل بكثير من الترسيب المناعي المشترك (الشكل 2 ب). تشير هذه الملاحظات إلى أن Sas2p و Sas5p كانا ركائز استيراد محتملة لـ Pse1p و Kap123p.

كانت Pse1p و Kap123p مطلوبة للاستيراد النووي لـ Sas2p و Sas5p

لتحديد دور Pse1p و Kap123p وكاريوفيرينات أخرى محتملة في استيراد Sas2p و Sas5p في الجسم الحي ، تم إنشاء اندماج GFP لبروتينات SAS-I وتم تحليل مواقعها دون الخلوية في الخلايا التي تأوي الطفرات أو الحذف بشكل محدد KAP الجينات. أظهر اندماج GFP لـ Sas2p و Sas4p و Sas5p توطين نووي في الغالب في سلالة من النوع البري تم ترجمة GFP-Sas4p حصريًا في النواة ، بينما عرض Sas2p و Sas5p إشارة GFP إضافية مرتفعة قليلاً في السيتوبلازم (الشكل 3). انخفض التراكم النووي لـ GFP-Sas2p و GFP-Sas5p ، ولكن ليس من GFP-Sas4p ، بشكل واضح في kap123Δ أو pse1-1 الخلايا (الشكل 3). ومن المثير للاهتمام أن هذه التأثيرات كانت مرئية بالفعل في pse1-1 الخلايا عند درجة الحرارة المسموح بها (23 درجة مئوية) ، ولم يكن للتحول نحو درجة الحرارة غير المسموحة أي عواقب أخرى. على النقيض من ذلك ، فإن التوطين النووي لـ GFP-Sas4p في pse1-1 لم تتغير الخلايا حتى في ظل ظروف غير فاعلة (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، لم يتم حظر الاستيراد النووي لـ Sas2p و Sas5p تمامًا في pse1-1 و kap123Δ سلالات ، حيث لا تزال بعض إشارات GFP-Sas2p و GFP-Sas5p النووية في هذه كاب المسوخ. بالاتفاق مع هذا ، pse1-7 و kap123Δ لم تظهر سلالات واحدة من ساس إسكات الأنماط الظاهرية (البيانات غير معروضة) ، قمع HMR عيب إسكات (Ehrenhofer-Murray ، 1997). كنا pse1-7 في هذا الاختبار ، لأنه يتقاطع مع pse1-1 متحولة أظهرت جدوى بوغ سيئة للغاية ، مثل ذلك pse1-1 لم يكن من الممكن إدارتها في هذه الاختبارات الجينية (البيانات غير معروضة). لم يكن غياب النمط الظاهري الصامت مفاجئًا ، نظرًا لأن Pse1p و Kap123p لهما وظائف متداخلة ويمكن لأحدهما أن يحل محل الآخر. بدلاً من ذلك ، قد تتولى عمليات الاستيراد الأخرى الوظيفة عند تعطل مسارات استيراد Pse1p و Kap123p. بالإضافة إلى ذلك ، أنشأنا pse1-1sas4Δ و kap123Δsas4Δ سلالات متحولة مزدوجة ، قمنا فيها بتحليل توطين الخلايا الفرعية لـ GFP-Sas2p و GFP-Sas5p. لم نكتشف فرقًا كبيرًا في توطين Sas2p و Sas5p في سلالات الطفرات المزدوجة عند مقارنتها بتلك الخاصة بكل منهما pse1-1 أو kap123Δ متحولة واحدة (البيانات غير معروضة).

انخفض التراكم النووي لـ GFP-Sas2p و GFP-Sas5p بشكل كبير بواسطة kap123Δ أو pse1-1. تم التعبير عن GFP-Sas2p (pAE1098) أو GFP-Sas4p (pAE1101) أو GFP-Sas5p (pAE1106) في النوع البري (WT) و كاب سلالات متحولة (انظر الجدولين 1 و 2) ، وتم الكشف عن علامة GFP بواسطة الفحص المجهري مضان. يصور تلطيخ Hoechst النواة. قضبان ، 5 ميكرومتر.

انخفض التراكم النووي لـ GFP-Sas2p و GFP-Sas5p بشكل كبير بواسطة kap123Δ أو pse1-1. تم التعبير عن GFP-Sas2p (pAE1098) أو GFP-Sas4p (pAE1101) أو GFP-Sas5p (pAE1106) في النوع البري (WT) و كاب سلالات متحولة (انظر الجدولين 1 و 2) ، وتم الكشف عن علامة GFP بواسطة الفحص المجهري مضان. يصور تلطيخ Hoechst النواة. قضبان ، 5 ميكرومتر.

من أجل اختبار ما إذا كان الاستيراد النووي لـ Sas2p و Sas5p قد تم بوساطة Kap123p و Pse1p على وجه التحديد ، قمنا بدراسة التوطين الخلوي لبروتينات SAS-I في أنواع أخرى مختلفة. كاب المسوخ. خمس عمليات حذف أخرى من KAP الجينات KAP108 / SXM1 ، KAP114 ، KAP119 ، KAP122 / PDR6 و KAP142 / MSN5، كانت تحت تصرفنا. لم نجد انخفاضًا كبيرًا في التراكم النووي لـ GFP-Sas2p و GFP-Sas4p و GFP-Sas5p في الخلايا التي تفتقر إلى Kap108p أو Kap114p أو Kap122p أو Kap142p (الشكل 4). مجتمعة ، أظهرت هذه النتائج أن مستقبلات النقل Kap123p و Pse1p كانت مطلوبة للاستيراد النووي لـ Sas2p و Sas5p ، ولكن ليس Sas4p ، في حين أن الكاريوفرينات الأخرى التي تم اختبارها لم تشارك في النقل.

تم إعاقة التوطين النووي لـ GFP-Sas2p و GFP-Sas5p في kap123Δ ، ولكن ليس في كاب 108Δ ، كاب 119Δ ، kap122Δ و kap142Δ سلالات. تم اكتشاف GFP-Sas2p أو GFP-Sas4p أو GFP-Sas5p (انظر الجدول 2) في النوع البري (WT) و كاب سلالات الحذف (كما هو محدد) عن طريق الفحص المجهري الفلوري. بار ، 5 ميكرومتر.

تم إعاقة التوطين النووي لـ GFP-Sas2p و GFP-Sas5p في kap123Δ ، ولكن ليس في كاب 108Δ ، كاب 119Δ ، kap122Δ و kap142Δ سلالات. تم اكتشاف GFP-Sas2p أو GFP-Sas4p أو GFP-Sas5p (انظر الجدول 2) في النوع البري (WT) و كاب سلالات الحذف (كما هو محدد) عن طريق الفحص المجهري الفلوري. بار ، 5 ميكرومتر.

تحديد إشارات التعريب النووي المحتملة داخل مجمع SAS-I

من أجل تحديد NLS المفترضة في الوحدات الفرعية الثلاثة SAS-I ، قمنا بتحليل تسلسل الأحماض الأمينية (aa) لـ Sas2p و Sas4p و Sas5p باستخدام برنامج مسح أنماط بروزيت / ملفات التعريف (Falquet et al. ، 2002). تم توقع NLSs ثنائية الأجزاء لـ Sas2p (aa 19-36) و Sas4p (aa 336-353 ، الشكل 5A) ، بينما لم يتم اقتراح مثل هذا التسلسل لـ Sas5p. بالإضافة إلى ذلك ، كشف مسح عزر Prosite عن منطقة تماثل cullin لـ Sas4p (aa 91-275 ، الشكل 5A) ، وهو نموذج موجود كثيرًا في البروتينات المشاركة في انتقالات دورة الخلية. عرض تحليل التسلسل باستخدام SMART ، وهي أداة ويب (http://smart.embl.de/) لتحديد مجالات البروتين (Letunic et al. ، 2004) ، مجال Sas2p هيستون أسيتيل ترانسفيراز (HAT) المعروف لعائلة MYST (أأ 126-314 ، الشكل 5 أ). يسبق إصبع الزنك مجال HAT ويتوسط تفاعل Sas2p مع Sas4p (Meijsing and Ehrenhofer-Murray ، 2001). كشف تحليل SMART لـ Sas5p عن منطقة مشتركة لعائلة البروتينات YEATS ، والتي تشمل Y NK7 و E NL و A F-9 و T FIIF (وحدة فرعية صغيرة) المتورطة في تحفيز النسخ (aa 6-114 ، الشكل 5A) ).

تحليل حذف Sas2p و Sas4p و Sas5p وتوطينها الخلوي. (أ) المجالات المتوقعة والزخارف وإشارات التوطين النووي (NLS) لـ Sas2p و Sas4p و Sas5p. تم العثور على المجالات / الأشكال المشار إليها من خلال تحليل التسلسل باستخدام مسح الزخارف Prosite وبرنامج البحث عن مجال SMART. يتم تصوير NLS على أنها مثلثات خضراء ، وتشير علامة النجمة إلى أنه لا يمكن التحقق من NLS بشكل تجريبي. في Sas2p ، يظهر مجال هيستون أسيتيل ترانسفيراز (HAT) (أحمر) ، مسبوقًا بعنصر إصبع الزنك (أصفر). تم العثور على مجال تماثل cullin (البرتقالي) في Sas4p. يحتوي Sas5p على تماثل متسلسل لعائلة البروتينات YEATS (مسدس أزرق). (ب) كانت المجالات N-terminal في Sas2p و Sas5p ضرورية لتراكمها النووي. تم التعبير عن الطول الكامل أو شظايا Sas2p و Sas4p و Sas5p (pAE1098-pAE1108 ، الجدول 2) على أنها اندماج في GFP في خلايا الخميرة من النوع البري وتم تصورها بواسطة الفحص المجهري الفلوري. يشار إلى نقطة البداية والنهاية لكل اندماج بواسطة الأحماض الأمينية المقابلة لها على يسار كل صورة. بار ، 5 ميكرومتر.

تحليل حذف Sas2p و Sas4p و Sas5p وتوطينها الخلوي. (أ) المجالات المتوقعة والزخارف وإشارات التوطين النووي (NLS) لـ Sas2p و Sas4p و Sas5p. تم العثور على المجالات / الأشكال المشار إليها من خلال تحليل التسلسل باستخدام مسح عزر Prosite وبرنامج البحث عن مجال SMART. يتم تصوير NLS على أنها مثلثات خضراء ، وتشير علامة النجمة إلى أنه لا يمكن التحقق من NLS بشكل تجريبي. في Sas2p ، يظهر مجال هيستون أسيتيل ترانسفيراز (HAT) (أحمر) ، مسبوقًا بإصبع الزنك (أصفر). تم العثور على مجال homology cullin (البرتقالي) في Sas4p. يحتوي Sas5p على تماثل متسلسل لعائلة البروتينات YEATS (مسدس أزرق). (ب) كانت المجالات N-terminal في Sas2p و Sas5p ضرورية لتراكمها النووي. تم التعبير عن الطول الكامل أو شظايا Sas2p و Sas4p و Sas5p (pAE1098-pAE1108 ، الجدول 2) على أنها اندماج في GFP في خلايا الخميرة من النوع البري وتم تصورها بواسطة الفحص المجهري الفلوري. تتم الإشارة إلى نقطة البداية والنهاية لكل اندماج بواسطة الأحماض الأمينية المقابلة لها على يسار كل صورة. بار ، 5 ميكرومتر.

تم إنشاء العديد من طفرات الحذف لبروتينات SAS-I لاختبار أي أجزاء من البروتينات ضرورية للتراكم النووي وما إذا كانت NLS المقترحة أصلية أم لا (الشكل 5). انخفض التراكم النووي بشكل كبير في عمليات حذف منطقة N- طرفية كبيرة من Sas2p (aa 1-146) وكذلك منطقة أصغر ، وكلاهما يشمل NLS المفترض (الشكل 5 ب) ، مما يشير إلى أن Sas2p (aa 1-48) يحتوي بالفعل على NLS. لم يكن لعمليات حذف N-terminal المختلفة لـ Sas4p أي تأثير على التوطين النووي ، ولا حتى حذف يغطي الطرف N بأكمله بما في ذلك منطقة التماثل cullin (أأ 1-287 ، الشكل 5 ب). لم يكن لحذف المحطة C-aa 328-481 أي تأثير على الإشارة النووية لـ Sas4p ، على الرغم من أن NLS ثنائي الأجزاء (aa 336-353) يقع ضمن هذا الحذف. فقط الجزء C المتبقي من Sas4p (aa 377-481) لم يتم ترجمته حصريًا إلى النواة ، على الرغم من أنه لا يمكن استبعاد أن هذا الاندماج لم يعد محتفظًا به في النواة بسبب الانتشار الخلفي نظرًا لصغر حجمه. معًا ، كان من المفترض أن تقع منطقة Sas4p المسؤولة عن التراكم النووي داخل aa 288-327 (الشكل 5 ب). أخيرًا ، لم يؤد حذف النصف C-terminal من Sas5p (aa 124-248) إلى تقليل الإشارة النووية للانصهار GFP-Sas5p بشكل كبير ، في حين أن حذف النصف N-terminal (aa 1-123) قلل بشكل كبير من الطاقة النووية. التراكم (الشكل 5 ب) ، مشيرًا إلى تسلسل إشارة غير محدد بعد للاستيراد النووي في الطرف N لـ Sas5p.

دفعتنا حقيقة احتواء Sas2p على NLS ثنائي الأجزاء من النوع "الكلاسيكي" إلى اختبار اندماج GFP-Sas من أجل التوطين النووي في كاب 60 أليلات حساسة لدرجة الحرارة srp1-31 و srp1-49. ومع ذلك ، لم ينخفض ​​التراكم النووي لـ GFP-Sas2p و GFP-Sas4p و GFP-Sas5p في srp1-31 أو srp1-49 المسوخات ، ولا حتى في درجات الحرارة غير المسموح بها (البيانات غير معروضة) ، مما يشير إلى أن مستقبلات الاستيراد Kap95p / Kap60p لم تكن مطلوبة لاستيراد SAS-I.

ومن المثير للاهتمام ، أن مراسلي GFP-Sas الثلاثة عرضوا توطينًا نوويًا حتى عندما تم حذف الوحدات الفرعية الأخرى لـ SAS-I ، على سبيل المثال ، ظل GFP-Sas4p نوويًا في غياب SAS2 أو SAS5 أو كليهما (البيانات غير معروضة) ، مما يشير إلى أنه تم استيراد الوحدات الفرعية بشكل مستقل عن بعضها البعض.

شارك Sas5p في مجمعات بروتينية ذات وزن جزيئي مختلف في pse1-1 والخلايا البرية

أجرينا تجارب تجزئة الحجم لإجمالي ليسات البروتين من pse1-1 وسلالة من النوع البري متساوي المنشأ ، والتي تم تحويلها سابقًا باستخدام pRS426-HA-Sas5 (pAE625 ، انظر الجدول 2) وتم تربيتها في درجة حرارة متساهلة (24 درجة مئوية). كشف تحليل كسور الترشيح الهلامي من كلا التجربتين أن ملفي شطف HA-Sas5p اختلفا بطريقتين: أولاً ، pse1-1 احتوى ملف التصفية على ذروة جديدة لـ Sas5p (الكسور 67-75) ، تتوافق مع بروتينات ذات وزن جزيئي أقل بشكل ملحوظ وتفتقر إلى المظهر الجانبي من النوع البري ، بينما كانت الكسور المقابلة لمجمع SAS-I (الكسور 57-65) متشابهة إلى النوع البري (الشكل 6). ثانيًا ، تم العثور أيضًا على جزء صغير من Sas5p في الكسور ذات الكتلة الجزيئية الأعلى للمظهر الجانبي من النوع البري (الكسور 37-43) ، مما يشير إلى أن Sas5p كان أيضًا أحد مكونات مجمعات البروتين الأكبر في المستخلصات البرية ، ولكن ليس في pse1-1 متحولة (الشكل 6). ومن المثير للاهتمام ، أنه تم الإبلاغ سابقًا عن أن Sas5p جزء من مجمعات بروتينية أكبر (Meijsing and Ehrenhofer-Murray ، 2001). إن طبيعة هذا الوزن الجزيئي الأعلى غير معروفة ، ولكن ستظهر المزيد من التحقيقات ما إذا كان تكوينها يعتمد على الاستيراد النووي لـ Sas5p.

حجم التجزئة من النوع البري و pse1-1 مستخلصات بروتينية محضرة من الخلايا (AEY2956 أو AEY2957) المزروعة عند 24 درجة مئوية معبرة عن HA-Sas5p (pAE625). تم تحليل ملامح شطف HA-Sas5p بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام على 12.5 ٪ من المواد الهلامية SDS بولي أكريلاميد والتكتل المناعي للكسور المشار إليها باستخدام جسم مضاد لـ HA. تم تسمية قمم شطف بروتينات العلامة أعلاه.

حجم التجزئة من النوع البري و pse1-1 مستخلصات بروتينية محضرة من الخلايا (AEY2956 أو AEY2957) المزروعة عند 24 درجة مئوية معبرة عن HA-Sas5p (pAE625). تم تحليل ملامح شطف HA-Sas5p بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام على 12.5 ٪ من المواد الهلامية SDS بولي أكريلاميد والتكتل المناعي للكسور المشار إليها باستخدام جسم مضاد لـ HA. تم تسمية قمم شطف بروتينات العلامة أعلاه.

أظهر Sas2p NLS المفترض تشابهًا مع تلك الموجودة في هيستون H3 و H4

تم الإبلاغ مؤخرًا عن أن بروتينين نوويين آخرين هما ركائز من مسارات استيراد Kap123p و Pse1p ، الهيستونات H3 و H4 (Mosammaparast et al. ، 2002a). يحتوي كل من H3 و H4 على NLS في نطاقات N-terminal الخاصة بهما ، وقد تم ترجمة الحد الأدنى من NLS لـ H3 إلى المخلفات 1-28 ، بينما اقتصر H4 على المخلفات 1-21 (Mosammaparast et al. ، 2002a). على الرغم من أن هذا H4 (1-21) -GFP2 لم يظهر الاندماج نوويًا بالكامل ، كان من السهل اكتشاف إشارته النووية فوق الخلفية السيتوبلازمية. لقد أنشأنا محاذاة الحد الأدنى من NLS مع NLS المقترح لـ Sas2p ووجدنا اتفاقًا كبيرًا بين هذه التسلسلات. تم حفظ 10 من أصل 22 من البقايا المتوافقة بدرجة عالية في البروتينات الثلاثة (الشكل 7). دفعنا هذا التوافق إلى البحث عن بروتينات تحتوي على توافق في الآراء بشأن NLS استنادًا إلى محاذاةنا التي يمكن أن تكون بمثابة تسلسل إشارة محتمل لمسارات الاستيراد النووي Kap123p و Pse1p. باستخدام أداة BLASTP (Altschul et al. ، 1997) وكل من NLS المحاذاة كاستعلام إدخال ، حددنا ثلاثة بروتينات نووية أخرى ذات تطابق كبير مع إجماع NLS: هيستون H1 ، Snf12p / Swp73p ، وحدة فرعية من SWI / معقد إعادة تشكيل كروماتين SNF ، ومتغير هيستون H2A Htz1p ، هذا الأخير لديه أفضل اتفاق على تسلسل الإجماع (الشكل 7). بشكل ملحوظ ، توجد جميع NLS المتوافقة في نهايات N-الطرفية لهذه البروتينات. يثير وجود تسلسل إجماع مشابه في Snf12p و histones H1 و Htz1p السؤال عما إذا كانت هذه البروتينات النووية قد تشكل ركائز استيراد إضافية لـ Kap123p أو Pse1p. ومع ذلك ، فإن Sas5p (هذه الدراسة) ، وعدد من بروتينات الريبوسوم (Pemberton et al. ، 1998) والبروتينات المرتبطة بالريبوسوم (Franke et al. ، 2001) هي أيضًا ركائز لمسارات الاستيراد هذه ولا تعرض أي تماثل تسلسلي مع هذا الإجماع. NLS.

محاذاة NLSs المقترحة لـ Sas2p والهيستونات H3 و H4. تم العثور على Histone H1 و Snf12p ومتغير هيستون Htz1p بواسطة استعلامات BLAST P باستخدام NLSs لـ Sas2p و Histones H3 و H4 ، على التوالي ، وأظهرت تشابهًا كبيرًا مع تسلسل الإجماع.

محاذاة NLSs المقترحة لـ Sas2p والهيستونات H3 و H4. تم العثور على Histone H1 و Snf12p ومتغير هيستون Htz1p بواسطة استعلامات BLAST P باستخدام NLSs لـ Sas2p و Histones H3 و H4 ، على التوالي ، وأظهرت تشابهًا كبيرًا مع تسلسل الإجماع.


بروتوكول تعداء العامة

تحضير الخلايا للترنسفكأيشن

إزالة الخلايا الملتصقة باستخدام التربسين

إن عملية تريبسين الخلايا قبل الزراعة الفرعية أو عد الخلايا هي تقنية مهمة لنجاح زراعة الخلايا. تعمل التقنية التالية بشكل جيد باستمرار عند مرور الخلايا.

المواد المطلوبة:

  • 1X محلول التربسين-يدتا
  • 1X PBS أو 1X HBSS
  • الخلايا الملتصقة المراد تربيتها
  • وسط نمو مناسب (على سبيل المثال ، DMEM) مع مصل أو عوامل النمو أو كلاهما مضاف
  • أطباق المزرعة ، أو قوارير أو أطباق متعددة ، حسب الحاجة
  • هيموسيتوميتير
  1. تحضير محلول معقم التربسين- EDTA في محلول ملح خالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم مثل 1X PBS أو 1X HBSS. يمكن تجميد محلول 1X وإذابته للاستخدام المستقبلي ، لكن نشاط التربسين سينخفض ​​مع كل دورة تجميد-ذوبان. يمكن تخزين محلول trypsin-EDTA لمدة تصل إلى شهر واحد عند 4 درجة مئوية.
  2. إزالة الوسط من طبق زراعة الأنسجة. أضف ما يكفي من PBS أو HBSS لتغطية الخلية أحادية الطبقة: 2 مل لقارورة 150 مم ، 1 مل للوحة مقاس 100 مم. هز الألواح لتوزيع المحلول بالتساوي. قم بإزالة وتكرار الغسل. قم بإزالة الغسل النهائي. إضافة ما يكفي من محلول التربسين لتغطية الخلية أحادية الطبقة.
  3. ضع الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية حتى تبدأ الخلايا في الانفصال (عادة 1 و ndash2 دقيقة).
  4. قم بإزالة القارورة من الحاضنة. اضرب قاع وجوانب وعاء الاستنبات بحدة براحة يدك للمساعدة في إزاحة الخلايا الملتصقة المتبقية. اعرض الخلايا تحت المجهر للتحقق مما إذا كانت جميع الخلايا قد انفصلت عن سطح النمو. إذا لزم الأمر ، قد يتم إرجاع الخلايا إلى الحاضنة لمدة 1 & ndash2 دقيقة إضافية.
  5. عندما تنفصل جميع الخلايا ، أضف وسطًا يحتوي على مصل إلى الخلايا لتعطيل التربسين. بلطف بيبيت الخلايا لتفتيت كتل الخلايا. يمكن عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيتومتر ، وتوزيعه على أطباق جديدة للتربية الفرعية ، أو كليهما.

عادة ، يتم زراعة الخلايا الفرعية للتحضير لترنسفكأيشن في اليوم التالي. يجب أن تجلب الثقافة الفرعية الخلايا ذات الأهمية إلى الالتقاء المطلوب للترنسفكأيشن. كمبدأ توجيهي عام ، اللوحة 5 × 10 خلايا لكل بئر في لوحة 24 بئر أو 5.5 × 10 خلية لطبق 60 مم للزراعة

80٪ التقاء في يوم تعداء. قم بتغيير أرقام الخلايا بشكل متناسب للوحات ذات أحجام مختلفة (انظر الجدول 3).

الجدول 3. مجال لوحات الثقافة لنمو الخلية.

حجم الطبق منطقة النمو أ (سم & sup2) المنطقة النسبية ب
24 جيدا 1.88 1X
96 جيد 0.32 0.2X
12 جيدا 3.83 2X
6 جيدا 9.4 5X
35 ملم 8.0 4.2X
60 ملم 21 11X
100 ملم 55 29X

(أ) تم حساب هذه المعلومات لأطباق ثقافة Corning & reg.
ب يتم التعبير عن المنطقة النسبية كعامل في إجمالي مساحة النمو للوحة المكونة من 24 بئرًا الموصى بها لدراسات التحسين. لتحديد كثافة الطلاء المناسبة ، اضرب 5 × 10 خلايا بهذا العامل.

تحضير الحمض النووي لترنسفكأيشن

الحمض النووي عالي الجودة الخالي من نوكليازات ، RNA والمواد الكيميائية مهم لنجاح تعداء مثل كاشف تعداء المختار. راجع فصل البروتوكولات والتطبيقات حول تنقية الحمض النووي للحصول على معلومات حول تنقية الحمض النووي لجودة تعداء.

بروتوكول مثال باستخدام ViaFect & trade Reagent

نوصي بشدة بتحسين ظروف تعداء كل خلية. إذا كنت قد قمت بتحسين معايير تعداء الجسم ، فاستخدم الشروط المحددة تجريبياً لعمليات التحويل التجريبية الخاصة بك.

إذا اخترت عدم تحسين معلمات تعداء العدوى ، فاستخدم الشروط العامة الموصى بها أدناه.

المواد المطلوبة:

  • وسط زراعة الخلايا مع مصل مناسب لنوع الخلية التي يتم نقلها
  • وسط زراعة الخلايا الخالية من المصل للتكوين المعقد (مثل Opti-MEM & reg I وسيط مصل مخفض)
  • 96 بئر أو لوحات ثقافة أخرى
  • ألواح تخفيف قاع U أو V أو أنابيب الطرد المركزي الدقيقة

الحجم الإجمالي لمركب تعداء العدوى (متوسط ​​، DNA و ViaFect & Trade Transfection Reagent) لإضافة كل بئر من لوحة 96-بئراً هو 5 & ndash10 & mul. البروتوكول التالي هو دليل إرشادي ل transfecting ما يقرب من 10 & ndash20 آبار ، اعتمادا على حجم ViaFect & trade Transfection كاشف: خليط الحمض النووي المستخدم. بالنسبة للآبار الإضافية ، قم بقياس الأحجام وفقًا لذلك.

  1. إلى أنبوب معقم أو صفيحة سفلية على شكل حرف U أو V ، أضف 90 & ndash99 & mul من الوسط الخالي من المصل المدفأ مسبقًا إلى درجة حرارة الغرفة بحيث يكون الحجم النهائي بعد إضافة الحمض النووي 100 & مول. أضف 1 & mug من DNA البلازميد إلى الوسط ، واخلطه. للحصول على 3: 1 ViaFect & trade Transfection Reagent: نسبة الحمض النووي ، أضف 3 & mul من ViaFect & Trade Transfection Reagent ، واخلط على الفور.
  2. احتضان ViaFect & trade Transfection Reagent: DNA خليط لمدة 5 & ndash20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    اختياري: أضف الخليط إلى الخلايا بدون فترة حضانة.
    ملحوظة: الحضانات الأطول قد تؤثر سلبًا على العدوى.
  3. أضف 5 & ndash10 & mul من ViaFect & trade Transfection Reagent: خليط DNA لكل بئر إلى لوحة 96 بئر تحتوي على 100 & مول من الخلايا في وسط النمو. نقترح 10 & مول من الخليط كنقطة انطلاق. تخلط بلطف عن طريق الماصات أو باستخدام شاكر لوحة لمدة 10 و ndash30 ثانية. إعادة الخلايا إلى الحاضنة لمدة 24 & ndash48 ساعة.
    ملحوظة: قد يختلف إجمالي حجم متوسط ​​النمو اعتمادًا على شكل البئر والممارسات الشائعة في المختبر و rsquos.
  4. قياس كفاءة تعداء باستخدام مقايسة مناسبة للجين المراسل. بالنسبة لترنسفكأيشن العابرة ، عادة ما يتم فحص الخلايا بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن.

تحسين تعداء مع الكواشف الدهنية

في الأقسام السابقة ، ناقشنا العوامل التي تؤثر على نجاح تعداء. نقدم هنا طريقة لتحسين تعداء خط خلية معين باستخدام كاشف تعداء واحد. لمزيد من الكواشف الدهنية الحديثة مثل ViaFect & trade Transfection Reagent ، نوصي باختبار 50 & ndash100ng مبدئيًا لكل بئر من لوحة 96 بئراً عند الكاشف: نسب الحمض النووي 3: 1 أو 4: 1 لخطوط الخلايا الملتصقة أو 2: 1 لخطوط خلايا التعليق. يوضح الشكل 4 مصفوفة تحسين نموذجية. عند تحضير كاشف تعداء العدوى والتجارة ViaFect: مجمع DNA ، قد يتطلب وقت الحضانة التحسين ، نوصي بـ 5 & ndash20 دقيقة.

الشكل 4. تحسين تعداء الجسم باستخدام كاشف تعداء التجارة ViaFect. تم طلاء خلايا TF-1 في وسط نمو بدون مضادات حيوية عند 30000 خلية لكل بئر في لوحة فحص بيضاء بها 96 بئر وتم نقلها باستخدام CMV-لوس 2 البلازميد باستخدام الدهون المختلفة (ViaFect & Trade Transfection Reagent): نسب الحمض النووي. ظل تركيز الحمض النووي ثابتًا عند 1 & mug لكل 100 & mul من وسط مصل Opti-MEM & reg I ، وتفاوتت كمية ViaFect & trade Transfection Reagent للحصول على النسب المشار إليها. ثم تمت إضافة 5 أو 10 & مول من مجمع تعداء إلى الخلايا في لوحة 96-جيدا. بعد أربع وعشرين ساعة من ترنسفكأيشن ، تم إجراء فحص ONE-Glo & trade + Tox Luciferase. لاحظ أن 0: 1 هو عنصر التحكم السلبي بالحمض النووي ولكن لا يحتوي على دهون. تظهر هذه النتائج ، بالنسبة لهذا الخط الخلوي المعين ، 2: 1 ViaFect & Trade Transfection Reagent: نسبة الحمض النووي أعطت أفضل النتائج.

بالنسبة للكواشف الدهنية الكاتيونية التقليدية ، نوصي باختبار كميات مختلفة من الحمض النووي المنقولة (0.25 ، 0.5 ، 0.75 و 1 ميكروغرام لكل بئر في لوحة 24 بئر) عند نسبتي شحن من كاشف الدهون إلى الحمض النووي (2: 1 و 4: 1 انظر الشكل 5). يمكن إجراء هذا التحسين الموجز باستخدام فترة تعداء من 1 ساعة في ظل ظروف خالية من المصل. مطلوب لوحة ثقافة واحدة 24 بئر لكل كاشف من أجل التحسين المختصر مع الخلايا الملتصقة (ثلاثة مكررات لكل كمية DNA).

الشكل 5. شكل الطلاء المقترح للتحسين الأولي لظروف تعداء الدهون الموجبة.

يمكن إجراء تحسين أكثر شمولاً لفحص نسب الشحن الإضافية والنقاط الزمنية وتأثيرات الوسيط المحتوي على المصل بكميات الحمض النووي التي تم العثور عليها على أنها مثالية أثناء دراسات التحسين الأولية. تعد ساعة واحدة أو ساعتين للفاصل الزمني تعد الأمثل للعديد من خطوط الخلايا. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، قد يكون من الضروري اختبار نسب الشحن وفترات تعداء خارج هذه النطاقات لتحقيق النقل الجيني الأمثل.

تتطلب بعض طرق تعداء العدوى إزالة الوسط باستخدام كاشف بعد الحضانة ، والبعض الآخر لا يتطلب ذلك. اقرأ الأدبيات الفنية المصاحبة لكاشف تعداء العدوى المختار لتتعرف على الطريقة المناسبة لنظامك. ومع ذلك ، إذا كان هناك موت خلايا مفرط أثناء تعداء ، ففكر في تقليل وقت التعرض لكاشف تعداء ، وتقليل كميات الحمض النووي والكاشف المضاف إلى الخلايا ، وطلاء الخلايا الإضافية وإزالة الكاشف بعد فترة الحضانة وإضافة وسيط كامل.

فحوصات نقطة النهاية

تستخدم العديد من فحوصات التعبير العابر فحوصات مراسل ليتي مثل نظام الفحص المزدوج Luciferase & reg (Cat. # E1910) ونظام مقايسة Bright-Glo & trade (Cat. # E2610) بعد 24 ساعة من تعداء العدوى. يسمح نظام الفحص المراسل Nano-Glo & reg Dual-Luciferase & reg (Cat. # N1610) بالكشف في غضون ساعات قليلة بعد تعداء العدوى. ومع ذلك ، يمكن أن يختلف الإطار الزمني لمعظم المقايسات (24 & ndash 72 ساعة بعد تعداء الدم) ، اعتمادًا على مستويات التعبير البروتيني. تستخدم فحوصات مراسل البروتين طرق قياس الألوان أو المشعة أو الإنارة لقياس نشاط الإنزيم الموجود في محللة الخلية. تتطلب بعض المقايسات (على سبيل المثال ، نظام اختبار Luciferase) أن يتم فصل الخلايا في مخزن مؤقت بعد إزالة الوسيط ، ثم خلطها مع كاشف فحص منفصل لتحديد نشاط لوسيفيراز. البعض الآخر عبارة عن فحوصات متجانسة (على سبيل المثال ، Bright-Glo & trade Assay System) التي تتضمن كاشف التحلل وكاشف الفحص في نفس المحلول ويمكن إضافتها مباشرة إلى الخلايا في الوسط. افحص نتائج اختبار المراسل وحدد مكان حدوث أكبر تعبير (أعلى قراءة). هذه هي الشروط لاستخدامها مع التركيبات التي تهمك.

تشمل طرق الكشف البديلة تلطيخ الخلايا الكيميائية النسيجية (تحديد النسبة المئوية للخلايا الملطخة في وجود ركيزة الجين المراسل الشكل 6) ، أو الفحص المجهري الفلوري (الشكل 7) أو فرز الخلايا في حالة استخدام مراسل فلوري مثل Monster Green & fluorescent Protein phMGFP فيكتور (Cat. # E6421).

الشكل 6. تلطيخ النسيج الكيميائي لخلايا RAW 264.7 لـ & نشاط بيتا جالاكتوزيداز. تم نقل خلايا RAW 264.7 باستخدام 0.1 و microg DNA لكل بئر ونسبة 3: 1 من FuGENE & reg HD إلى DNA. تم تشكيل المجمعات لمدة 5 دقائق قبل تطبيق 5 ومايكرول من الخليط المعقد على 50000 خلية / بئر في لوحة 96 بئر. أربع وعشرون ساعة بعد ترنسفكأيشن ، تم تلوين الخلايا ونشاط بيتا جالاكتوزيداز باستخدام X-gal. البيانات مقدمة من Fugent، LLC.

الشكل 7. الفحص المجهري الإسفار للخلايا المنقولة باستخدام كاشف تعداء التجارة ViaFect. تم نقل خلايا الأنسجة البشرية iCell & reg في 96 طبقًا جيدًا باستخدام كاشف ترنسفكأيشن والتجارة عبر ViaFect وبلازميد مراسل GFP في الكاشف المحدد: تم تصوير نسبة الحمض النووي وتعبير GFP بعد تعداء العدوى. اللوحة أ. خلايا الكبد iCell & reg مع كاشف 6: 1: تم تصوير نسبة الحمض النووي بعد يوم واحد من تعداء العدوى. اللوحة B. iCell & reg Cardiomyocytes بكاشف 2: 1: نسبة الحمض النووي المصورة بعد يوم واحد من تعداء. لوحة C. iCell & reg DopaNeurons مع كاشف 4: 1: نسبة الحمض النووي المصورة بعد ثلاثة أيام من تعداء. البيانات مقدمة من Cellular Dynamics International.

فحوصات الوقت الحقيقي

بالنسبة لبعض أنواع تجارب تعداء العدوى ، وخاصة تلك التي تدرس التغيرات في مستويات التعبير الجيني المرتبطة بالآليات المرضية ، فمن المستحسن مراقبة نشاط المراسل في الخلايا الحية. يمكن أن توفر مثل هذه الاختبارات في الوقت الحقيقي معلومات قيمة عن التعبير عن جينات متعددة بطريقة ديناميكية. تم تصميم خيارات اكتشاف الخلايا الحية Nano-Glo & reg (Cat. # N2011) لاكتشاف اللمعان NanoLuc & reg من الخلايا الحية باستخدام بروتوكولات nonlytic. تراقب هذه الاختبارات التلألؤ في نقطة زمنية واحدة أو بشكل مستمر لمدة تصل إلى 72 ساعة دون المساس بقدرة الخلية على البقاء.


المواد والأساليب

يبني FUS

تم الحصول على تسلسل FUS و altFUS من خدمة Bio Basic Gene Synthesis. تم استنساخ جميع تركيبات FUS في pcDNA3.1- (Invitrogen) باستخدام مجموعة Gibson (New England Biolabs ، E26115). تتوافق تسلسلات النوع البري FUS و altFUS مع تلك الخاصة بنسخة FUS الأساسية البشرية (ENST00000254108 أو NM_004960). كانت بروتينات FUS و altFUS إما بدون علامات أو تم تمييزها بـ V5 (GKPIPNPLLGLDST) و 2 F lag (DYKDDDDKDYKDDDDK) ، على التوالي. عند وضع علامة ، تم تمييز FUS على N-terminal ، وتم وضع علامة على altFUS على C-terminal. بالنسبة لفحوصات التألق المناعي ، تم أيضًا استنساخ FUS الموسومة بـ N-terminal GFP في pcDNA3.1- بواسطة مجموعة Gibson. تم شراء كتل gBlock الضرورية من IDT. تم إنشاء التركيبات أحادية النواة FUS (Ø) و FUS (Ø) -R495x عن طريق تحور جميع ميثيونينات altFUS (ATG) إلى threonines (ACG). هذه الطفرات مترادفة في FUS CDS (TAT & gt TAC ، وكلاهما ترميز للتيروزين). تم الحصول على التسلسل المتحور altFUS من خدمة Bio Basic Gene Synthesis ثم تم استنساخه في تسلسلات FUS في pcDNA3.1- باستخدام تجميع Gibson. تتم تسمية التركيبات ثنائية الاتجاه على النحو التالي في جميع أنحاء المقالة: FUS أو FUS-R495x أو FUS (F lag) و FUS (Flag) -R495x عندما يكون altFUS هو F lag - مع وضع علامة في إطار القراءة + 2. تتم تسمية التركيبات الأحادية على النحو التالي في جميع أنحاء المقالة: FUS (Ø) أو FUS (Ø) -R495x للإشارة إلى غياب altFUS.

ثقافة الخلية ، والعدوى ، والبقع الغربية والتألق المناعي

تم اختبار HEK293 وخلايا هيلا سلبية للتلوث بالميكوبلازما (ATCC 30-1012K).تم إجراء عمليات التحويل والتألق المناعي والتحليلات متحد البؤر والبقع الغربية كما هو موصوف سابقًا (Vanderperre وآخرون، 2011). لضربة قاضية في FUS ، تم نقل 150.000 خلية HEK293 في لوحة من 6 آبار باستخدام 25 نانومتر FUS SMARTpool: siGENOME siRNA (Dharmacon ، كندا ، L-009497-00-0005) أو ON-TARGET plus Nontargeting pool siRNAs (Dharmacon ، D-001810 -10-05) مع كاشف تعداء واحد DharmaFECT (Dharmacon ، T-2001–02) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تغيير الوسائط الخلوية كل 24 ساعة ، وتمت معالجة الخلايا بعد 72 ساعة من تعداء الخلايا. بالنسبة إلى التألق المناعي ، تم تخفيف الأجسام المضادة الأولية على النحو التالي: مضاد العلم (Sigma ، F1804) 1/1000 ، مضاد لـ TOMM20 (Abcam ، ab186734) 1/500 ، مضاد V5 (تقنيات تشوير الخلايا ، # 13202) 1/1000 ، مضاد -TDP-43 (ProteinTech، 10782-2-AP) 1/500 ومكافحة TIAR (تقنيات تشوير الخلايا ، # 8611) 1 / 1،600. بالنسبة للبقع الغربية ، تم تخفيف الأجسام المضادة الأولية على النحو التالي: مضاد العلم (Sigma ، F1804) 1/8000 ، مضاد V5 (Sigma ، V8012) 1/8000 ، مضاد أكتين (Sigma ، A5441) 1/40.000 ، مضاد FUS (Abcam، ab84078) 1/500، anti-altFUS (Abcam، جسم مضاد مخصص) 1/3000، anti-H3 (تقنيات تشوير الخلية، 9715S) 1/6000، anti-LC3 (تقنيات تشوير الخلية ، # 2775) 1/1000 ، anti-Hsp70 (Thermo Fisher Scientific، MA3-028) 1/1000، anti-Tubulin (Thermo Fisher Scientific، a11126) 1/2000 and anti-VDAC (Abcam، ab15895) 1 / 10،000. تم إنشاء الجسم المضاد altFUS عن طريق حقن أرنبين ، كل منهما به ببتيدان فريدان من نوع altFUS (الملحق الشكل S1A). تم استخدام الجسم المضاد المنقى من الأرانب 2 في هذه الدراسة بتخفيف 1/2000. نظرًا لأن الجسم المضاد المخصص لدينا هو جسم متعدد النسيلة يتم رفعه مقابل 2 ببتيد ، فإنه للأسف لم يتعرف على الشكل الأصلي للبروتين. تم تقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا باستخدام أداة microP (Peng وآخرون، 2011). تم حساب ما لا يقل عن 100 خلية لكل تكرار عبر 3 تجارب مستقلة (ن = 3 ، أي 300 خلية بحد أدنى لكل حالة تجريبية). تم إجراء تحليلات Colocalization باستخدام المكون الإضافي JACoP (مجرد ملحق Colocalization إضافي) المنفذ في برنامج ImageJ ، كما هو موضح سابقًا (Samandi وآخرون، 2017). عند تحديد ذلك ، تم تفكيك الصور التي تم الحصول عليها عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر على Leica TCS SP8 STED 3X باستخدام برنامج Huygens (Scientific Volume Imaging B.V. ، هيلفرسوم ، هولندا). يستخدم البرنامج خوارزمية إعادة تعيين الإشارة لفك الارتباط ، وتم تطبيق معلمات deconvolution المتطابقة على جميع الصور. تم استخدام المعلمات الافتراضية ، بما في ذلك الخوارزمية الكلاسيكية لتقدير الاحتمالية القصوى (CMLE) ، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء ونصف قطر تقدير الخلفية. تم تحديد الحد الأقصى لعدد التكرار عند 30. تم شراء محلولات الأنسجة البشرية للتعبير الداخلي المنشأ من altFUS من معامل Zyagen (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

R ibo -seq البيانات وتحليلات الحفظ

تم تنزيل القراءات الإجمالية العالمية لبدء الريبوسومات وإطالة آثار أقدام الريبوسومات عبر جميع الدراسات المتاحة من بوابة Gwips (https://gwips.ucc.ie/) ، من أجل الانسان العاقل ولل موس العضلات. لتحليل الحفاظ على البروتين altFUS ، تم استرداد جميع FUS mRNAs مع دليل EST على الأقل عبر جميع الأنواع المتاحة من NCBI RefSeq. أجرينا في السيليكو ترجمة ثلاثية الإطارات واسترداد أفضل تسلسل بروتين مطابق لكل نوع والذي أظهر ما لا يقل عن 20 ٪ من هوية التسلسل مع تسلسل altFUS البشري الذي يزيد عن 25 ٪ من طول altFUS البشري. تم العثور على تسلسل متماثل AltFUS في 83 نوعًا ، وقمنا بإضافة ذلك يدويًا ذبابة الفاكهة سوداء البطن التي عرضت هوية تسلسل 37.5٪ أكثر من 19٪ من طول altFUS البشري. تمت محاذاة جميع تسلسلات altFUS المستردة باستخدام Clustalω مع المعلمات الافتراضية.

التحليل المتمحور حول الببتيد لمجموعات بيانات البروتينات

أداة PepQuery المستقلة (v1.0) (Wen وآخرون، 2019) من موقع الويب PepQuery (http://www.pepquery.org/). تم تشغيل الأداة على مجموعات البيانات التالية من اتحاد TCGA: بروتين سرطان القولون (COCA) ، وسرطان المبيض (OVCA) ، والبروتينات الفوسفاتية والبروتينات السكرية ، وبروتين سرطان الثدي (BRCA) والبروتينات الفوسفاتية. تم تعيين قاعدة البيانات المرجعية على قاعدة بيانات Ensembl (hg38_Ensembl_20190910). تم تعيين المعلمات التالية لجميع عمليات التشغيل ما لم يتم تحديدها: ميثيون الكارباميدوميثيل السيستين كتعديل ثابت (بالإضافة إلى iTRAQ 4-plex of K و iTRAQ 4-plex من الببتيد N- مصطلح لـ BRCA و OVCA) أكسدة الميثيونين كتغيير متغير (مثل بالإضافة إلى iTRAQ 4-plex of Y لـ BRCA و OVCA) بحد أقصى 3 تعديلات لكل ببتيدات هضم التربسين بحد أقصى 1 تسامح سلائف من 10 جزء في المليون (20 جزء في المليون لـ COCA) تحمل كتلة شظية 0.05 Da (0.6 Da لـ COCA) وتم استخدام النقاط الفائقة كمقياس للتسجيل ، و 10000 راندوم. بالنسبة للبروتينات الفسفورية ، تمت إضافة فسفرة Y و T و S كتعديلات متغيرة. بالنسبة للبروتين السكري ، تمت إضافة تخفيف Q و N كتعديلات متغيرة. تم تشغيل PepQuery في وضع البروتين ، مع تسلسل كامل altFUS (IP_243680) كمدخل. تم تصور ورسم الأطياف باستخدام نص بيثون داخلي.

تمايز الخلايا الجذعية التي يسببها الإنسان في الخلايا العصبية الحركية

تم إجراء التمايز الموجه إلى الخلايا العصبية الحركية iPSC البشرية كما ورد سابقًا (Hall وآخرون، 2017). باختصار ، تم الحفاظ على iPSCs على Geltrex (تقنيات الحياة) باستخدام الوسائط الأساسية 8 المتوسطة (تقنيات الحياة) وتم تمريرها باستخدام EDTA (تقنيات الحياة ، 0.5 مم). تم الحفاظ على جميع الثقافات الخلوية عند 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪. من أجل تمايز الخلايا العصبية الحركية ، تم تمييز iPSCs عن الخلايا العصبية عن طريق التصفيح بنسبة 100 ٪ في وسط محدد كيميائيًا يتكون من DMEM / F12 GlutaMAX ، Neurobasal ، L-Glutamine ، N2 ، أحماض أمينية غير أساسية ، مكمل B27 ، β-mercaptoethanol (الحياة التقنيات) والأنسولين (سيغما). العلاج بالجزيئات الصغيرة التالية من اليوم 0-7: 1 ميكرومتر من دورسومورفين (ميليبور) ، 2 ميكرومتر SB431542 (Tocris Bioscience) و 3.3 ميكرومتر CHIR99021 (Miltenyi Biotec). في اليوم الثامن ، تم تشكيل الخلايا لمدة 7 أيام باستخدام 0.5 ميكرومتر من حمض الريتينويك و 1 ميكرومتر من بورمورفين. في اليوم 14 ، عولجت سلائف الخلايا العصبية الحركية للحبل الشوكي بـ 0.1 ميكرومتر من بورمورفين لمدة 4 أيام أخرى قبل أن يتم تمييزها نهائيًا لمدة 10 أيام في 0.1 ميكرومتر من المركب E (Enzo Life Sciences) لتعزيز خروج دورة الخلية. خلال مرحلة التحويل والنقش العصبي (D0-18) ، تم فصل الطبقة الظهارية العصبية مرتين (في D4-5 و D10-12) باستخدام ديباز (GIBCO ، 1 مجم / مل).

تحضير محللات أنسجة القشرة الحركية لمرضى التصلب الجانبي الضموري

تم تفكيك ما يقرب من 100 مجم من القشرة الحركية من 4 حالات ALS متفرقة و 4 C9orf72-ALS في حجم 10 × RIPA (50 ملي مولار من Tris-HCl pH 7.8 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم ، 1٪ NP40 مكمل بمثبطات الأنزيم البروتيني و EDTA) باستخدام معدات TissueLyser (Qiagen). تم تحضين Lysates على الجليد لمدة 20 دقيقة متبوعًا بالطرد المركزي عند 20000 ز لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم أخذ المادة الطافية على أنها جزء من RIPA ، وتم تعليق الكريات في RIPA و SDS (التركيز النهائي بنسبة 2 ٪). تم استخدام 3 عينات متفرقة من ALS و 3 عينات C9orf72-ALS لاحقًا حيث تم تركيزها بشكل كافٍ لتحميل 100 ميكروغرام من البروتينات على المواد الهلامية SDS-PAGE.

تنقية البروتينات المؤتلفة

تمت تنقية البروتين المؤتلف GFP-FUS من خلايا HEK293. باختصار ، تم نقل بنية GFP-FUS في خلايا HEK293. نمت الخلايا بنسبة تصل إلى 80 ٪ ، وشطفت مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ، وحبيبات ومجمدة عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. تم بعد ذلك تعليق الخلايا في محلول تحلل (10 ملي مولار HEPES-NaOH pH 7.6 ، 3 ملي MgCl2، 300 ملي بوكل ، 5٪ جلسرين ، 0.5٪ NP-40) مع مثبطات الفوسفاتيز والبروتياز ، وحضنت على الجليد لمدة 30 دقيقة. تم الطرد المركزي للمحللين عند 16000 ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تمت إضافة المادة الطافية إلى حبات سيفروز GFP-trap (ChromoTek ، ألمانيا) وحضنت عند 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات عند الدوران. تم بعد ذلك غسل الحبات 5 مرات باستخدام المخزن المؤقت للغسيل (10 ملي مولار HEPES-NaOH pH 7.6 ، 3 ملي MgCl2، 5 ٪ جلسرين ، 0.5 ٪ NP-40) بتركيزات متزايدة من KCl: مرتين مع 100 ملي بوكل ، مرة واحدة مع 200 ملي بوكل ومرتين مع 400 ملي بوكل. تم بعد ذلك استخلاص بروتين GFP-FUS من الحبيبات باستخدام 50 ميكرولتر من محلول الجلايسين الحمضي (0.1 م ، درجة الحموضة 3). بعد الطرد المركزي عند 2500 ز لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، تم نقل الشطف إلى أنبوب إيبندورف جديد وتمت معايرته بـ 50 ميكرولتر من محلول Tris (1 M ph 8). تكررت خطوة الشطف ثلاث مرات لحجم إجمالي نهائي قدره 300 ميكرولتر.

تمت تنقية البروتين المؤتلف GST-altFUS من خلايا Rosetta TM المختصة. تم استنساخ تسلسل AltFUS في pGEX-4T1. باختصار ، تم إحداث تعبير GST-altFUS في الخلايا المختصة عند OD بمقدار 0.5 مع 0.5 ملي مولار من IPTG و 2 ٪ من الإيثانول. ثم تُركت الخلايا لتنمو لمدة 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية. تم بعد ذلك طرد الخلايا عند 5000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتم تعليقها في محلول تحلل (1 مم EDTA ، 250 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ٪ جلسرين ، 1 مم DTT ، 25 مجم / مل من الليزوزيم ، 1 ٪ تريتون X-100 ، في برنامج تلفزيوني) وصوتنة قبل الحضانة بالتناوب لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم بعد ذلك جمع الأجزاء القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان وتحميلها على هلام الأكريلاميد. بعد تلوين Coomassie ، تم العثور على بروتين GST-altFUS في الغالب في الجزء غير القابل للذوبان. وهكذا ، تم تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت لتحلل اليوريا 8 أمتار لضمان إعادة التعليق ثم غسيلها باستخدام كاسيت 2K 0.5ML 10 / PK Slide-A-Lyser (# PI66205 ، Thermo Fisher) في المخزن المؤقت المعتاد للتحلل (بدون اليوريا). ثم تم تحضين المحللة التي تم غسيلها باستخدام حبيبات سيفروز GST-trap (Glutathione Sepharose 4B-GE Healthcare، 17-0756-01) لمدة 3 ساعات عند الدوران عند 4 درجات مئوية. تم بعد ذلك غسل الحبيبات 5 مرات: مرتين باستخدام محلول تحلل ، مرة مع برنامج تلفزيوني ومرتين مع محلول غسيل (50 ملي مولار من درجة الحموضة 8.0 ، 250 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ تريتون X-100). تم بعد ذلك التصفية من بروتين GST-altFUS عن طريق احتضان الحبيبات في محلول الشطف (10 ملي مولار مخفض من الجلوتاثيون ، 50 ملي مولار تريس pH 8.0 ، 250 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 10٪ جلسرين و 0.1٪ تريتون X-100) عند الدوران لمدة 15 دقيقة عند 4. درجة مئوية. بعد الطرد المركزي عند 150 ز لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، تم نقل الشطف إلى أنبوب إيبندورف جديد. تم تكرار خطوة الشطف مرتين.

تم جرعات البروتينات المؤتلفة GFP-FUS و GST-alFUS باستخدام بروتين مؤتلف LSD1 تجاري (BML-SE544 ، Enzo Life Sciences) بتركيز معروف. تم بعد ذلك تأكيد التركيز الذي تم تقييمه بواسطة هذا المنحنى القياسي عن طريق تقدير NanoDrop للبروتين الكلي.

مقتطفات الميتوكوندريا والتجزئة الخلوية

تم تحضير مقتطفات الميتوكوندريا كما هو موصوف سابقًا (Delcourt وآخرون، 2018). لفترة وجيزة ، تم شطف خلايا HEK293 التي نمت بنسبة تصل إلى 80 ٪ ، وتم شطفها مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني وتم تجميعها باستخدام مكشطة الخلية. تم تكوير الخلايا بالطرد المركزي عند 500 ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم التخلص من المادة الطافية ، وتم تعليق الخلايا في المخزن المؤقت للميتوكوندريا (210 ملي مانيتول ، 70 ملي سكروز ، 1 مم EDTA ، 10 مم HEPES-NaOH ، درجة الحموضة 7.5 ، 0.5 ملي PMSF ومثبط البروتياز الخالي من EDTA (Thermo Fisher Scientific)). تم تعطيل الخلايا بواسطة 15 ممرًا متتاليًا من خلال حقنة إبرة 25G1 0.5 × 25 على الجليد ، تليها 3 دقائق بالطرد المركزي عند 2000 ز عند 4 درجات مئوية. تم جمع المادة الطافية ، وتم تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت للميتوكوندريا. تكرر اضطراب الخلية أربع مرات ، وتم تمرير جميع المواد الطافية المسترجعة التي تحتوي على الميتوكوندريا مرة أخرى من خلال إبرة حقنة في المخزن المؤقت للميتوكوندريا وتم تطهيرها بالطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 2000 ز عند 4 درجات مئوية. تم تجميع المواد الطافية وطردها لمدة 10 دقائق عند 13000 ز عند 4 درجات مئوية لتكوير الميتوكوندريا. تم تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للميتوكوندريا حتى مزيد من المعالجة. تم إجراء التجزئة الخلوية باستخدام مجموعة تجزئة الخلايا (# 9038S ، تقنية تشوير الخلايا). لفترة وجيزة ، نمت خلايا HEK293 بنسبة تصل إلى 80 ٪ من التقاء ، وغسلت مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني وتم تجميعها باستخدام مكشطة الخلية. تم نسج الخلايا عند 350 ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتم تعليق 2.5 × 10 6 خلايا في 500 ميكرولتر من PBS المثلج. تم نسج قسامة 100 ميكرولتر عند 350 ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتم تعليقها في المخزن المؤقت SDS (4 ٪ SDS ، Tris – HCl 100 ملي درجة الحموضة 7.6) وتم الاحتفاظ بها على أنها WCL (محللة خلية كاملة). تم غزل باقي الخلايا المجمعة (400 ميكرولتر المتبقية) عند 500 ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم التخلص من المادة الطافية ، وتم تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من CIB (مخزن العزل السيتوبلازمي) من المجموعة ، ودوامة لمدة 5 ثوانٍ وحضنت على الجليد لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي عند 500 ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، تم جمع المادة الطافية ككسر خلوي. تم إعادة تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MIB (محلول عزل الغشاء) من المجموعة ، ودوامة لمدة 15 ثانية وحضنت على الجليد لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي عند 8000 ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، تم جمع المادة الطافية كجزء من الغشاء والعضيات. لكل 100 ميكرولتر من الكسر تمت إضافة 60 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل 1 × (من المخزن المؤقت لعينة Cold Spring Laemmli: 50 ملي مولار تريس 6.8 ، 2 ٪ SDS ، 10 ٪ جلسرين ، 5 ٪-مركابتوإيثانول) قبل المعالجة لطخة غربية.

القياسات المحتملة لغشاء الميتوكوندريا

تم قياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا عن طريق قياس التدفق الخلوي في خلايا HEK293 باستخدام TMRE (استر رباعي ميثيل رودامين إيثيل ، Abcam ، ab113852). تم استخدام FCCP كعنصر تحكم إيجابي للتحقق من صحة كل تجربة مستقلة. نمت الخلايا حتى 80٪ التقاء وغسلت مرتين مع برنامج تلفزيوني. تم تحضين الخلايا بعد ذلك لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون2 مع PBS / A (0.2٪ BSA في PBS) محلول (تجريبي) أو 3 ميكرومتر FCCP في محلول PBS / A (تحكم إيجابي). بعد ذلك ، تمت إضافة 100 نانومتر من TMRE وحضنت الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون2. بعد الحضانة ، تم تجريب الخلايا وطردها عند 800 ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتعليقها في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتبقى على الجليد. تم تحليل الخلايا على الفور عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم وضع بوابة للخلايا الحية ، وكذلك بوابة ثانية لتصفية الخلايا المزدوجة. تم تسجيل تألق TMRE (PE-A) على ما لا يقل عن 50000 خلية مسورة لكل حالة تجريبية. تم قياس متوسط ​​شدة التألق TMRE على 3 تجارب مستقلة لكل حالة تجريبية.

الفحص المجهري المحفز لاستنفاد الانبعاثات (STED)

تم تحضير العينات كما هو موضح أعلاه للفحص المجهري متحد البؤر. تم استخدام Leica TCS SP8 STED 3X مع عدسة موضوعية 100x وزيت غمر للصور ثنائية الألوان STED. تم الحصول على الصور عن طريق المسح المتسلسل لمنطقة معينة. تم اختيار مزيج من أصباغ Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific ، A-11017) و Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific ، A-21069) للتصوير STED. تم تحفيز صبغة Alexa Fluor 488 باستخدام ليزر الضوء الأبيض (WLL) عند 488 نانومتر وتم استنفادها باستخدام ليزر STED 660 نانومتر. تم تحفيز صبغة Alexa Fluor 568 باستخدام WLL عند 561 نانومتر وتم استنفادها باستخدام ليزر STED 660 نانومتر. تم تطبيق ليزر STED (660 نانومتر) عند 80 ٪ من الطاقة القصوى.

الكروماتوغرافيا السائلة للبروتين السريع (FPLC) وتنقية التقارب - مطياف الكتلة (AP-MS)

تم طرد مستخلصات الميتوكوندريا لخلايا HEK293 عند 13000 ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة المادة الطافية وتم تعليقها في المخزن المؤقت FPLC (50 ملي مولار Tris – HCl ، 1 مم EDTA ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1٪ Triton X-100 ، درجة الحموضة 7.5 ، تمت تصفيتها باستخدام مرشحات 0.2 ميكرومتر) عند 2 مجم / مل لما مجموعه 4 مجم من بروتينات الميتوكوندريا. تم تحضين العينات على الجليد لمدة 15 دقيقة ثم طردها عند 10000 ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتم تحميل المادة الطافية في حقنة الحقن دون تعطيل الحبيبات. تم إجراء FPLC على عمود HiLoad 16/60 Superdex 200 pg (GE Healthcare ، شيكاغو ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند 4 درجات مئوية. تمت معايرة العمود مسبقًا باستخدام المخزن المؤقت FPLC لما يصل إلى 0.2 CV (حجم العمود) ، وتم تطبيق العينة بمعدل تدفق قدره 0.5 مل / دقيقة مع ضبط إنذار الضغط عند 0.5 ميجا باسكال. تم إجراء الشطف على 72 جزءًا من 1.5 مل بحد أقصى 1.1 CV. لسبر altFUS بواسطة لطخة غربية ، تم ترسيب البروتينات من 150 ميكرولتر من كل 4 كسور في التكرارات التقنية. أولاً ، تمت إضافة 600 ميكرولتر من الميثانول إلى كل أنبوب وخلطه برفق ، قبل إضافة 150 ميكرولتر من الكلوروفورم. تم قلب الأنابيب بلطف 10 مرات قبل إضافة 450 ميكرولتر من ملي- Q H.2يا والدوامة لفترة وجيزة. بعد الطرد المركزي عند 12000 ز لمدة 3 دقائق ، تم التخلص من الطور العلوي ، وأضيف 400 ميكرولتر من الميثانول. يتم طرد الأنابيب عند 16000 ز لمدة 4 دقائق ، وأعيد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت للتحميل. لتحليل التفاعل عن طريق قياس الطيف الكتلي ، تم تجميع الكسور ذات الأهمية (8-14) معًا واحتضانها عند 4 درجات مئوية طوال الليل باستخدام حبات مغناطيسية F lag (Sigma ، M8823) مكيفة مسبقًا بمخزن FPLC. تم بعد ذلك غسل الحبيبات 3 مرات باستخدام 5 مل من محلول FPLC المؤقت و 5 مرات باستخدام 5 مل من 20 ملي مولار NH4HCO3 (ABC). تمت إزالة البروتينات وتقليلها من الخرزات باستخدام 10 ملي مولار من DTT (15 دقيقة عند 55 درجة مئوية) ثم تمت معالجتها بـ 20 ملي مولار IAA (ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة في الظلام). تم هضم البروتينات بين عشية وضحاها عن طريق إضافة 1 ميكروغرام من التربسين (بروميغا ، ماديسون ، ويسكونسن) في 100 ميكرولتر ABC عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تم إخماد الهضم باستخدام حمض الفورميك بنسبة 1٪ ، وتم جمع المادة الطافية. تم غسل الحبيبات مرة واحدة باستخدام الأسيتونيتريل / الماء / حمض الفورميك (1/1 / 0.01 v / v) وتم تجميعها مع مادة طافية. تم تجفيف الببتيدات باستخدام SpeedVac ، وتم تحليته باستخدام C18 Zip-Tip (Millipore Sigma ، Etobicoke ، أونتاريو ، كندا) وأعيد تعليقه في 30 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 1 ٪ في الماء قبل تحليل MS.

تحليل مطياف الكتلة

تم فصل الببتيدات في عمود PepMap C18 نانو (75 ميكرومتر × 50 سم ، Thermo Fisher Scientific). استخدم الإعداد تدرجًا من 0-35٪ (0-215 دقيقة) من 90٪ أسيتونيتريل ، و 0.1٪ حمض الفورميك بمعدل تدفق 200 نيوتن / دقيقة متبوعًا بغسل الأسيتونيتريل وإعادة موازنة العمود لمدة تدرج إجمالية قدرها 4 ساعات مع RSLC Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific ، Dionex). تم رش الببتيدات باستخدام مصدر EASY-Spray (Thermo Fisher Scientific) عند 2 كيلو فولت إلى جانب مطياف الكتلة رباعي القطب (Q Exactive ، Thermo Fisher Scientific). تم الحصول على أطياف MS كاملة ضمن نطاق كتلة m / z 350–1600 بدقة 70،000 مع هدف التحكم التلقائي في الكسب (AGC) من 1e6 ووقت تراكم أقصى (أقصى IT) يبلغ 20 مللي ثانية. تجزئة (MS / MS) للأيونات العشرة الأولى التي تم اكتشافها في مسح كامل MS بدقة 17500 ، هدف AGC 5e5 ، الحد الأقصى لتكنولوجيا المعلومات 60 مللي ثانية مع كتلة أولية ثابتة تبلغ 50 داخل نافذة عزل 3 m / z عند a طاقة الاصطدام الطبيعية (NCE) 25. تم ضبط الاستبعاد الديناميكي على 40 ثانية.تم البحث في ملفات RAW لقياس الطيف الكتلي باستخدام محرك البحث Andromeda المطبق في MaxQuant 1.5.5.1. تم ضبط وضع الهضم عند Trypsin / P بحد أقصى اثنين من الانقسامات المفقودة لكل ببتيدات. تم تعيين أكسدة الميثيونين والأستلة لـ N-terminal كتعديلات متغيرة ، وتم تعيين carbamidomethylation للسيستين كتعديل ثابت. تم تعيين تفاوتات السلائف والشظايا عند 4.5 و 20 جزء في المليون ، على التوالي. تم البحث في الملفات باستخدام نهج شرك الهدف ضد UniprotKB (الانسان العاقل إصدار 03/2017) مع إضافة تسلسل altFUS ليصبح المجموع 92،949 إدخالاً. تم تحديد معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) عند 1٪ لمطابقة طيف الببتيد ومستويات الببتيد والبروتين. تم تسجيل تفاعلات البروتين بعد ذلك باستخدام خوارزمية SAINT ، مع خلايا Mock كعنصر تحكم وحبات F lag المغناطيسية في خلية CRAPome HEK293 (Choi). وآخرون، 2011). تم النظر في البروتينات التي حصلت على درجة SAINT أعلى من 0.99 ، بالإضافة إلى تلك التي تقدم درجة SAINT أعلى من 0.88 بحد أدنى اثنين من الببتيدات الفريدة.

العمليات البيولوجية وتحليل التخصيب الخلوي

تم فحص البروتينات التي تم تحديدها في تفاعل altFUS للمقصورة الخلوية وإثراء العمليات البيولوجية باستخدام إثراء علم الجينات (GO). تم استجواب البروتينات ضد البروتينات البشرية الكاملة للمقصورة الخلوية وضد بروتين الميتوكوندريا البشري (MitoCarta 2.0) للعمليات البيولوجية. استخدم التحليل الإحصائي اختبار فيشر الدقيق مع تعيين FDR عند 1٪.

قياسات التدفق الذاتي

تم استخدام mCherry-GFP-LC3 لتقييم الحويصلات الذاتية داخل خلايا هيلا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. قبل الاندماج مع الليزوزوم ، تعرض جزيئات LC3 على البلعمة الذاتية مضانًا أصفر (مضان mCherry و GFP). بعد الانصهار ، يتم إخماد مضان GFP بواسطة الأس الهيدروجيني الليزوزومي ، وعلى هذا النحو ، تعرض جزيئات LC3 إشارة حمراء (mCherry وحدها). هذا يسمح بالتمثيل البصري للتدفق الذاتي في خلية معينة. تم استخدام الخلايا المعالجة بـ 50 نانومتر بافيلوميسين لمدة 4 ساعات كعنصر تحكم إيجابي للتحقق من صحة كل تجربة مستقلة. تم إجراء الملاحظات عبر نسختين تقنيتين لكل حالة بيولوجية ، عبر 3 تجارب مستقلة (ن = 3). بدلاً من ذلك ، تم أيضًا تقييم التدفق الذاتي عن طريق فحص LC3 قبل وبعد علاج بافيلوميسين (50 نانومتر لمدة 4 ساعات). يتوافق التقدير الكمي مع النسبة المعالجة / غير المعالجة لوفرة LC3-II.

قياسات المجاميع السيتوبلازمية

تم التقاط صور خلايا هيلا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر ثم معالجتها باستخدام المكون الإضافي Image J 3D Objects Counter. ثم تم قياس مجاميع FUS السيتوبلازمية من حيث العدد والحجم (ميكرومتر 2) لكل خلية. تم أخذ ما مجموعه 100 خلية عبر نسختين تقنيتين لكل تجربة مستقلة (ن = 3 ، أي ما لا يقل عن 300 خلية لكل ظروف بيولوجية).

المعدلة وراثيا ذبابة الفاكهة ومقايسة التسلق

تم استنساخ التركيبات ثنائية الاتجاه ، FUS و FUS-R495x ، والتركيبات الأحادية ، altFUS ، FUS (Ø) و FUS (Ø) -R495x ، في ناقل تعبير pUASTattB للإدخال الخاص بالموقع في attP2 على الكروموسوم 3. كان الذباب المحور وراثيًا تم إنشاؤها بواسطة Best Gene (Best Gene Inc. ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). برنامج تشغيل Elav-GeneSwitch-GAL4 (رقم المخزون: 43642 ، التركيب الوراثي: y [1] w [*] PGSG301) وذباب UAS-mCherry (رقم المخزون: 35787 ، التركيب الوراثي: y [1] sc [*] v [1] PattP2) من Bloomington (Bloomington Drosophila Stock Centre ، إنديانا ، الولايات المتحدة الأمريكية). كانت جميع الأسهم في ب 1118 الخلفية وتم تربيتها على وسط قياسي عند 25 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة. تم عبور الذباب المعدل وراثيا مع سلالة سائق Elav-GeneSwitch-GAL4. تم تقسيم F1 بالتساوي إلى مجموعتين مع نسبة متساوية من الذكور والإناث: ستتغذى مجموعة واحدة على طعام قياسي مكمل بالإيثانول (0.2 ٪ - مكافحة الذباب) والأخرى على طعام قياسي مكمل بـ RU-486 عند 10 ميكرومتر مخفف في الإيثانول (الذباب المستحث). تم إجراء اختبار التسلق كما هو موضح سابقًا (Chambers وآخرون، 2013). لفترة وجيزة ، تم نقل الذباب إلى قنينة فارغة وضغطها على القاع. بعد 18 ثانية ، تم اعتبار عدد الذباب في الجزء العلوي من الأنبوب ناجحًا. تم إجراء الفحص في الأيام 1 و 10 و 20 بعد الحث ، عبر 4 مستقلين من F1. تم أخذ خمسة ذباب في الأيام 1 و 10 و 20 بعد الحث للتحقق من صحة التعبير عن البروتينات ذات الأهمية.

التحليلات والتمثيل الإحصائي

ما لم يُذكر خلاف ذلك ، كان التحليل الإحصائي الذي تم إجراؤه عبارة عن ANOVA ثنائي الاتجاه مع تصحيح المقارنة المتعددة لـ Tukey. تمثل المخططات الصندوقية المتوسط ​​مع النسبة المئوية 5-95٪. تمثل الرسوم البيانية الشريطية المتوسط ​​، وتتوافق أشرطة الخطأ مع الانحراف المعياري. عند استخدام الاختبارات البارامترية ، تم التحقق من الحالة الطبيعية لتوزيع البيانات مسبقًا باستخدام اختبار شابيرو-ويلك.


البيولوجيا الجزيئية لفيروسات كورونا

يناقش هذا الفصل التلاعب باستنساخ الفيروس التاجي والحمض النووي التكميلي (cDNAs) من الحمض النووي الريبي المعيب المتداخل (DI) لدراسة تكرار الحمض النووي الريبي لفيروس كورونا ، والنسخ ، وإعادة التركيب ، ومعالجة ونقل البروتينات ، وتجميع الفيروسات ، وتحديد مستقبلات الخلايا لفيروسات كورونا ، ومعالجة البوليميراز. إن طبيعة جينوم الفيروس التاجي هي الحمض النووي الريبي غير المقسم ، أحادي الشريطة ، والإيجابي. يتراوح حجمه من 27 إلى 32 كيلو بايت ، وهو أكبر بكثير بالمقارنة مع فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى. يصل الجين الذي يرمز للبروتين السكري السطحي الكبير إلى 4.4 كيلو بايت ، مما يؤدي إلى ترميز بروتين ثلاثي عالي الجليكوزيلات. يرتفع هذا بحوالي 20 نانومتر فوق غلاف الفيريون ، مما يعطي الفيروس مظهر تاج أو إكليل - بقليل من الخيال. ساهمت أبحاث فيروس كورونا في فهم العديد من جوانب البيولوجيا الجزيئية بشكل عام ، مثل آلية تخليق الحمض النووي الريبي ، والتحكم الانتقالي ، ونقل البروتين ومعالجته. يبقى كنزًا قادرًا على توليد رؤى غير متوقعة.


مناقشة

يتم التحكم بدقة في الحث النسخي المحدد للجينات الهدبية وتنسيقه أثناء تكوين الأهداب ، ويؤدي تثبيط النسخ إلى إعاقة التكوّن الهدبي (10). على الرغم من أن أهمية التنظيم النسخي للتعبير الجيني الهدبي قد تم توثيقه في البداية في كلاميدوموناس (11) ، تظل الآليات الكامنة وراء هذا التنظيم غير مفهومة جيدًا. على حد علمنا ، لم يتم الإبلاغ عن الآليات والجينات التي تنظم النسخ والتعبير عن الجينات الهدبية في كلاميدوموناس أو كائنات وحيدة الخلية أخرى.

من المسلم به عمومًا أن آخر سلف مشترك حقيقي النواة هو كائن وحيد الخلية جلدي (26). على الرغم من أن الجينات السوطية تخضع لتنظيم النسخ المباشر في كل من الكائنات أحادية الخلية ومتعددة الخلايا ، فإن تطور برنامج النسخ الذي يتحكم في تجميع السوط غير معروف إلى حد كبير (26). أظهرت الدراسات السابقة أن عوامل النسخ RFX وعوامل النسخ FOXJ1 والجينات الهدبية تطورت جميعها بشكل مستقل (26 ⇓ -28). ينظم التحكم النسخي للجينات الهدبية عمومًا تكوين نوع واحد من الهدب في الكائنات أحادية الخلية. ومع ذلك ، في الكائنات متعددة الخلايا ، يتم تنظيم العديد من الجينات الهدبية بشكل تفاضلي باستخدام أنماط التعبير الخاصة بنوع الخلية لتوليد التنوع الهدبي (10). إن RFX و FOXJ1 هما المنظمان الرئيسيان للتعبير الجيني الهدبي في الحيوانات (10). ومع ذلك ، كلاهما غائب عن العديد من الكائنات وحيدة الخلية ، بما في ذلك كلاميدوموناس، مما يشير إلى أن التحكم النسخي للتكوين الهدبي يختلف اختلافًا جوهريًا في الكائنات أحادية الخلية ومتعددة الخلايا.

تشير البيانات السابقة إلى أن بروتينات XAP5 تلعب أدوارًا حيوية في العديد من العمليات البيولوجية (17 ⇓ –20). ومع ذلك ، لا يُعرف الكثير عن الوظيفة الجزيئية الدقيقة لبروتين النواة المحفوظة XAP5. في الدراسة الحالية ، كشف تحليل ربط في المختبر مع عناصر تنظيمية للنسخ المتوقعة أن XAP5 يمكن أن يتعرف على وجه التحديد ويرتبط بعنصر مع قلب CTGGGGTG في مناطق المروج للجينات الهدبية (الشكل 3). علاوة على ذلك ، أظهرنا أن XAP5 تسبب في أنشطة المروج للجينات الهدبية المستهدفة (الشكل 4). لذلك ، تظهر نتائجنا أن XAP5 يعمل كعامل نسخ لتنظيم التجمع السوطي في كلاميدوموناس. كان التحكم في النسخ لأكثر من 100 جين جلدي يعتمد على XAP5 ، ​​في حين أن التعبير عن العديد من الجينات السوطية كان مستقلاً عن XAP5 ، ​​مما يعني أن تنظيم الجينات السوطية على مستوى النسخ هو عملية معقدة للغاية وأن التعبير الجيني السوطي المستقل عن XAP5 يمكن أن يكون تنظمها آليات نسخ أخرى غير مكتشفة. بالإضافة إلى ذلك ، احتوت مناطق المروج لجميع الجينات السوطية المعتمدة على XAP5 تقريبًا على نموذج ربط XAP5 المفترض. وبالتالي ، من الممكن استخدام نموذج ربط XAP5 للتنبؤ بأهداف XAP5 ، ​​لا سيما تلك الموجودة بين الجينات السوطية ، والتي توفر طريقة لتحديد الجينات التي يحتمل أن تشارك في التجميع والوظيفة الهدبية.


نتائج

عدم وجود ميرك 11 لا يغير تطور الخلايا القاتلة الطبيعية

ميرك 11 يتكون من miR-23a ، miR-27a، و ميل -24-2 (الشكل التكميلي S1A) ويعمل كمفتاح في تنظيم التزام النسب للخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية (HSPC المراجع 40 ، 41). نقص في ميرك 11 لم يغير النسب المئوية لـ CD3ε NK1.1 + خلايا NK في نخاع العظم (BM) والأعضاء الطرفية الأخرى (الطحال والكبد والرئة والدم الشكل التكميلي S1B). التعبير عن علامات نضج الخلايا القاتلة الطبيعية CD51 (αالخامس) و CD49b لم يتأثر ميرك 11 نقص. انخفاض في التعبير عن CD51 (42) و CD27 ، وزيادة في إنتاج CD11b (αMβ2) ، وفي النهاية ، يحدد فقدان CD27 النضج الوظيفي ، والتي كانت قابلة للمقارنة بين ميرك 11- الفئران الناقصة و WT من الطرز الوراثية (الشكل التكميلي S1C و S1D). كانت خلايا NK المحددة من خلال الاستحواذ العشوائي لمستقبلات Ly49 المتميزة مثل Ly49C / I و Ly49H و Ly49A و Ly49D و Ly49G2 (42) متشابهة (الشكل التكميلي S1C و S1E). لم تتغير خلايا NK الناضجة نهائيًا ، كما هو محدد بواسطة تعبير KLRG1 (43) ميرك 11 - / نسبة إلى الفئران WT. وبالتالي ، عدم وجود ميرك 11 لم يؤثر على تطور ونضج الخلايا القاتلة الطبيعية.

تأثير ميرك 11 على السمية الخلوية NK بوساطة

بعد ذلك ، قمنا بتقييم الإمكانات السامة للخلايا لخلايا NK الساذجة ضد الخلايا السرطانية B16F10 التي تعبر عن CD155 (مستحث ذاتيًا) ، وهو يجند لخلايا الغدة الدرقية EL4 الأبوية (ذاتية) EL4 المنقولة بشكل ثابت باستخدام H60 (EL4 H60) ، يجند لخلايا RMA / S NKG2D (ذاتية الاستحثاث) التي تفتقر إلى التعبير الطبيعي لخلايا MHC من الفئة I H-2 b (فقدان الذات) وخلايا YAC1 التي تكون من H-2 وهي خلفية إجهاد (allo). كانت خلايا Naïve NK قادرة فقط على التوسط في السمية الخلوية القابلة للاكتشاف ضد أهداف الذات والأهداف المفقودة ، مع وجود فرق ذي دلالة إحصائية بين WT و ميرك 11 - / - يتم الوصول إلى الفئران فقط من أجل الذات المفقودة (الشكل التكميلي S2A).

يلعب IL2 دورًا في إزالة خلايا B16F10 في الجسم الحي (44). توسعت خلايا NK المنقاة من الطحال مع IL2 واختبرت إمكاناتها السامة للخلايا في اليوم السابع. ميرك 11 - / - وكانت الفئران WT سامة للخلايا بشكل مشابه لخلايا B16F10 وأهداف أخرى (الشكل التكميلي S2B). الحد من السمية الخلوية لخلايا NK المستزرعة من IL15 من ميرك 11 - / - أو الفئران WT كانت مهمة فقط للأهداف الذاتية المفقودة أو allo (الشكل التكميلي S2C). هكذا، ميرك 11 لا ينظم الإمكانات السامة للخلايا لخلايا NK ، بما يتوافق مع دور IL2 ، المعروف بتجاوز متطلبات بلمرة الأكتين المعتمدة على WASp في الخلايا القاتلة الطبيعية (45).

في نموذج رفض الزرع ، مضيف WT أو ميرك 11 - / - (H-2 b) تم تحدي الفئران بخلايا طحالية مشتقة من المانحين من C57BL / 6 (H-2 b "self") ، β2M tm1Unc / J (H-2 b ولكن سالبة لسطح الخلية H2-K b و H2-D b "فقدان الذات") وفئران BALB / c (H-2 d "غير ذاتي"). تم تصنيف وحقن خلايا الطحال المانحة. يمثل عدد الخلايا الطحالية المتبرعة المتبقية بعد 18 ساعة علامة بديلة للقتل بوساطة الخلايا القاتلة الطبيعية. فقدان ميرك 11 أضعف بشكل كبير قدرة الخلايا القاتلة الطبيعية على مسح أهداف "الذات المفقودة" ولكن ليس الأهداف "غير الذاتية" (الشكل التكميلي S2D) ، مما يشير إلى أن الخلايا القاتلة الطبيعية تعتمد جزئيًا على ميرك 11 لتنظيم السمية الخلوية بوساطة الخلايا.

ميرك 11 ضروري للاستجابات المسببة للالتهابات للخلايا القاتلة الطبيعية

لمعالجة ما إذا كان عدم وجود ميرك 11 يؤثر على إنتاج السيتوكينات الالتهابية ، تمت زراعة الخلايا القاتلة الطبيعية المستزرعة IL2- أو IL15 مع أهداف الورم (الشكل 1 أ و ب). نقص في ميرك 11 أضعف بشكل كبير قدرة الخلايا القاتلة الطبيعية على إنتاج IFNγ. على الرغم من استنبات خلايا NK من ميرك 11 - / - الفئران المصابة بـ IL2 ساعدت في التغلب على الخلل في السمية الخلوية المضادة للورم ، ولم تنقذ إنتاج IFNγ (الشكل 1 أ). هذا يدل على ذلك ميرك 11 ينظم السمية الخلوية وإنتاج السيتوكينات عبر آليات متميزة.

عدم وجود ميرك 11 يقلل من إنتاج السيتوكينات بوساطة الخلايا القاتلة الطبيعية في المختبر. أ و ب، يتم قياس IFNγ داخل الخلايا في خلايا NK المستزرعة IL2- أو IL15 من WT (ن = 3) و ميرك 11 −/− (ن = 3) الفئران بعد الاستزراع مع الأهداف المحددة (المستجيب: الهدف = 1: 1). ج ، التحليلات الكمية للسيتوكينات والكيموكينات التي تنتجها WT (، ن = 6) أو ميرك 11 −/− ( , ن = 6) الخلايا القاتلة الطبيعية بعد التنشيط بالأجسام المضادة المحددة و IL12 و IL18. د، مخطط فين الذي يصور الجينات المعبر عنها تفاضليًا (FDR & lt 0.05) في الخلايا القاتلة الطبيعية بعد التنشيط المضاد لـ NKG2D (ميرك 11 −/− , ن = 3 وزن ، ن = 3). ه ، مؤامرة بركان تصور التعديلات في نسخة الخلايا القاتلة الطبيعية (ن = 3 ، 3). قمنا برسم كل الجينات باستخدام – Log10 (ص القيم) أكبر من 80 عند المحور ص تساوي 80. خريطة حرارية مستمدة من RNA-seq لخلايا NK المستزرعة IL2 المحفزة بمضاد NKG2D (ن = 3 ، 3). تمثل الرسوم البيانية الشريطية المتوسط ​​مع الانحرافات المعيارية التي تم الحصول عليها باستخدام unpaired ر اختبار (*، ص & lt 0.05 ** ، & lt 0.01 *** ، & lt0.001).

لتحديد مسارات الإشارات المحددة التي تتأثر بغياب ميرك 11، قمنا بتحفيز خلايا NK بأجسام مضادة مرتبطة بالصفائح. تم تنشيط خلايا NK المستنبتة من IL2 باستخدام مضادات NKG2D (DAP10 و DAP12) ، ومضادة لـ NCR1 (Fc εRIγ و CD3ζ) ، ومضادة لـ CD137 (Lck-Fyn و TRAF2) ، ومضادة لـ CD244 (SAP-Fyn) ، أو مكافحة- Ly49H (DAP10 و DAP12). تم تحليل طاف الثقافة لـ IFNγ و TNFα و GM-CSF و CCL3 (MIP1α) و CCL4 (MIP1β) و CCL5 (RANTES). تم إعاقة توليد هذه السيتوكينات والكيموكينات بشكل كبير في الخلايا القاتلة الطبيعية من ميرك 11 - / - الفئران مقارنة مع WT (الشكل 1C). يمكن لـ IL12 و IL18 أيضًا تحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية لإنتاج السيتوكينات (46) ، وكشفت تحليلات المواد الطافية الخاصة بهم أن إنتاج IFNγ و GM-CSF و CCL3 و CCL4 و CCL5 كان قابلاً للمقارنة بين ميرك 11 - / - وفئران WT. وهكذا ، فإن وظيفة ميرك 11 مطلوب في اتجاه مجرى التنشيط بوساطة مستقبلات التنشيط ، وهذا النقص في ميرك 11 المعقد لا يجعل الخلايا القاتلة الطبيعية ناقصة الاستجابة على الصعيد العالمي.

لاستخدام نهج غير متحيز لتحديد الجينات المستهدفة التي ينظمها ميرك 11، أجرينا تحليلات RNA-seq على مستوى النسخ لخلايا NK الطحالية المنقاة من IL2 والتي تم تنشيطها باستخدام مضاد NKG2D المرتبط باللوح. تم عزل إجمالي الرنا المرسال ونسخها وتسلسلها. كشفت التحليلات غير الخاضعة للإشراف لمحات النسخ لخلايا NK غير المحفزة والمضادة لـ NKG2D باستخدام تحليلات المكونات الرئيسية (PCA) أن خلايا WT NK المحفزة تمتلك نسختًا متميزة عن ميرك 11 - / - خلايا NK (الشكل التكميلي S3A). استخدمنا التصفية الإحصائية (ص & lt 0.05 تصحيح Mann-Whitney و Benjamini-Hochberg للمحفزات مقابل غير المحفزة) لتحديد الجينات التي تتوافق مع الظروف المختلفة بناءً على تشابه النصوص المتاحة. من بين عناصر التحكم غير المحفزة ، تم التعبير عن مجموعة من 255 جينًا بوضوح في خلايا NK من WT التي كانت منخفضة أو لم يتم التعبير عنها في ميرك 11 - / - الخلايا القاتلة الطبيعية (الشكل 1 د). بعد التنشيط المضاد لـ NKG2D بوساطة ، عبرت خلايا WT NK بشكل تفاضلي عن 1،074 نسخة مقارنة مع غير المحفزة ، منها 240 متداخلة بين WT و ميرك 11 - / - الفئران. تم التعبير عن إجمالي 834 جينًا فقط في خلايا WT NK بعد تنشيط بوساطة مضاد لـ NKG2D ، والذي كان منخفضًا أو غائبًا في ميرك 11 - / - خلايا NK. في الواقع ، كشفت مقارنة النصوص المعبر عنها تفاضليًا توهينًا للتعبير عن السيتوكينات المنشطة للالتهابات ، والكيموكينات ، والعوامل المرتبطة بالحبيبات السامة للخلايا في ميرك 11 - / - خلايا NK (الشكل 1E و F). بشكل جماعي ، هذا يدل على ذلك ميرك 11 يلعب دورًا في التنظيم الإيجابي لإنتاج العوامل المسببة للالتهابات.

ميرك 11 إلزامي لخلية NK بوساطة في الجسم الحي تخليص L. monocytogenes

لتقييم دور ميرك 11 في التخليص المعتمد على IFNγ L. monocytogenes العدوى ، أصابنا الفئران الحية بشكل منهجي L. monocytogenes (2 × 10 4 ، ∼0.5 LD50) واختبارها للتعبير عن الأفراد من أعضاء ميرك 11 في خلايا الطحال NK المنقى بعد 48 ساعة. لوحظت تغييرات كبيرة في التعبير عن ميل -27 أ نسخة متبوعة بملحق ميل -24-2 و ال مير -23 أ، مما يشير إلى وظيفة تنظيمية لهذه النصوص أثناء عدوى الليستريا (الشكل 2 أ). بالمقارنة مع الفئران WT ، كان عدد البكتيريا في كبد Mirc11 - / - الفئران أعلى بعد 48 ساعة (الشكل 2 ب). لاحظنا أيضًا انخفاضًا كبيرًا في النسب المئوية لخلايا CD3ε - NK1.1 + NK إيجابية IFNγ من Mirc11 - / - مقارنة مع الفئران WT (الشكل 2C) خلال L. monocytogenes عدوى.

ميرك 11 إلزامي بالنسبة لخلايا NK المعتمد على IFNγ في الجسم الحي تخليص L. monocytogenes و B16F10. أ، التعبير النسبي لأعضاء ميرك 11 في خلايا NK من الفئران WT (ن = 3) التالية L. monocytogenes عدوى. ب، القياس الكمي للحمل البكتيري في الكبد (ن = 9 ، 9). يظهر العبء البكتيري من الفئران الفردية. ج ، النسبة المئوية للوزن (ن = 9) و ميرك 11 −/− (ن = 9) الخلايا القاتلة الطبيعية الطحالية التي تنتج IFNγ بعد الإصابة L. monocytogenes. د و ه ، الخلايا القاتلة الطبيعية المعزولة من طحال من خليط BM الوهمي 1 (ن = 5). إجمالي عدد خلايا NK (د) والنسبة المئوية لخلايا IFNγ + NK (ه). مخطط فين الذي يصور عدد الجينات المعبر عنها تفاضليًا (FDR & lt 0.05) في خلايا NK الطازجة (ن = 3 ، 3 ، 3 ، 3) بعد L. monocytogenes عدوى. ز مؤامرة بركان تصور التعديلات في الملامح الترانسكريبتوميك لخلايا ناغورني كاراباخ. الجينات مع –Log10 (ص القيم) الأكبر من 80 عند المحور ص. ح تحليلات خريطة الحرارة RNA-seq لخلايا NK المعزولة حديثًا من الفئران المصابة L. monocytogenes (ن = 3, 3). أنا، الانبثاث الرئوي الكاذب الرئوي في رئتي الفئران بعد الحقن الوريدي لخلايا B16F10 (ن = 4 ، 4). اليسار ، والمعزول حديثا ، والرئتين التمثيلية. أقسام الرئة الوسطى والهيماتوكسيلين والأيوزين ملطخة. المناطق اليمنى المكبرة (100 ×). J ، القياس الكمي لعقيدات الرئة. WT (ن = 6) و ميرك 11 −/− (ن = 8) تم حقن الفئران عن طريق الوريد إما بخلايا 2 × 10 5 (يسار) أو 10 6 (يمين) B16F10 ، وتم حصاد الرئتين في 14 أو 7 أيام على التوالي. تم استخدام العد مزدوج التعمية. ك، التعبير النسبي لأعضاء ميرك 11 في الخلايا القاتلة الطبيعية المعزولة من رئتي الفئران WT ذات التحدي B16F10 (ن = 3). البيانات المقدمة عبارة عن تجميع لثلاث تجارب مستقلة توضح المتوسط ​​مع الخطأ المعياري. تم تحليل البيانات باستخدام ر اختبار (*، ص & lt 0.05 ** ، & lt 0.01 *** ، & lt 0.001). مان ويتني يو تم استخدام الاختبار للتحليلات الإحصائية لهرمون BM.

للتأكد من أن ضعف إنتاج السيتوكينات لوحظ في ميرك 11 كانت الخلايا القاتلة الطبيعية جوهرية ، فقد أنشأنا هجومات BM مختلطة. تم نقل أعداد متساوية من الخلايا المشتقة من BM من WT (CD45.1 + B6.SJL) و Mirc11 - / - (CD45.2 + C57BL / 6) الفئران إلى Rag2 - / - γج - / - الفئران. بعد ستة أسابيع ، تم تحدي الفئران L. monocytogenes (2 × 10 4). بعد 48 ساعة ، تم تحليل الطحال من أجل النسبة المئوية لخلايا CD3ε - NK1.1 + NK إيجابية IFNγ. في حين أن النسبة المئوية للخلايا NK لم تختلف ، مما يشير إلى معدلات بقاء قابلة للمقارنة لخلايا NK بين نمطين وراثيين (الشكل 2D) ، انخفض إنتاج IFNγ بشكل كبير في خلايا NK من ميرك 11 - / - مقارنة مع الفئران WT (الشكل 2E).

لمزيد من تقييم التغييرات النسخية ، استخدم WT و ميرك 11 - / - تم تحدي الفئران مرة أخرى L. monocytogenes. بعد 48 ساعة ، تم فرز خلايا الطحال CD3ε - NK1.1 + NK ، وتم ترتيب إجمالي الرنا المرسال لكل مجموعة (بدون تحدي أو معارضة). كشفت التحليلات غير الخاضعة للإشراف لمحات النسخ باستخدام PCA أن نسخة الخلايا القاتلة الطبيعية من الفئران WT كانت مختلفة عن تلك الموجودة في ميرك 11 - / - الفئران (الشكل التكميلي S3A). كشفت التحليلات الإحصائية عن الجينات المعبر عنها تفاضليًا في WT و ميرك 11 - / - الفئران. الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من WT و ميرك 11 - / - تحدي الفئران مع L. monocytogenes أظهر تعبيرًا تفاضليًا لـ 6519 و 7537 جينًا على التوالي. الخلايا القاتلة الطبيعية من الطحال من WT و ميرك 11 - / - كان لدى الفئران تعبير تفاضلي لـ 3433 و 4184 جينًا ، على التوالي. في الخلايا القاتلة الطبيعية المستمدة من الفئران غير المتحدية ، تم التعبير عن مجموعة من 740 جينًا بشكل تفاضلي في WT مقارنة مع تلك الموجودة في ميرك 11 - / - الفئران مع اختلاف في التعبير عن 2 أضعاف أو تغيير أكثر في أي من الاتجاهين (الشكل 2F). التالية L. monocytogenes التحدي ، عبرت خلايا NK من الفئران WT عن 5302 نسخة ، تم التعبير عن 1217 منها بواسطة ميرك 11 - / - الفئران. بعد تطبيع كميات نصوص الخلايا القاتلة الطبيعية من ميرك 11 - / - لكميات WT ، قمنا برسم جميع الجينات باستخدام مخططات Volcano لتحديد التغيير العام في ملف تعريف النسخ (الشكل 2G). تحليلات لوحة مختارة من النصوص ترميز العوامل المسببة للالتهاب باستخدام خرائط الحرارة لقيم التعبير الطبيعي (السجل2) كشف عدم قدرة الخلايا القاتلة الطبيعية من ميرك 11 - / - الفئران لنسخ العديد من هذه الجينات (الشكل 2H). النصوص التي تشفر العديد من السيتوكينات المنشطة للالتهابات (Ifng و Lif و Tnfa و csf2) ، كيموكينات (Ccl22 ، Ccl19 ، Ccl17 ، Ccl8 ، Ccl12 ، Ccl7) ، العوامل المرتبطة بالحبيبات السامة للخلايا (Gzmc و Gzmb و Pfr1 و Gzmf و Gzma) و interleukins (Il10 ، Il17a ، Il27 ، Il6 ، Il12a ، Il15 ، Il22 ، Il22b ، Il18 ، Il23a ، Il7 ، Il2 ، Il4) بنسبة تزيد عن 50٪ في الخلايا القاتلة الطبيعية من ميرك 11 - / - الفئران بالنسبة لـ WT (الشكل 2H). هكذا، ميرك 11 يلعب دورًا في التنظيم الإيجابي لإنتاج العوامل المسببة للالتهابات.

ميرك 11 مطلوب لخلية NK بوساطة في الجسم الحي تخليص B16F10

لتقييم دور ميرك 11 في تنظيم الاستجابة المضادة للورم في الجسم الحي، استخدمنا نموذج ورم خبيث رئوي كاذب قائم على سرطان الجلد B16F10 (47) ، حيث تعتمد الفئران المضيفة على إنتاج IFNγ بوساطة خلية NK لإزالة الورم (48). تم تحدي الفئران عن طريق الوريد ، وتم حصاد الرئتين عند الحاجة ، وتم عد عدد العقيدات. أشارت التحليلات الإجمالية وتلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين (الشكل 2I) والكميات (الشكل 2J) إلى المزيد من الانبثاث الكاذب في رئتي ميرك 11 - / - الفئران مقارنة مع الفئران WT. التعبير عن ميرك 11 زيادة تحدي الورم التالي مقارنة مع الفئران غير المتحدي (الشكل 2K). هذا يشير إلى أن الزيادة في ميرك 11 يرتبط التعبير بالقدرة المتزايدة للخلايا القاتلة الطبيعية للتوسط في إزالة أورام B16F10.

تحديد ميرك 11 أهداف في خلايا NK

حددنا بعد ذلك أهداف mRNA لـ ميرك 11 باستخدام بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد النصوص المستهدفة تفاضليًا باستخدام اختبار فيشر الدقيق لمقارنة الخلايا القاتلة الطبيعية الطحالية المشتقة من الخلايا غير المتحدية و L. monocytogenes- تحدي WT و ميرك 11 - / - الفئران. الأهداف المحتملة لـ miR-23a ، miR-27a، و ميل -24-2 تم تحديدها بناءً على وجود متواليات "البذور" الفريدة الموجودة في المنطقة غير المترجمة 3 (UTR) للنصوص (الشكل 3 أ). حددنا مجموعة من الأهداف بناءً على "الاحتمال الكلي للاستهداف المحفوظ" (PCT المرجع. 49). في السيليكو حددت التنبؤات التي تطابقت مع 3 UTR من النصوص وأخصائيي تقويم العظام بناءً على محاذاة الجينوم الكامل UCSC ما مجموعه 6606 جينًا يمكن استهدافها بواسطة ميرك 11 (الشكل 3 أ). من بين هؤلاء ، كان 5،972 موجودًا في بيانات RNA-seq التي تم الحصول عليها من خلايا NK الطحالية التالية L. monocytogenes عدوى (الشكل 3 ب). تم التعبير بشكل تفاضلي فقط عن جزء بسيط من الجينات (617) بين WT و ميرك 11 - / - فئران تحت ظروف غير منزعجة (الشكل 3 ج). ومع ذلك ، التالية الليستريا التحدي ، تم التعبير عن 2073 من هذه النصوص بشكل تفاضلي بين خلايا NK المشتقة من WT و ميرك 11 - / - الفئران (الشكل ثلاثي الأبعاد). عدم وجود ميل -24-2 كان مرتبطًا بأكثر الجينات المعبر عنها تفاضلًا (1169) ، يليه مير -23 أ (1،145) و ميل -27 أ (394). يمكن استهداف العديد من هذه الجينات بواسطة واحد أو أكثر من الجزيئات المجهرية الثلاثة.

التعديلات النوعية في النصوص المستهدفة المحتملة لـ ميرك 11. أ، مخطط Venn الذي يصور العدد الإجمالي لإدخال الهدف المعدل بواسطة miR-23a ، miR-27a، و ميل -24-2 والأهداف المتداخلة. ب، مخطط Venn الذي يصور عدد الجينات المستهدفة الإجمالية المعبر عنها في خلايا NK والتي تم تعديلها بواسطة miR-23a ، miR-27a، و ميل -24-2 والأهداف المتداخلة. ج و د، مخطط فين الذي يصور عدد الجينات المستهدفة الإجمالية في الخلايا القاتلة الطبيعية المعزولة حديثًا أو التالية L. monocytogenes عدوى. E-G ، التجميع الهرمي لجميع الجينات المستهدفة المحتملة لـ ميرك 11 في خلايا NK من L. monocytogenes- الفئران المتحدية. TargetScan 7.1 في السيليكو تم استخدام التحليلات لتحديد mRNAs الموجودة في إجمالي تحليلات RNA-seq على نطاق الجينوم لخلايا NK من الفئران التي لم يتم تحديها أو تم تحديها باستخدام L. monocytogenes.

كشفت تحليلات هويات الأهداف عن مجموعات من الجينات التي تتحكم في موت الخلايا المبرمج وبقاء الخلية ، ومنظمات التمثيل الغذائي ، والمنشطات النسخية للسيتوكينات والكيموكينات ، وبروتينات الإشارات (الشكل 3E-G). كانت المجموعة الأولى عبارة عن نصوص ترميز منشطات النسخ (Stat1 ، Ctnnb1p1 ، Zfp799 ، Zfp113 ، Zfp397 ، Zfp329 ، IRF4 ، Pparg) أو القامعات (ATF3 ، Runx2 ، Hic2) التي قد تتحكم في إنتاج السيتوكينات والكيماويات الالتهابية. قد تشير التعديلات في كمية نسخ ATF3 و IRF4 و Runx2 إلى آليات. وجدنا كميات من نسخ ATF3 مخفضة في الخلايا القاتلة الطبيعية من ميرك 11 - / - مقارنة مع الفئران من WT. يتفاعل ATF3 مع رابطة الدول المستقلة- عنصر تنظيمي وقمع نسخ ملف Ifng جين (50). لذلك ، لا يوفر انخفاض ATF3 تفسيرًا لانخفاض IFNγ أو إنتاج السيتوكينات الالتهابي الآخر الذي نلاحظه في ميرك 11 - / - الفئران. بعد، بعدما L. monocytogenes العدوى ، لاحظنا زيادة في نصوص ترميز IRF4 في خلايا NK من WT ولكن ليس ميرك 11 - / - الفئران. ميرك 11 له تأثير نسخ أوسع ، حيث تم أيضًا تغيير الجينات التي لم تكن تشفر السيتوكينات والكيماويات.

ميرك 11 هو منظم إيجابي للنسخ الجيني NF-κB و AP-1 بوساطة

يتم التوسط في الاستقراء النسخي للعوامل المسببة للالتهاب بشكل أساسي بواسطة NF-B (p50 / Rel-A) و AP-1 (c-Fos / c-Jun المرجع 51). كشفت تحليلات حالة التنشيط لـ Jnk1 / 2 المنبع لـ NF-B و AP-1 عن انخفاض في الفسفرة بعد التنشيط المضاد لـ NKG2D بوساطة (الشكل التكميلي S3B). شوهدت تخفيضات مماثلة في فسفرة Erk1 / 2 ولكن ليس من p38. لتحديد تأثير ميرك 11 على تنشيط NF-κB و AP-1 ، أجرينا في السيليكو تحليلات شبكة الجينوم التنظيمية على مستوى الشبكة باستخدام آلية الكشف عن العمل عن طريق عدم تنظيم الشبكة (DeMAND المرجع 52) وشبكة Bayesian المُجمَّعة مسبقًا بناءً على ملفات تعريف التعبير الجيني لـ 254 خلية سرطان الغدد الليمفاوية B على صفائف U95av2. بعد التحفيز باستخدام مضاد NKG2D ، كشف تحليل DeMAND أن Rel-A (ص 65 ، ص & lt 10 7) ويونيو (ص & lt 10 −8) تم تغيير الشبكات بين WT و ميرك 11 - / خلايا NK (الشكل التكميلي S4A و S4B). وبالمثل ، كشف تحليل شبكة الجينات باستخدام أداة برنامج IPA أن NF-B (ص & lt 10 −42) و AP-1 (ص & lt 10 −13) تم إثراء المسارات بين مجموعات الجينات المعبر عنها تفاضليًا في الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من L. monocytogenes- الفئران المتحدية (الشكل 4). تم تحديد ما مجموعه 280 جينًا معبرًا تفاضليًا مع 64 جينًا منظمًا و 216 جينًا خاضعًا للتنظيم يتم تنظيمها نسبيًا بواسطة NF-B. تم تحديد ما مجموعه 320 جينًا معبرًا تفاضليًا ، مع 132 جينًا منظمًا و 188 خاضعًا للتنظيم وهي الجينات المستهدفة لـ AP-1. كشف التجميع الهرمي عن مجموعات جينية متميزة إما منظمة أو منظمة كما هو معروض في خرائط الحرارة (الشكل 4 أ و ب). حدد التصنيف الوظيفي واختبار فيشر الدقيق أيضًا النصوص المخصبة التي تشفر السيتوكينات المسببة للالتهابات والكيموكينات وعوامل النسخ الأخرى. وبالتالي ، فإن الاستجابة المنخفضة ميرك 11 - / - من المرجح أن تكون الخلايا القاتلة الطبيعية ناتجة عن تعطيل تنشيط NF- B و AP-1.

ميرك 11 يستهدف نسخ الجينات NF-κB و AP-1 بوساطة. التجميع الهرمي لـ NF-B (أ) أو AP-1 (ب) الجينات المستهدفة التي يتم التعبير عنها تفاضليًا بين الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من WT و ميرك 11 - / - استخدام الفئران غير المزاوجة ر الاختبار التالي L. monocytogenes عدوى. تم تحديد مجموعات الجينات باستخدام برنامج المعلوماتية IPA من خلال التصنيف إلى فئات علم الجينات (GO) مع FDR بنسبة 0.01 ٪ بناءً على فئات العمليات البيولوجية والوظائف الجزيئية مع تقييد تغيير مزدوج على الأقل. بيانات RNA-seq من WT (ن = 3 ، 3) و ميرك 11 −/− (ن = 3 ، 3) تتم مقارنتها وعرضها.

للتحقق من صحة هذه في السيليكو النتائج ، حددنا الحالة الوظيفية لكل من NF-B و AP-1 في خلايا NK من ميرك 11 - / الفئران. خلايا NK من WT و ميرك 11 - / - تم تحفيز الفئران باستخدام مضاد NKG2D المرتبط بالصفائح ، والمحللات النووية المحضرة ، وقياس ارتباط NF-κB و AP-1 بالحمض النووي الكروموسومي باستخدام مقايسة تحول الحركة الكهربي (EMSA). وجدنا أن كلا من مسارات NF-κB و AP-1 يتم تنشيطها في خلايا WT NK ولكن يتم تقليلها في ميرك 11 - / - خلايا NK (الشكل 5 أ).

ميرك 11 يستهدف نسخ الجينات NF-κB و AP-1 بوساطة. أ، الإزاحة النووية لـ NF-κB و AP-1 في الخلايا القاتلة الطبيعية بعد التنشيط باستخدام مضاد NKG2D (ن = 3 ، 3). البيانات المقدمة تمثل ثلاث تجارب مستقلة. ب، مخطط Venn لعدد المعبر عنه تفاضليًا (FDR & lt 0.05) والنصوص المشتركة من ملفات تعريف التعبير الجيني لخلايا NK من في الجسم الحي L. monocytogenes- الفئران المتحدية (ن = 3 ، 3) و في المختبر مضاد لـ NKG2D - المنشط (ن = 3 ، 3) ثقافات. ج ، يتم التعبير عن النصوص المستهدفة المعروفة بشكل تفاضلي لـ NF-B و AP-1 في حالة عدم وجود ميرك 11 التي يتم مشاركتها بين خلايا NK من في الجسم الحي L. monocytogenes- الفئران المتحدية (ن = 3 ، 3) وفي الخلايا القاتلة الطبيعية التي تم تنشيطها في المختبر مع مكافحة NKG2D (ن = 3, 3). د، تم استخدام GSEA لإظهار ومقارنة مجموعة الأهداف الجينية التي يتم تنظيمها في اتجاه مجرى NF-B و TNFα في خلايا NK التي تم تنشيطها ضد NKG2D (ن = 3 ، 3) أو الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من L. monocytogenes- تحدي WT (ن = 3) و ميرك 11 −/− (ن = 3) الفئران. البيانات المقدمة عبارة عن تجميع لثلاث تجارب مستقلة.

بعد ذلك ، قمنا بمقارنة ملفات تعريف التعبير الجيني من كل من مكتبات RNA-seq المصنوعة من خلايا NK التي تم تنشيطها باستخدام الخلايا المضادة لـ NKG2D و NK من L. monocytogenes- الفئران المصابة لتحديد الأهداف المشتركة والمشتركة. خلايا NK من L. monocytogenes- الفئران المتحدية (WT vs. ميرك 11 - / - الفئران) تحتوي على 6073 جينًا تم التعبير عنها تفاضليًا مقارنة بـ 628 جينًا تم التعبير عنها تفاضليًا في خلايا NK التي تم تحفيزها في المختبر مع مضادات NKG2D (WT مقابل. ميرك 11 - / - الفئران). كان هناك 446 جينًا تمت مشاركتها بين مكتبتي RNA-seq ، ومن المعروف أن العديد منها يتم تنظيمها نسبيًا بواسطة NF-B أو AP-1 أو كليهما (الشكل 5 ب). تضمنت هذه المجموعات المشتركة من الجينات السيتوكينات المسببة للالتهابات والكيموكينات. التعبير عن معظم الجينات المستهدفة في الخلايا القاتلة الطبيعية من ميرك 11 - / - تم تقليل الفئران بشكل ملحوظ ، مما يشير إلى ذلك ميرك 11 يعمل كمثبط مركزي لواحد أو أكثر من المنظمين السلبيين لمسارات تنشيط NF-B و AP-1 (الشكل 5C). أيضًا ، قمنا بتقييم إثراء مجموعة الجينات لمسارات استجابة NF-κB و TNFα. تم تحفيز تحليل الخلايا القاتلة الطبيعية أيضًا في المختبر بمضاد NKG2D أو مشتق من L. monocytogenesأظهرت الفئران المصابة أن هذه المسارات كانت ضعيفة بشكل كبير في الخلايا القاتلة الطبيعية التي تفتقر إليها ميرك 11 (FDR معدلة ص & lt 0.05) تم تحفيزه أيضًا في المختبر بمضاد NKG2D أو مشتق من L. monocytogenes- الفئران المصابة (الشكل 5 د). بشكل عام ، كشفت تحليلات RNA-seq على مستوى النسخ أن الجينات المستهدفة الأولية لـ ميرك 11 يتضمن تنظيم النسخ بواسطة NF-B و AP-1. الخلايا القاتلة الطبيعية من الفئران WT المصابة L. monocytogenes عرضت مجموعة الجينات المسببة للالتهاب مماثلة لتلك الخاصة بمرض الأمعاء الالتهابي المزمن البشري ، ومع ذلك ، فإن الخلايا القاتلة الطبيعية من ميرك 11 - / - تفتقر الفئران إلى هذا الملف الشخصي (الشكل التكميلي S5).

A20 و Cbl-b و Itch هي أهداف مباشرة لـ ميرك 11 في الفئران والبشر

اختبرنا ما إذا كانت إنزيمات deubiquitising و E3 ligases مع وظائف قريبة من الغشاء أهدافًا رئيسية لـ ميرك 11. قمنا بتحليل اثنين من الإنزيمات اللاكتيكية (A20 و Cyld) واثنين من ligases E3 (Cbl-b و Itch) مع أدوار ثابتة في إشارات NF-κB و AP-1 (53) في خارج الجسم الحي- الخلايا القاتلة الطبيعية المنقاة من الطحال بعد 48 ساعة L. monocytogenes عدوى. احتوت الخلايا القاتلة الطبيعية من الفئران WT غير المصابة على جميع البروتينات الأربعة (الشكل 6 أ). على L. monocytogenes العدوى ، وخلايا الطحال NK من الفئران WT قللت من التعبير عن Cbl-b و Cyld و Itch ، بينما ظل التعبير عن A20 غير قابل للكشف. خلايا NK من ميرك 11 - / - كان لدى الفئران المزيد من A20 و Cbl-b و Cyld و Itch بغض النظر عن حالة الإصابة. لقد تحققنا من صحة هذه النتائج في خلايا NK الطحالية المزروعة بـ IL2 والتي تم تنشيطها باستخدام مضاد NKG2D المرتبط باللوح. عبرت خلايا NK من WT والفئران الناقصة عن جميع البروتينات الأربعة ، لكن التعبير عن الأربعة كان أعلى في خلايا NK من ميرك 11 - / - الفئران (الشكل 6 ب).

ميرك 11 يستهدف أعضاء E3 ligases في خلايا NK من الفئران والبشر. أ، التعبير عن E3 ligases A20 و Cbl-b و Itch و Cyld في خلايا NK المعزولة حديثًا من WT (ن = 2) و ميرك 11 −/− (ن = 2) الفئران التالية L. monocytogenes عدوى. ب، التعبير عن ligases A20 و Cbl-b و Itch و Cyld E3 في خلايا NK المستزرعة IL15 بعد تنشيط مضاد لـ NKG2D (ن = 3, 3). ج ، التفاعلات المتوقعة بين 3 UTR للنصوص المشفرة A20 و Cbl-b و Itch و Cyld التي تحتوي على متواليات مستهدفة وأعضاء من ميرك 11. د، فحص مزدوج لوسيفيراز قياس نشاط miR-23a و miR-24-2 و miR-27a، أو مقلدات التحكم (CM) كنسبة من Renilla إلى اليراع luciferase على 3 UTR من الجينات المستهدفة المحددة في خلايا HEK293T بعد يومين من تعداء. يتم تطبيع البيانات للتحكم في 3 ′ UTR بالإضافة إلى عدم وجود حالة ميرنا. تم إجراء تعداء في ثلاث نسخ ، ويظهر المتوسط ​​مع الانحراف المعياري. ه ، التعبير القسري لأعضاء ميرك 11 الكتلة في الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية تعزز إنتاج IFNγ. إنتاج IFNγ بواسطة الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية الأولية المنقولة مع ناقلات الفيروسة البطيئة قبل miR للإنسان miR-23a أو miR-24-2 أو miR-27a أو سم. ثمان وأربعون ساعة بعد التنبيغ ، تمت زراعة الخلايا القاتلة الطبيعية مع خلايا K562 ، وتم تعداد النسبة المئوية لخلايا IFNγ + CD3ε - CD56 + NK داخل الخلايا. تم استخدام خلايا NK من إجمالي 4 أفراد أصحاء. البيانات المقدمة عبارة عن تجميع لثلاث تجارب مستقلة توضح المتوسط ​​مع الخطأ المعياري الذي تم الحصول عليه باستخدام unpaired ر اختبار (**، ص & lt 0.01 *** ، & lt 0.001).

التعرف على الارتباط الآلي بين ميرك 11 وهذه الروابط E3 ، قمنا بتحليل متواليات 3-UTR لـ A20 و Cbl-b و Cyld و Itch. باستخدام TargetScan ، وجدنا أن 3 ′ UTR لجميع ligases E3 الأربعة تحتوي على مواقع ربط متوقعة لعضو واحد أو أكثر من ميرك 11 (الشكل 6 ج). لتحديد ميرنا الذي استهدف تنفع 3 (A20) ، قمنا باستنساخ متواليات التفاعل المفترضة الخاصة بهم من مناطق 3-UTR في اتجاه مجرى اليراع لوسيفيراز الجين المراسل في ناقل تقرير pMIR. حددنا واستنسخنا منطقة واحدة واثنين وثلاثة واثنين من مناطق UTR بحجم 3 درجات تنفع 3، شبلب، سايلد، و حكة، على التوالي (الشكل 6 ج). تم نقل هذه التسلسلات أو مقلدات التحكم مع التعبير عن النواقل miRNA23a ، miRNA24-2، و miRNA27a في خلايا HEK293T. بعد 48 ساعة ، تم تحلل الخلايا وقياس نشاط اللوسيفيراز.

3 ′ UTR من Cblb احتوت على اثنين من المباريات بين 3216-3236 و 5879-5901 مستهدفة من قبل ميل -27 أ-3p و مير -23 أ-3p على التوالي. على الرغم من أن التسلسل القريب ل ميل -27 أ-3p احتوت على 13 نيوكليوتيد غير متجاور (من أصل 21) كانت مكملة ، ولم تكن قادرة على منع ترجمة لوسيفيراز. ومع ذلك ، فإن التسلسل البعيد الذي تم استهدافه من قبل مير -23 أ-3p مع مطابقة 7mer للبذور كانت وظيفية كما يتضح من انخفاض نشاط luciferase. 3 ′ UTR من سيرد احتوت على ثلاثة متواليات بين 3842-3864 و 4.031-4.051 و 5979-6000 nts ، وكلها كانت مستهدفة من قبل ميل -24-2-3 ص. ومع ذلك ، لا يمكن لأي من هؤلاء منع ترجمة لوسيفيراز. ميل 24-1، Paralog ميل -24-2يحتوي على تسلسل متطابق (54). 3 ′ UTR من حكة تحتوي على مجموعتين من المباريات بين 2،882-2،900 و 4649-4،669 نت التي تم استهدافها ميل -27 أ-3p و مير -23 أ-3p على التوالي. يشير دمج التسلسلات المستهدفة في 3′UTR من luciferase إلى أن ميل -27 أ-3p يمكن أن يقلل من ترجمة luciferase ولكن ليس مير -23 أ-3 ص. هكذا، miRNA23a خفضت بشكل كبير نشاط لوسيفيراز للناقل الذي يحتوي على 3 ′ UTR من تنفع 3. بصورة مماثلة، miRNA27a انخفاض نشاط لوسيفيراز من النواقل التي تحتوي على 3 متواليات UTR من أي منهما Cblb أو حكة (الشكل 6 د). مع ثلاثة متواليات مختلفة 3 ′ UTR من سيرد، لم نلاحظ أي انخفاض في نشاط لوسيفيراز ، مما يشير إلى ذلك ميرك 11 لا يجوز للأعضاء استهداف Cyld (الشكل 6D). هكذا، ميرك 11 يتحكم في نشاط A20 و Cbl-b و Itch في خلايا NK من خلال الارتباط بـ 3 UTR من النصوص الخاصة بهم وتنظيم ترجمتها.

لقد حققنا فيما إذا كانت هذه الآلية التنظيمية نشطة في الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية. قمنا بتنقية خلايا CD3ε - CD56 + NK من الخلايا أحادية النواة في الدم البشري المحيطي (PBMC) وقمنا بنقلها باستخدام نواقل lentiviral pLenti-TetCMV التي تشفر ما قبل miRs الفردية أو جميع ما قبل miRs الثلاثة التي تشفر أعضاء ميرك 11. تم تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام مضاد NKG2D المرتبط بالصفائح (1D11 ، 5 ميكروغرام / مل) لمدة 24 ساعة ، وتم تحديد كمية الخلايا الإيجابية IFNγ عن طريق قياس التدفق الخلوي. تحويل ما قبلmiR23a أو قبلميل -27 أ زيادة النسبة المئوية لخلايا IFNγ + NK مقارنةً بالنواقل الفارغة (الشكل 6E). من أصل 4 من PBMCs الفردية المنقولة مع ما قبلميل آر 24-2، أظهر واحد فقط زيادة في النسبة المئوية لخلايا IFNγ + NK. هذه النتائج تشير إلى ذلك ميرك 11 يمنع ترجمة إنزيمات deubiquitizing معينة أو E3 ligases للسماح بأقصى عتبة التنشيط.

ميرك 11 يزيد K63 polyubiquitination من TRAF6

لتحديد أدوار A20 و Cbl-b و Cyld و Itch كمثبطات لتنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية ، استخدمنا الفئران التي خرجت من جيناتها. كان العدد الإجمالي لخلايا الطحال NK أو التعبير عن KLRG1 بين الفئران بالضربة القاضية لعناصر التحكم WT الخاصة بهم قابلة للمقارنة (الشكل التكميلي S6A و S6B). خلايا الطحال NK من Tnfaip3 fl / fl Rosa Cre-ER تمت تربية الفئران باستخدام IL15 لمدة 7 أيام ، وفي اليوم الرابع ، تمت إضافة عقار تاموكسيفين إلى المزرعة للحث على حذف الأليلات المشفرة لـ A20. الخلايا القاتلة الطبيعية الطحالية من الفئران التي تفتقر Cblb ، سيرد، و حكة تم تحضيرها أيضًا عن طريق الزراعة باستخدام IL15. على الرغم من أن خلايا NK من ثلاثة من نماذج الضربة القاضية توسطت في سمية خلوية مماثلة ضد EL4 H60 و RMA / S و YAC1 مقارنةً بعناصر تحكم WT (الشكل التكميلي S6C) ، أظهرت خلايا NK بدون Cbl-b قتلًا متزايدًا. بعد ذلك ، قمنا بتحفيز خلايا NK المزروعة بـ IL15 مع مضادات NKG2D المرتبطة بالصفائح لمدة 18 ساعة ، وتم تحليل المواد الطافية لـ IFNγ و GM-CSF و CCL3 و CCL4 و CCL5 (الشكل التكميلي S7). غياب تنفع 3، شبلب، سايلد، أو حكة زيادة كبيرة في توليد هذه السيتوكينات والكيموكينات ، وبالتالي تأكيد البيانات من ميرك 11 - / - الفئران ، مما يشير إلى أن هذه الآلية التنظيمية تؤثر بشكل أساسي على إنتاج العوامل المسببة للالتهابات.

نقص في ميرك 11 يقلل K63 ويزيد تعدد تعدد K48 من TRAF6

يقوم K63-polyubiquitination لـ TRAF6 بتجنيد TAB2 و TAB3 ، اللذين ينشطان TAK1 (55) لتنشيط NF-κB (56) في النهاية. قمنا بفحص تواجد TRAF6 في كل مكان في الخلايا القاتلة الطبيعية بعد التنشيط المضاد لـ NKG2D mAb بوساطة الترسيب المناعي من محللات الخلايا القاتلة الطبيعية واستكشفنا انتشار K63 و K48. لاحظنا سلمًا للكتلة الجزيئية العالية لـ K63-polyubiquitinated TRAF6 في WT (الشكل 7A ، الممرات 1 و 2) ولكن ليس ميرك 11 - / - خلايا NK (الشكل 7 أ ، الممران 3 و 4). ومع ذلك ، لم يحتوي TRAF6 على أي تعدد ذرات K48 في خلايا WT NK (الشكل 7B ، الممران 1 و 2) ولكنه كان وفيرًا في ميرك 11 - / - خلايا NK (الشكل 7 ب ، الممرات 3 و 4). تم زيادة انتشار K63 لـ RIP1 في خلايا WT NK ولكن ليس في ميرك 11 - / - خلايا NK (الشكل 7C). لقد تحققنا من تعديل TRAF2 بعد التنشيط ولم نلاحظ أي تغيير في تواجد K63 (الشكل 7D ، الممرات 1-4) ، مما يشير إلى أن TRAF6 هو الهدف الأساسي لقمع A20- و Cyld- و Cbl-b و Itch بوساطة إنتاج السيتوكين.

عدم وجود ميرك 11 يقلل K63 ويزيد تعدد تعدد K48 من TRAF6. أ، خلايا NK المستزرعة IL15 (ن = 2 ، 2) باستخدام مضاد NKG2D ، تم تحصين TRAF6 مناعياً ، وتم تحليل مدى تعدد التكاثر K63. ب، تم تحليل TRAF6 المناعي لمدى تعدد التكاثر K48 (ن = 2, 2). ج ، تم تنشيط خلايا NK المزروعة بـ IL15 باستخدام مضاد NKG2D لمدة 15 دقيقة ، وتم تحصين RIP1 ، وتم تحليل مدى تعدد التكاثر K63 (ن = 2, 2). د، تم تنشيط خلايا NK المستنبتة من IL15 باستخدام مضاد لـ NKG2D لمدة 15 دقيقة ، وتم تحصين TRAF2 ، ويظهر مدى تعدد التكاثر K63 (ن = 2, 2). ه ، تم تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية المستزرعة IL15 مع مضادات NKG2D في وجود إما متحولة K63 أو بروتينات K48 ubiquitin المتحولة. بعد ثمانية عشر ساعة من التنشيط ، تم تحليل المواد الطافية لإنتاج السيتوكينات المشار إليها (ن = 3 ، 3). البيانات عبارة عن تجميع لثلاث تجارب مستقلة ترسم المتوسط ​​، مع أشرطة الخطأ التي تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​الذي يحلل النتائج باستخدام قيمة غير مقترنة ر اختبار (**، ص & lt 0.01 *** ، & lt0.001).

لتأكيد هذه النتائج ، قمنا باحتضان خلايا NK المزروعة بـ IL15 مع بروتينات K63 المتحولة أو بروتينات يوبيكويتين K48 المتحولة التي لا يمكن أن تشكل سلاسل بوليوبيكويتين مع جزيئات يوبيكويتين الأخرى (57). لقد قمنا بتجميع خلايا NK مع يوبيكويتين K63R أو K48R ، وتم تنشيطها باستخدام مضاد لـ NKG2D ، وحددنا كمية IFNγ. حضانة الخلايا القاتلة الطبيعية من WT ولكن ليس ميرك 11 - / - الفئران مع K63R قللت بشكل كبير من إنتاج IFNγ و TNFα و GM-CSF و CCL4 و CCL5 (الشكل 7E). إضافة K48R إلى خلايا NK من WT ولا ميرك 11 - / - عززت الفئران إنتاج هذه السيتوكينات. هكذا، ميرك 11 يستهدف مؤقتًا هذه الليجازات E3 ويسكتها أثناء المرحلة النشطة من التحفيز بوساطة المستقبلات ، والذي مكّن من إنتاج العوامل المسببة للالتهاب بوساطة الخلايا القاتلة الطبيعية بشكل مثالي.


النتائج

يلعب PKD1 ، ولكن ليس PKD2 ، دورًا مهمًا في تكوين الجنين لدى الفئران

إن كينازات سيرين PKD عبارة عن بروتينات كبيرة تشتمل على مجالات تفاعل متعددة ، بما في ذلك مناطق ربط البروتينات والبروتينات والدهون ، ولديها القدرة على العمل كسقالات. لاستكشاف الدور الفسيولوجي لـ PKD2 في الجسم الحي، لذلك قررنا إنتاج الفئران حيث تم استبدال أليلات PKD2 من النوع البري بأليلات متحولة ترميز بدائل ألانين لـ Ser 707 و Ser 711 في منطقة حلقة تنشيط المجال الحفزي PKD. تعتبر الفسفرة لهاتين المتبقيين من السيرين أمرًا بالغ الأهمية للنشاط التحفيزي PKD2 [36] ، وبالتالي تسمح دراسات الفئران PKD2 SSAA بتقييم أهمية النشاط التحفيزي PKD2 في الجسم الحي مع تجاوز أي تأثير لإزالة وظيفة السقالة في PKD2. وفقًا لذلك ، تم ضرب طفرات PKD2 S707A و S711A في النوع البري Prkd2 الموضع في الخلايا الجذعية الجنينية للفأر عن طريق إعادة التركيب المتماثل. تم استخدام الخلايا ES الناتجة لاشتقاق الفئران التي تعبر عن PKD2 SSAA تحت سيطرة مروجها الطبيعي (الشكل 1). أظهرت الدراسات السابقة أن الحذف المتماثل للأليلات PKD1 يسبب الموت الجنيني [24]. في تناقض صارخ ، كانت الفئران المتماثلة الزيجوت PKD2 SSAA -knockin قابلة للحياة وخصبة ولا يمكن تمييزها ظاهريًا عن زملائها من النوع البري (الشكل 1C والنتائج غير معروضة). هذا يشير إلى أن التطور الجنيني الطبيعي لا يتأثر بفقدان الوظيفة التحفيزية PKD2.

جيل من الفئران مع طفرة PKD2 الضربة القاضية

(أ) تصوير الفأر الداخلي Prkd2 الأليل الذي يحتوي على exons 10-18 ، وتركيب knockin والأليل المستهدف مع شريط neomycin الذي تمت إزالته بواسطة كري recombinase. تمثل المستطيلات السوداء / الرمادية exons وتمثل رؤوس الأسهم السوداء LoxP المواقع. تشير الخطوط السوداء السميكة إلى مواقع المجسات المستخدمة لتحليل اللطخة الجنوبية. يتم توضيح أليل الضربة القاضية الذي يحتوي على طفرة Ser 707 / Ser 711 في إكسون 16 كمستطيل رمادي. (بتم تحديد الأنماط الجينية للفئران المتحولة PKD2 SSAA عن طريق تضخيم PCR للحمض النووي الجيني. يولد الأليل من النوع البري منتجًا بقوة 236 نقطة أساس ، في حين أن أليل الضربة يولد منتجًا بقوة 344 نقطة أساس. ناتج أليل الضربة الأكبر يرجع إلى وجود 108 نقطة أساس LoxP الموقع والمنطقة المحيطة ، والتي تظل في منطقة intronic بعد الاستئصال المتوسّط لـ Cre لكاسيت اختيار النيومايسين. (ج) تم إعداد تزاوج متغاير الزيجوت لفئران PKD2 SSAA وتم التنميط الجيني للنسل كما هو موضح في قسم المواد والطرق. عدد (والنسبة المئوية) لكل نمط وراثي تمت ملاحظته متبوعًا بالتردد المندلي المتوقع. ص= 0.482 (اختبار χ 2).

(أ) تصوير الفأر الداخلي Prkd2 الأليل الذي يحتوي على exons 10-18 ، وتركيب knockin والأليل المستهدف مع شريط neomycin الذي تمت إزالته بواسطة كري recombinase. تمثل المستطيلات السوداء / الرمادية exons وتمثل رؤوس الأسهم السوداء LoxP المواقع. تشير الخطوط السوداء السميكة إلى مواقع المجسات المستخدمة لتحليل اللطخة الجنوبية. يتم توضيح أليل الضربة القاضية الذي يحتوي على طفرة Ser 707 / Ser 711 في إكسون 16 كمستطيل رمادي. (بتم تحديد الأنماط الجينية للفئران المتحولة PKD2 SSAA عن طريق تضخيم PCR للحمض النووي الجيني. يولد الأليل من النوع البري منتجًا بقوة 236 نقطة أساس ، في حين أن أليل الضربة يولد منتجًا بقوة 344 نقطة أساس. ناتج أليل الضربة الأكبر يرجع إلى وجود 108 نقطة أساس LoxP الموقع والمنطقة المحيطة ، والتي تظل في منطقة intronic بعد الاستئصال المتوسّط لـ Cre لكاسيت اختيار النيومايسين. (ج) تم إعداد تزاوج متغاير الزيجوت لفئران PKD2 SSAA وتم تنميط السلالة الجينية كما هو موضح في قسم المواد والطرق. عدد (والنسبة المئوية) لكل نمط وراثي تمت ملاحظته متبوعًا بالتردد المندلي المتوقع. ص= 0.482 (اختبار χ 2).

نظرنا في احتمال أن تكون الكمية الصغيرة من النشاط التحفيزي المتبقي لا تزال موجودة في البروتين المتحور PKD2 SSAA (انظر الشكل 4 أ) قد تكون كافية للسماح بالتطور الجنيني الطبيعي. لذلك ، للتحقق من صحة فرضيتنا ، أنشأنا نموذجين إضافيين من الفئران المتحولة PKD. الأول كان يحتوي على أليلات PKD1 من النوع البري تم استبدالها بأليلات PKD1 المتحولة التي تفتقر إلى مواقع الفسفرة السيرين المعتمدة على PKC ، Ser 744 و Ser 748 (الشكل 2A). لقد أنشأنا أيضًا الفئران التي تعاني من نقص PKD2 (الفئران PKD2 GT) باستخدام خط خلية ES يحتوي على كاسيت مصيدة جيني تم إدخاله في Prkd2 موضع (الشكل 2C). أكد تحليل تسلسل الحمض النووي الخاص بنا لخط الخلايا الجذعية الجنينية هذا أن خط الخلية يحتوي فقط على كاسيت مصيدة جيني واحد ، يقع داخل PKD2 المكان. قمنا بتعيين موقع إدخال مصيدة الجينات إلى intron 15 ، مما يعطل المجال الحفاز لـ PKD2 ويزيله (الشكل 2C). الأهم من ذلك ، ولدت الفئران PKD2 GT / GT بالتردد الطبيعي المتوقع (الشكل 2E) وكانت قابلة للحياة وخصبة ولا يمكن تمييزها ظاهريًا عن زملائها من النوع البري. على النقيض من ذلك ، عندما تم التعرف بسهولة على الفئران حديثي الولادة من النوع البري وغير المتجانسة ، ولكن ليس الفئران PKD1 SSAA متجانسة الزيجوت ، (الشكل 2E). من بين 177 ولادة حية تمت ملاحظتها ، كان اثنان من الفئران متماثلين في أليل PKD1 SSAA (

1٪). يشير هذا إلى أن التعبير المتماثل عن أليل PKD1 SSAA يسبب الموت الجنيني مع اختراق غير كامل. يتوافق هذا مع تقرير أولسون وزملائه بأن حذف exons 12-14 من PKD1 ، والذي يقضي على المجال التحفيزي PKD1 ، يسبب أيضًا فتكًا جنينيًا مع اختراق غير كامل [24]. كشف تحليل مرحلة التطور الجنيني التي تتطلب نشاطًا تحفيزيًا لـ PKD1 أنه يمكن تحديد الترددات المندلية الطبيعية لأجنة PKD1 SSAA المتماثلة اللواقح قبل اليوم 9.5 من التطور الجنيني ، ولكن ليس لاحقًا (الشكل 2E). ومن ثم فإن غالبية الأجنة مع بدائل متماثلة اللواقح لأليلات PKD1 SSAA يموت في وقت مبكر من التنمية. بشكل جماعي ، توضح هذه النتائج أن النشاط التحفيزي لـ PKD1 ، ولكن ليس PKD2 ، ضروري للتكوين الجنيني الطبيعي للفأر.

جيل من الفئران الطافرة PKD2 الجينية والفئران المتحولة PKD1-knockin

(أ) تصوير الفأر الداخلي Prkd1 الأليل الذي يحتوي على exons 15–17 ، وتركيب knockin والأليل المستهدف مع شريط neomycin الذي تمت إزالته بواسطة كري recombinase. تمثل المستطيلات البيضاء / الرمادية exons وتمثل رؤوس الأسهم السوداء LoxP المواقع. تشير الخطوط السوداء السميكة إلى مواقع المجسات المستخدمة لتحليل اللطخة الجنوبية. يتم توضيح أليل الضربة القاضية الذي يحتوي على طفرة Ser 744 / Ser 748 في إكسون 16 كمستطيل رمادي. (ب) تم التنميط الجيني لفئران PKD1 SSAA -knockin عن طريق تضخيم PCR للحمض النووي الجيني على موقع إدخال LoxP كما هو موضح في قسم المواد والطرق. (ج) تصوير النوع البري Prkd2 الأليل والجينات المستهدفة بالفخ Prkd2 الأليل الموجود في خط الخلايا E14Tg2a.4 ES. يعطل هذا الإدراج بنية المجال الحفاز ويحذف العديد من الأشكال الرئيسية المهمة للحفز وربط الركيزة (أشكال DFG و APE) بالإضافة إلى مواقع الفسفرة Ser 707 و Ser 711 المهمة لتنشيط PKD2. (د) تم تنميط الفئران PKD2 GT بواسطة تضخيم PCR للحمض النووي الجيني كما هو موضح في قسم المواد والطرق. (ه) تم إعداد التزاوج غير المتجانسة لفئران PKD2 GT وللفئران PKD1 SSAA ، وتم توصيف السلالة الحية وأجنة PKD1 SSAA-knockin كما هو موصوف في قسم المواد والطرق. يتم عرض العدد (والنسبة المئوية) لكل نمط وراثي تمت ملاحظته ، متبوعًا بالتردد المندلي المتوقع. تم تحليل البيانات باستخدام اختبار χ 2 لتحديد الأهمية الإحصائية.

(أ) تصوير الفأر الداخلي Prkd1 الأليل الذي يحتوي على exons 15-17 ، وتركيب القرقعة والأليل المستهدف مع كاسيت النيومايسين الذي تمت إزالته بواسطة كري recombinase. تمثل المستطيلات البيضاء / الرمادية exons وتمثل رؤوس الأسهم السوداء LoxP المواقع. تشير الخطوط السوداء السميكة إلى مواقع المجسات المستخدمة لتحليل اللطخة الجنوبية. يتم توضيح أليل الضربة القاضية الذي يحتوي على طفرة Ser 744 / Ser 748 في إكسون 16 كمستطيل رمادي. (بتم تنميط الفئران PKD1 SSAA-knockin عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي الجيني فوق موقع إدخال LoxP كما هو موضح في قسم المواد والطرق. (ج) تصوير النوع البري Prkd2 الأليل والجينات المستهدفة بالفخ Prkd2 الأليل الموجود في خط الخلايا E14Tg2a.4 ES. يعطل هذا الإدراج بنية المجال الحفاز ويحذف العديد من الأشكال الرئيسية المهمة للحفز وربط الركيزة (أشكال DFG و APE) بالإضافة إلى مواقع الفسفرة Ser 707 و Ser 711 المهمة لتنشيط PKD2. (د) تم التنميط الجيني لفئران PKD2 GT عن طريق تضخيم PCR للحمض النووي الجيني كما هو موضح في قسم المواد والطرق. (ه) تم إعداد التزاوج غير المتجانسة لفئران PKD2 GT وللفئران PKD1 SSAA ، وتم توصيف السلالة الحية وأجنة PKD1 SSAA-knockin كما هو موصوف في قسم المواد والطرق. يتم عرض العدد (والنسبة المئوية) لكل نمط وراثي تمت ملاحظته ، متبوعًا بالتردد المندلي المتوقع. تم تحليل البيانات باستخدام اختبار χ 2 لتحديد الأهمية الإحصائية.

أنماط التعبير PKD1 و PKD2 في الفئران البالغة

يشير تحليل قواعد بيانات التعبير الجيني / EST (علامة التسلسل المعبر عنها) إلى أن العديد من أنسجة البالغين تظهر تعبيرًا مشتركًا عن الأشكال الإسوية PKD المختلفة على مستوى مرنا (الشكل 3 أ). ومع ذلك ، فإن التعبير النسبي لأشكال PKD المحددة على مستوى البروتين في الأنسجة والخلايا المختلفة غير محدد جيدًا. في سياق PKD1 و PKD2 ، وهما متماثلان للغاية ، فإن معظم الأجسام المضادة المتولدة ضد هذه الكينازات لا يمكنها التمييز بين الشكلين الإسويين. على سبيل المثال ، تم رفع مضادات PKD الأكثر شيوعًا المستخدمة للكشف عن PKD1 في مجموعة متنوعة من الأنسجة مقابل تسلسل الببتيد EEREMKALSERVSIL (المقابلة للأحماض الأمينية 904-918 في PKD1 الفئران) ، ولكنها تتفاعل بشكل جيد مع PKD2. في تحليل SDS / PAGE ، من الممكن نظريًا التمييز بين PKD1 و PKD2 على أساس الاختلافات الدقيقة في حركتهما الكهربيّة [10]. ومع ذلك ، نظرًا لأن التنقل الكهربي للأشكال الإسوية PKD يمكن تغييره عن طريق فسفرة البروتين [37] ، فلا يمكن استخدام الترحيل التفاضلي على المواد الهلامية SDS / PAGE كمعيار موثوق به للتمييز بين PKD1 وتعبير PKD2.

التعبير التفاضلي للأشكال الإسوية PKD1 و PKD2 في الأنسجة البالغة

(أ) Prkd1, Prkd2 و Prkd3 تحليل التعبير الجيني في أنسجة الفئران البالغة. تم تنزيل بيانات تعبير mRNA في مجموعة بيانات GeneAtlas MOE430 (gcrma) من مركز بوابة الجينات BioGPS (http://www.biogps.gnf.org) وتم التعبير عنها كتغيير أضعاف في التعبير في الأنسجة المشار إليها ، مقارنةً بتلك المعبر عنها في خلايا NIH 3T3. (ب) تحليل اللطخة الغربية لتعبير PKD1 و PKD2 و Akt في النوع البري مقارنة بالخلايا thymocytes PKD2 GT / GT. تمثل البقع ثلاث تجارب منفصلة أو أكثر. يشار إلى الكتل الجزيئية في kDa. (ج) تحليل اللطخة الغربية لتعبير PKD1 و PKD2 و Akt في النوع البري مقارنة بأنسجة البالغين PKD2 GT / GT. البقع هي من اثنين من الفئران المنفصلة PKD2 SSAA / SSAA وزملائهم من النوع البري. تشير الأسهم المغلقة إلى أسهم PKD2 المفتوحة والتي تشير إلى PKD1.

(أ) Prkd1, Prkd2 و Prkd3 تحليل التعبير الجيني في أنسجة الفئران البالغة.تم تنزيل بيانات تعبير mRNA في مجموعة بيانات GeneAtlas MOE430 (gcrma) من مركز بوابة الجينات BioGPS (http://www.biogps.gnf.org) وتم التعبير عنها كتغيير أضعاف في التعبير في الأنسجة المشار إليها ، مقارنةً بتلك المعبر عنها في خلايا NIH 3T3. (ب) تحليل اللطخة الغربية لتعبير PKD1 و PKD2 و Akt في النوع البري مقارنة بالخلايا thymocytes PKD2 GT / GT. تمثل البقع ثلاث تجارب منفصلة أو أكثر. يشار إلى الكتل الجزيئية في kDa. (ج) تحليل اللطخة الغربية لتعبير PKD1 و PKD2 و Akt في النوع البري مقارنة بأنسجة البالغين PKD2 GT / GT. البقع هي من اثنين من الفئران المنفصلة PKD2 SSAA / SSAA وزملائهم من النوع البري. تشير الأسهم المغلقة إلى أسهم PKD2 المفتوحة والتي تشير إلى PKD1.

في هذا الصدد ، لن يتم التعبير عن exons الذي يشفر منطقة البروتين التي تم التعرف عليها بواسطة antisera pan-PKD في الفئران PKD2 GT / GT. وفقًا لذلك ، سيسمح تحليل اللطخة الغربية باستخدام مضادات PKD للأنسجة من النوع البري مقارنة بفئران PKD2 GT / GT بتقييم الأنسجة البالغة التي تعبر عن PKD1 و PKD2. يكشف تحليل اللطخة الغربية لمقتطفات الأنسجة اللمفاوية من فئران PKD2 GT / GT ، ولا سيما الغدة الصعترية (الشكل 3 ب) والعقد الليمفاوية والطحال (الشكل 3 ج) ، أن هذه الأنسجة لا تحتوي على أي بروتين متفاعل مع مضاد pkd1 / 2 الشامل ، يشير إلى أن الخلايا اللمفاوية التائية والبائية ، التي تشكل غالبية الخلايا داخل هذه الأنسجة ، تعبر على وجه التحديد عن PKD2 ، ولكن ليس PKD1. في المقابل ، يتسبب حذف PKD2 في خسارة قليلة أو معدومة من إجمالي بروتين PKD1 / 2 في الدماغ أو البنكرياس ، ولكنه يقلل من مستويات بروتينات PKD1 / 2 الإجمالية في القلب والكلى (الشكل 3C). ومن ثم يتم التعبير عن PKD1 و PKD2 بشكل مشترك في العديد من أنسجة البالغين ، وإن كان ذلك بمستويات مختلفة ، ولكن هناك استثناء واحد في الخلايا اللمفاوية ، والتي يبدو أنها تعبر فقط عن PKD2.

PKD2 هو الشكل الإسفنجي الرئيسي لـ PKD المعبر عنه في الخلايا الليمفاوية الفأرية

تم تأكيد البيانات التي تشير إلى أن PKD2 ، ولكن ليس PKD1 ، يتم التعبير عنه بشكل انتقائي في الخلايا الليمفاوية في الفئران البالغة. في المختبر فحوصات كيناز ، بمقارنة النشاط التحفيزي PKD1 / 2 الإجمالي في الخلايا التوتية من النوع البري و PKD2 GT / GT. تم الكشف عن الفسفرة الركيزة الببتيدية كبيرة في PKD1 / 2 المناعية المحضرة من الخلايا thymocytes من النوع البري الذي يتم تنشيطه بواسطة phorbol-ester ، ولكن ليس في تلك المحضرة من الخلايا thymocytes PKD2 GT / GT (الشكل 4A). علامة أخرى جيدة التوصيف للنشاط التحفيزي الداخلي PKD1 / PKD2 هي حالة الفسفرة لموقع الفسفرة الذاتية المحمي بالطرف C (Ser 916 في PKD1 Ser 873 في PKD2). كما هو مبين في الشكل 4 (ب) ، من النوع البري الذي يتم تنشيطه بواسطة phorbol-ester ، ولكن ليس PKD2 GT / GT ، تحتوي الخلايا thymocytes على بروتينات PKD1 / 2 النشطة ذاتية الفسفرة.

PKD2 هو الشكل الإسفنجي السائد PKD المعبر عنه في الأنسجة والخلايا اللمفاوية الفأرية

(أ) النشاط التحفيزي العالمي PKD1 / 2 في الخلايا التوتية المتحولة من النوع البري و PKD2. تم ترسيب بروتينات PKD1 / 2 من الخلايا thymocytes المُفعَّلة بفوربول-استر باستخدام أمصال pan-PKD1 / 2 [33] قبل قياس النشاط التحفيزي PKD في في المختبر فحوصات كينازات الركيزة الببتيدية ، كما هو موضح في قسم المواد والطرق. البيانات مأخوذة من ثمانية من النوع البري ، وثمانية PKD2 GT / GT وستة PKD2 SSAA / SSAA thymi ، تم تقييمها في ثلاث تجارب منفصلة. النتائج تعني + S.E.M. تم حساب الدلالة الإحصائية بواسطة الطالب ر اختبار. (ب(PKD1 / 2 autophosphorylation على Ser 916 و Ser 873 على التوالي في مقتطفات الخلية الكاملة المحضرة من مجموعة التحكم و phorbol-ester المنشط من النوع البري ، متغاير الزيجوت ومتماثل الزيجوت PKD2 GT و PKD2 SSAA thymocytes. البقع تمثل تجربتين مستقلتين. (ج) تحليل حلقة تنشيط PKD و فسفرة ERK1 / 2 في مستخلصات الخلية الكاملة المحضرة من الخلايا الطحالية من النوع البري PKD2 GT / GT و PKD2 SSAA / SSAA المفعلة باستخدام phorbol ester لمدة 15 دقيقة. وقد لوحظت نتائج مماثلة في الخلايا التوتية المنشطة بفوربول-استر. (د) حلقة تنشيط PKD و Ser 916 phosphorylation في النوع البري ، PKD1 - / - و PKD3 - / - DT40 B-cells المفعلة باستخدام phorbol ester لمدة 15 دقيقة. (ه) تحليل الفسفرة حلقة تفعيل PKD في PKD3 المناعية المحضرة من الخلايا التوتية من النوع البري غير المعالج و phorbol-ester المنشط و PKD2 GT / GT. (Fتعبير PKD3 والنشاط التحفيزي في الخلايا اللمفاوية الأولية من النوع البري ومتماثلة اللواقح PKD2 GT و PKD2 SSAA. تم تحصين بروتينات PKD3 من الخلايا التوتية المنشطة بفوربول-استر باستخدام جسم مضاد محدد لـ PKD3 [34] قبل قياس النشاط التحفيزي PKD3 في في المختبر فحوصات كينازات الركيزة الببتيدية ، كما هو موضح في قسم المواد والطرق. النتائج من أربعة إلى ستة من النوع البري ، PKD2 GT / GT و PKD2 SSAA / SSAA thymi ، تم تقييمها في ثلاث تجارب منفصلة وهي وسيلة + S.E.M. تلاميذ ر تم استخدام الاختبار لحساب الدلالة الإحصائية.

(أ) النشاط التحفيزي العالمي PKD1 / 2 في الخلايا التوتية المتحولة من النوع البري و PKD2. تم ترسيب بروتينات PKD1 / 2 من الخلايا thymocytes المُفعَّلة بفوربول-استر باستخدام أمصال pan-PKD1 / 2 [33] قبل قياس النشاط التحفيزي PKD في في المختبر فحوصات كينازات الركيزة الببتيدية ، كما هو موضح في قسم المواد والطرق. البيانات مأخوذة من ثمانية من النوع البري ، وثمانية PKD2 GT / GT وستة PKD2 SSAA / SSAA thymi ، تم تقييمها في ثلاث تجارب منفصلة. النتائج تعني + S.E.M. تم حساب الدلالة الإحصائية بواسطة الطالب ر اختبار. (ب(PKD1 / 2 autophosphorylation على Ser 916 و Ser 873 على التوالي في مقتطفات الخلية الكاملة المحضرة من مجموعة التحكم و phorbol-ester المنشط من النوع البري ، متغاير الزيجوت ومتماثل الزيجوت PKD2 GT و PKD2 SSAA thymocytes. البقع تمثل تجربتين مستقلتين. (ج) تحليل حلقة تنشيط PKD و فسفرة ERK1 / 2 في مستخلصات الخلية الكاملة المحضرة من الخلايا الطحالية من النوع البري PKD2 GT / GT و PKD2 SSAA / SSAA المفعلة باستخدام phorbol ester لمدة 15 دقيقة. وقد لوحظت نتائج مماثلة في الخلايا التوتية المنشطة بفوربول-استر. (د) حلقة تنشيط PKD و Ser 916 phosphorylation في النوع البري ، PKD1 - / - و PKD3 - / - DT40 B-cells المفعلة باستخدام phorbol ester لمدة 15 دقيقة. (ه) تحليل الفسفرة حلقة تنشيط PKD في PKD3 المناعية المحضرة من الخلايا الزعترية من النوع البري غير المعالج و phorbol-ester المنشط و PKD2 GT / GT. (Fتعبير PKD3 والنشاط التحفيزي في الخلايا اللمفاوية الأولية من النوع البري ومتماثلة اللواقح PKD2 GT و PKD2 SSAA. تم تحصين بروتينات PKD3 من الخلايا التوتية المنشطة بفوربول-استر باستخدام جسم مضاد محدد لـ PKD3 [34] قبل قياس النشاط التحفيزي PKD3 في في المختبر فحوصات كينازات الركيزة الببتيدية ، كما هو موضح في قسم المواد والطرق. النتائج من أربعة إلى ستة من النوع البري ، PKD2 GT / GT و PKD2 SSAA / SSAA thymi ، تم تقييمها في ثلاث تجارب منفصلة وهي وسيلة + S.E.M. تلاميذ ر تم استخدام الاختبار لحساب الدلالة الإحصائية.

قمنا أيضًا بفحص إجمالي النشاط التحفيزي PKD1 / 2 في الخلايا الليمفاوية المتقنة PKD2 SSAA. لم يكن هناك فقدان لتعبير بروتين PKD2 في الخلايا الليمفاوية PKD2 SSAA متماثلة اللواقح ، ولكن النشاط الحفاز الكلي PKD1 / 2 كان ضعيفًا بشدة ، كما تم تقييمه بواسطة في المختبر فحوصات كيناز لبروتينات PKD2 المناعية من النوع البري المحفز بفوربول استر مقارنة مع الخلايا الثيموسيتية PKD2 SSAA / SSAA (الشكل 4A). علاوة على ذلك ، لا يمكن للبروتينات الطافرة PKD2 SSAA أن تتسبب في الفسفرة التلقائية بشكل فعال على Ser 873 استجابةً لتحفيز إستر phorbol (الشكل 4B). ومع ذلك ، اكتشفنا كمية صغيرة من النشاط التحفيزي PKD1 / 2 المتبقي في الخلايا الثيموسيتية PKD2 SSAA / SSAA المنشطة مقارنة بالخلايا thymocytes PKD2 GT / GT. نظرًا لأن الخلايا الليمفاوية لا تعبر عن PKD1 (انظر أعلاه) ، يمكن على ما يبدو إحداث مستويات منخفضة من النشاط التحفيزي PKD2 في الخلايا التوتية المتحولة PKD2 SSAA بشكل مستقل عن الفسفرة بوساطة PKC للمجال التحفيزي PKD2.

اللافت للنظر ، لاحظنا أنه على الرغم من أن علاج phorbol ester تسبب في حدوث فسفرة حلقة تنشيط PKD كبيرة في الخلايا الليمفاوية من النوع البري ، إلا أن هذا لم يكن قابلاً للاكتشاف في مستخلصات الخلايا الكاملة المحضرة من phorbol-ester-stimulated PKD2 SSAA / SSAA أو PKD2 GT / GT اللمفاويات ، على الرغم من الطبيعي تحريض الفسفرة ERK1 / 2 (كيناز 1/2 منظم خارج الخلية) (الشكل 4 ج). كان هذا مفاجئًا حيث يتم التعبير عن PKD3 في الخلايا الليمفاوية للثدييات [34] (الشكل 4E) ويتم حفظ مقطع حلقة تنشيط PKD بالكامل في جميع الأشكال الإسوية الثلاثة للثدييات PKD. ومن ثم ، يجب أن تتفاعل الأجسام المضادة الخاصة بالفوسفو الخاصة بـ PKD بالتساوي مع PKD1 (تمت الفسفرة في Ser 744 / Ser 748) و PKD2 (تمت الفسفرة على Ser 707 / Ser 711) و PKD3 (تمت الفسفرة على Ser 730 / Ser 734). لتوضيح ما إذا كان الجسم المضاد الخاص بالفوسفو في حلقة تنشيط PKD يمكنه بالفعل اكتشاف بروتينات PKD3 الفسفورية النشطة ، قمنا بتحليل الخلايا الليمفاوية B-DT40 B الطيرية ، والتي يُعرف عنها أنها تعبر عن PKD3 و PKD1 بمستويات متساوية تقريبًا ، ولكنها لا تعبر عن PKD2 [4]. تُظهر البيانات الواردة في الشكل 4 (د) أن حذف PKD1 في الخلايا اللمفاوية DT40 B يؤدي إلى خسارة كاملة للفسفرة PKD1 Ser 916 ، ولكن فقط انخفاض 2-3 أضعاف في إجمالي مستويات الفسفرة في حلقة تنشيط PKD ، بعد تحفيز phorbol ester . وبالمثل ، في خلايا PKD3 - / - DT40 ، لم يكن هناك تغيير في الفسفرة PKD1 Ser 916 ومرة ​​أخرى فقط انخفاض 2-3 أضعاف في مستويات الفسفرة في حلقة تنشيط PKD بعد تحفيز إستر phorbol (الشكل 4D). وهكذا يمكن للأجسام المضادة الخاصة بالفوسفو في حلقة تنشيط PKD أن تكتشف بكفاءة عالية PKD3 الفسفوري النشط في الخلايا التي تعبر عن مستويات عالية من بروتين PKD3. في الواقع ، عندما قمنا بتحصين بروتينات PKD3 المناعية من الخلايا thymocytes PKD2 GT / GT التي يتم تنشيطها بواسطة phorbol-ester ، تمكنا الآن من اكتشاف الفسفرة حلقة التنشيط PKD3 (الشكل 4E). وفقًا لذلك ، فإن الفشل في اكتشاف أي فسفرة حلقة تنشيط PKD في مستخلصات الخلية الكاملة المحضرة من الخلايا الليمفاوية المتحولة PKD2 يجادل بأن PKD3 لا يقدم مساهمة كمية كبيرة في إجمالي تجمع بروتين PKD في الخلايا / الأنسجة اللمفاوية الفئران.

على الرغم من أن تعبير بروتين PKD3 منخفض جدًا في الخلايا الليمفاوية الفأرية ، كان من المهم تقييم ما إذا كان فقدان النشاط التحفيزي PKD2 له أي تأثير على تعبير أو نشاط PKD3. لذلك قمنا بترشيح PKD3 المناعي من الخلايا التوتية المتحولة من النوع البري المحفز بفوربول-استر و PKD2. في هذه التجارب ، وجدنا أن مستويات التعبير PKD3 والنشاط التحفيزي كانت طبيعية في الخلايا الثيموسيتية من النوع البري PKD2 GT / GT و PKD2 SSAA / SSAA (الشكل 4F). وبالتالي لا يتم تعويض فقدان تعبير PKD2 و / أو النشاط التحفيزي في الخلايا الليمفاوية عن طريق زيادة التعبير / النشاط للأشكال الإسوية PKD الأخرى. ولا يوجد أي دليل على أن التعبير عن PKD2 الخامل تحفيزيًا له أي تأثير سلبي سائد على تعبير PKD3 أو نشاطه.

يمكن الاستغناء عن PKD2 لتطوير الخلايا الليمفاوية التائية الناضجة

نظرًا لأن PKD2 هو الشكل الإسفنجي الرئيسي لـ PKD المعبر عنه في الغدة الصعترية وفي الخلايا الليمفاوية التائية الناضجة (النتائج غير معروضة) ، سألنا عما إذا كانت الوظيفة التحفيزية PKD2 ضرورية لتطور الخلايا اللمفاوية التائية بشكل طبيعي. أظهرت الدراسات السابقة أنه يمكن تنشيط PKD عن طريق ما قبل TCR في أسلاف الخلايا التائية في الغدة الصعترية وبواسطة مجمع α / β TCR الناضج في الخلايا التائية الطرفية [30،33]. حتى الآن ، استخدمت التجارب التي تستكشف عواقب نشاط PKD لوظيفة TCR تقنيات التحوير لاستهداف بروتين متحور PKD منشط (يشتمل على المجال الحفزي لـ PKD1) إما على الغشاء أو العصارة الخلوية لخلايا ما قبل التائية. توضح هذه التجارب أن إشارات PKD النشطة بشكل أساسي يمكن أن تحل محل ما قبل TCR لدفع تكاثر الخلايا التائية والتمايز في الفئران المعاد تركيبها-جين-عديم الجين [30]. ومع ذلك ، يمكن للتجارب مع طفرات اكتساب الوظيفة هذه أن تخبرنا عن القدرة الوظيفية لبروتين كينيز ، لكنها لا تقيم ما إذا كان الكيناز ضروريًا لعملية بيولوجية معينة.

لذلك قمنا بالتحقيق في تطوير الخلايا التائية في الفئران PKD2 GT / GT و PKD2 SSAA / SSAA باستخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد المجموعات السكانية الفرعية الرئيسية من الخلايا التائية الزعترية والطرفية. أسلاف الخلايا اللمفاوية التائية المبكرة في الغدة الصعترية هي DN لمستقبلات MHC المشتركة CD4 و CD8. تخضع أسلاف DN هذه لإعادة ترتيب موضع TCRβ لإنتاج بولي ببتيد TCRβ الذي يسمح بالتعبير عن سطح الخلية لمركب ما قبل TCR. ثم يدعم ما قبل TCR البقاء والتوسع النسيلي السريع لأسلاف DN جنبًا إلى جنب مع تمايزهم في CD4 + CD8 + DP thymocytes. تحدث بعد ذلك عمليات إعادة ترتيب الجينات المتسلسلة TCRα ، والخلايا التي تعبر عن مركب α / β TCR وظيفي ، ولكن غير متفاعل ذاتيًا ، تتمايز إما إلى CD4 + أو CD8 + SP T-lymphocytes. لم يُظهر Thymi من الفئران PKD2 SSAA / SSAA و PKD2 GT / GT أي تشوهات واضحة واحتوت على أعداد طبيعية من DN و DP و SP الناضجة التي تعبر عن مستويات عالية من مجمع α / TCR الناضج (الشكلان 5A و 5B). علاوة على ذلك ، كانت هذه الخلايا الليمفاوية SP الناضجة قادرة على الخروج من الغدة الصعترية وتعبئة الأنسجة الطرفية بشكل طبيعي ، حيث أن الترددات والأعداد الإجمالية للخلايا الليمفاوية الطرفية CD4 + و CD8 + T في العقد الليمفاوية والطحال من النوع البري ، PKD2 SSAA / SSAA و كانت الفئران PKD2 GT / GT قابلة للمقارنة (الشكلان 5C و 5 D ، والنتائج غير معروضة). وبالمثل ، حدث تطور الخلايا الليمفاوية B داخل نخاع العظم بشكل طبيعي في غياب النشاط التحفيزي PKD2 (النتائج غير معروضة) ، مما أدى إلى إجمالي عدد الخلايا الليمفاوية B الناضجة التي تعبر عن IgM / IgD في الطحال والغدد الليمفاوية من PKD2 SSAA / الفئران SSAA و PKD2 GT / GT (الشكلان 5C و 5D ، والنتائج غير معروضة). وبالتالي يمكن الاستغناء عن نشاط كيناز PKD2 للتطور الطبيعي للخلايا الليمفاوية T و B الناضجة المحيطية.


شاهد الفيديو: علم الأحياء تحت المجهر: ما الحمض النووي والحمض النووي الريبي (كانون الثاني 2022).