معلومة

هل يمكن أن تنمو الخلايا السرطانية الأولية في ثقافة ثنائية الأبعاد؟


هل من الممكن توسيع الخلايا السرطانية الأولية في الثقافة ثنائية الأبعاد؟ هل هي خلايا ملتصقة؟ هل لديك أي خبرة خاصة في زراعة سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة في 2D؟ شكرا لك.


إجابة مختصرة: نعم ، هذا ممكن ، إنها الطريقة التي تولدت بها معظم خطوط الخلايا (السرطانية).

إجابة طويلة: يتم إجراء زراعة الخلايا من أنسجة الورم في المختبرات ، خاصة إذا كنت لا ترغب في الاعتماد على الثقافات القديمة جدًا المستخدمة في المختبرات. بدأ العديد من هذه الأشياء في السبعينيات وهي غريبة من نواح كثيرة ، على سبيل المثال تحتوي على العديد من الكروموسومات عدة مرات. لقد قمت بشكل روتيني بعزل خطوط خلوية جديدة من أنسجة الورم الميلاني (معظمها نقائل من أعضاء مختلفة) ، لكن الإجراء العام هو نفسه بالنسبة للأورام الأخرى أيضًا.

لعزل الخلايا من الورم ، عليك أولاً غسل عينة الورم للتخلص من الدم. ثم تقوم بتقطيع الأورام إلى قطع صغيرة باستخدام فروة الرأس ، قبل إضافة مزيج من الإنزيمات مثل Collagenase و Dispase و Hyaluronidase لإذابة الأنسجة بشكل أكبر للحصول على محلول خلية واحدة. بعد الحضانة مع الإنزيمات ، يتم تمرير المعلق عبر مصفاة خلية لإزالة جميع مجاميع الخلايا الكبيرة المتبقية وبقايا الأنسجة والطرد المركزي للخلايا. يتم تعليقها في وسط مناسب لنوع الخلية ويتم زرعها في صفيحة / قارورة مناسبة. بالنسبة لعيناتنا ، كان هذا عادةً إما لوحة بحجم 35 مم (أو لوحة 6 آبار ، والتي لها نفس المساحة لكل بئر) أو قارورة T25. تنمو معظم الخلايا الناتجة عن مثل هذه العزلات ملتصقة ، لكن في بعض الأحيان يمكنك ملاحظة الخلايا التي لا تلتصق بالأسطح.

الإجراء في حد ذاته ليس معقدًا للغاية ، ولكنه يحتاج إلى تحسين. اعتمادًا على نسيجك ، يمكن أن يتنوع مزيج الإنزيم ، وكذلك طول فترة الحضانة ووقت الحضانة في هذه الخطوة. ثم يمكن أن تلعب أسطح الألواح / القارورة المختلفة دورًا مهمًا ، وكذلك التركيبة المتوسطة.

عندما بدأنا القيام بهذا العمل في المختبر ، كانت حوالي 1 من 10 محاولات ناجحة ، وبعد التحسين صعدنا إلى 6-7 من 10. المهم أن نأخذ في الاعتبار أن الخلايا تتغير أثناء الحضانة والتكيف معها. هذا يعني أنك بحاجة إلى أن تسأل نفسك ، إلى أي مدى يمكن أن يكون النموذج جيدًا وما يجب أن يكون عليه. إذا كنت بحاجة إلى بروتوكولنا التفصيلي ، فيرجى إبلاغي بذلك ، ويمكنني نشره في مكان ما.


مقارنة بين نماذج الثقافة ثنائية وثلاثية الأبعاد كمنصات لاختبار الأدوية في سرطان الثدي

يتزايد عدد المرضى الذين يعانون من السرطانات في جميع أنحاء العالم ، ولا تزال مشكلة تطوير الأدوية الفعالة اقتصاديًا وفي الوقت المناسب واحدة من أكثر القضايا صعوبة في علم الأورام. في الواقع ، فإن احتمالية الموافقة من الاكتشاف قبل السريري إلى المرحلة الأولى من التجارب السريرية هي الأدنى بالنسبة لأدوية الأورام (7٪) مقارنة بالأدوية ذات المؤشرات الأخرى (1). بالنظر إلى التكلفة العالية والطبيعة التي تستغرق وقتًا طويلاً للتطوير السريري لأدوية الأورام ، هناك حاجة ماسة لمنصات ما قبل السريرية الأفضل لفحص الأدوية.

تقليديا ، تم تقييم نشاط الأدوية المضادة للسرطان في سلالات الخلايا السرطانية ثنائية الأبعاد (2D). ومع ذلك ، فمن المعروف الآن أن الخلايا المزروعة ثنائية الأبعاد غير قادرة على محاكاة البيئة المكروية للأورام الأصلية ، التي تنمو ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) (2-7). يُفترض أن يكون هذا وثيق الصلة بحقيقة أن العديد من الأدوية التي ثبت أنها غير مجدية سريريًا تم تقييمها مسبقًا سريريًا على أنها "نشطة" باستخدام نماذج تستند إلى خط الخلايا المستزرعة ثنائية الأبعاد. حظيت أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد بالاهتمام كوسيلة لتجنب بعض عيوب نماذج الثقافة ثنائية الأبعاد ، من خلال تلخيص البيئة الدقيقة للورم ، على الأقل جزئيًا (2-7).

في هذه الدراسة ، للتحقيق في فائدة نماذج الثقافة ثلاثية الأبعاد في اختبار نشاط أدوية العلاج الكيميائي ، قمنا بمقارنة الثقافة ثنائية وثلاثية الأبعاد لخطوط خلايا سرطان الثدي والخلايا الأولية التي تم الحصول عليها من مريض بسرطان الثدي ونمت كمريض- xenograft مشتق (PDX).

المواد والأساليب

خطوط خلايا سرطان الثدي و PDX

اثنان من مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) - موجب / HER2 - غير مضخم (النوع اللمعي T-47D و MCF-7) ، واثنان من نوع ER-سلبي / HER2 - مضخم (HER2- نوع BT-474 و HCC-1954) (8) ، واثنين من خطوط خلايا سرطان الثدي ER-negative / HER2 غير مكبرة (النوع الثلاثي السلبي BT-549 و MDA-MB-231) (8) تم شراؤها من مجموعة American Type Culture Collection (ATCC ، Manassas ، VA ، الولايات المتحدة الأمريكية ). تم الحفاظ على الخلايا في RPMI-1640 ® (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع 10٪ من مصل بقري جنيني (FBS Gemini-Bio-Products ، Inc. مل بنسلين ، 100 وحدة / مل ستربتومايسين ، و 2 ملي مولار جلوتامين. تمت زراعة جميع الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو رطب بنسبة 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون وكانت في مرحلة النمو اللوغاريتمي عند بدء التجارب. تم تمرير الخلايا لمدة 3 أشهر قبل الحصول على خلايا جديدة من مخزون المرور المبكر المجمد الذي تم استلامه من المورد.

تم جمع عينة نسيج سرطان الثدي من ورم أولي تم استئصاله جراحيًا من مريض خضع لعملية جراحية في مستشفى جامعة كوبي. أعطى المريض موافقة مستنيرة على الاستخدام البحثي لعينات الورم ، على النحو الذي وافق عليه مجلس أخلاقيات البحث في كلية الطب بجامعة كوبي. كان توليد PDX كما هو موضح سابقًا (9). باختصار ، تم تقطيع أنسجة سرطان الثدي إلى شظايا (

بحجم 1 مم 3) باستخدام شفرة حلاقة ، و 4 × 10 6 خلايا تم زرعها تقويميًا في مناطق وسادة دهون الثدي الأربية لإناث الفئران NOD-SCID (كليا ، طوكيو ، اليابان). عندما وصل حجم الأورام

بقطر 1-2 سم ، تم التضحية بالفئران ، وتم استئصال ورم طعم xenograft. في هذه الدراسة ، تم فصل قطعة من أنسجة PDX الطازجة التي نشأت من ورم سرطان الثدي اللمعي بالطريقة الميكانيكية الآلية (Medimachine ® Azone ، أوساكا ، اليابان). تم استنبات الخلايا الأولية في خليط Dulbecco المتوسط ​​/ المغذي المعدل F12 ® (Life Technologies ، Grand Island ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع 2 ٪ FBS ، 100 U / ml البنسلين و 100 U / ml الستربتومايسين ، وتم تربيتها عند 37 درجة مئوية. في جو رطب بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات بموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوان في كلية الطب بجامعة كوبي.

المخدرات

تم شراء Paclitaxel (PTX) و doxorubicin (ADR) و 5-fluorouracil (5FU) من Wako (أوساكا ، اليابان). تم تحضير محاليل المخزون في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وتخزينها عند 20 درجة مئوية. خففت الأدوية في وسط طازج قبل كل تجربة بتركيزات DMSO النهائية لتر 0.1٪.

اختبار حساسية الدواء

تم طلاء الخلايا (100 ميكرولتر / بئر ، ن = 6) (اليوم 0) في أطباق ثنائية الأبعاد [Falcon 96-well Tissue Culture Plate ® (353072) Corning Inc. ، NY ، الولايات المتحدة الأمريكية] أو لوحات ثلاثية الأبعاد [NanoCluture 96-well Plate ® (NCP-LH-96) SCIVAX ، كاناغاوا ، اليابان]. كانت أعداد الخلايا المصنفة لكل بئر على النحو التالي (تم تحديدها في تجربة تحضيرية): BT-474 ، 5000 (2D) و 15000 خلية / بئر (3D) T-47D ، MCF-7 و BT-549 ، 2500 (2D) و 10000 خلية / بئر (3D) HCC-1954 ، 1000 (2D) و 5000 خلية / بئر (3D) MDA-MB-231 ، 500 (2D) و 2500 خلية / بئر (3D). تمت إضافة الأدوية في اليوم الثالث. تم تعديل تركيز كل دواء لتحقيق 0.1 و 1 و 10 × المناطق الواقعة تحت المنحنى (AUC) التي تم الحصول عليها في دراسات الحرائك الدوائية السريرية (الجدول 1) (10). تم تقييم عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقايسة الإنارة CellTiter-Glo ® (Promega ، Madison ، WI ، الولايات المتحدة الأمريكية) في اليوم السادس. تم تسجيل سلسلة من الصور الميدانية الساطعة في الأيام 0-6 باستخدام مجهر مقلوب BZ-X710 ® ( Keyence ، أوساكا ، اليابان).

الجدول الأول

تطبيق تركيزات الدواء.

الجدول الأول

تطبيق تركيزات الدواء.

حزمة إدراج البيانات
اسم الدواء الجرعة (ملغم / م 2) الحد الأقصى لتركيز الدواء (ميكروغرام / مل) الجامعة الأمريكية بالقاهرة (ميكروغرام · ح / مل) ميغاواط الجرعة السريرية لسرطان الثدي (مجم / م 2) تقدير AUC (ميكرومتر · ساعة) تركيز التعرض للخلايا (1 × من الجامعة الأمريكية بالقاهرة ، ميكرومتر)
PTX 180 4.47±1.29 16.46±3.76 853.91 175 13.66 0.19
ADR 50 8.70±2.73 62.40±40.7 579.98 60 43.35 0.60
5FU - - 20–24 130.08 - 2.86 0.04

[i] تعتمد معلمات حركية الدواء لـ PTX و ADR على بيانات إدراج الحزمة اليابانية. بالنسبة إلى 5FU ، تم استخدام المنطقة المثلى تحت المنحنى (AUC) المذكورة في دراسة سابقة. يتم حساب التركيزات النهائية لتعرض الخلايا وفقًا للجامعة الأمريكية والوزن الجزيئي (MW) والجرعة السريرية المحددة لسرطان الثدي (لـ PTX و ADR) ووقت التعرض (72 ساعة). PTX ، باكليتاكسيل ADR ، دوكسوروبيسين 5FU ، 5-فلورويوراسيل.

استخراج البروتين والنشاف الغربي

تم غسل الخلايا المعالجة بـ PTX (1 × AUC ، الجدول I) مرة واحدة باستخدام PBS المثلج وكشطها فورًا بعد إضافة محلول تحلل [20 ملي مولار تريس (درجة الحموضة 7.5) ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي مولار EDTA ، 10٪ جلسرين ، 1 ٪ NP40] تحتوي على مثبطات البروتياز والفوسفاتيز (100 ملي مولار ، فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل 1 ملي مولار ، 1 ملي مولار Na 3 VO 4 ، 2 مجم / مل أبروتينين ، 5 مجم / مل ليوببتين). تم طرد محلولات الخلية عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية إلى مادة حبيبية غير قابلة للذوبان ، وتم جمع مستخلصات البروتين الطافية. تم فصل قسامات من مستخلصات البروتين عن طريق الرحلان الكهربائي على المواد الهلامية سابقة الصب 7.5٪ بولي أكريلاميد ، متبوعًا بالنقل إلى أغشية البولي فينيلدين ديفلورايد. تم فحص الأغشية بجسم مضاد للكشف عن بوليميراز بولي (ADP-ribose) المشقوق (PARP) (Asp214) (D64E10) (1: 1000 # 5625 تقنية تشوير الخلايا بيفرلي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وبشكل منفصل باستخدام جسم مضاد β-actin ( 1: 3000 سيغما ألدريتش). تم اكتشاف كل جسم مضاد أولي باستخدام كواشف Amersham ECL Plus Western Blotting Detection (GE Healthcare ، Buckinghamshire ، UK).

فحص نقص الأكسجة

تم طلاء الخلايا في وسائط الصيانة (اليوم 0) في 2D (Corning Inc.) أو لوحات ثلاثية الأبعاد ذات 96 بئر (SCIVAX) ، كما هو موضح أعلاه. تمت إضافة مسبار نقص الأكسجة LOX-1® (SCIVAX) في اليوم الثالث. مجهر مضان (11). تم استخدام مجهر BZ-X710 لتسجيل صور التألق في اليوم الرابع.

الفحوصات النسيجية والهيستوكيميائية المناعية

تم حصاد الخلايا عن طريق الكشط إلى 7.5 ٪ من الفورمالين. في اليوم التالي ، تم تجريف الرواسب المحتوية على زر الخلية ومعالجتها في شمع البارافين. تم تقسيم زر الخلية المضمن بالبارافين (كتلة الخلية) بسمك 4 ميكرومتر وتم تقييمها مناعيًا باستخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: Ki-67 (1: 5 # IR626 Dako ، Glostrup ، Denmark) ، caspase-3 (1) : 200 # NCL-CPP32 Leica-Novocastra، Newcastle upon Tyne، UK) و caspase-8 (1: 150 # NCL-CASP-8 Leica-Novocastra). لاسترجاع المستضد ، تم استخدام محلول السترات (درجة الحموضة 6.0) لمدة 10 دقائق عند 100 درجة مئوية وتبريد 30 دقيقة إلى درجة حرارة الغرفة. تم استخدام نظام MACH 2 Double Stain (Biocare Medical ، كونكورد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) للكشف عن تفاعلات المستضد والأجسام المضادة ، متبوعة بالتلوين البني بواسطة تلطيخ DAB. تم استخدام الضوابط الإيجابية المناسبة لجميع الظروف.

نتائج

تشكيل كروي في ثقافة ثلاثية الأبعاد

بعد يوم واحد تقريبًا من البذر على لوحات ثلاثية الأبعاد ، بدأت 3 من أصل 6 خطوط لخلايا سرطان الثدي ، T47-D و BT-474 و BT-549 ، في تكوين أجسام كروية كثيفة متعددة الخلايا (MCSs). استقر حجم هذه MCS

بعد 3 أيام من البذر ، كان الحجم الأقصى للأجسام الشبه الكروية

200-300 ميكرومتر لكل من خطوط الخلايا هذه. بالنسبة لـ MCF-7 و HCC-1954 و MDA-MB-231 ، تراكمت الخلايا في لوحات الثقافة ثلاثية الأبعاد أكثر إلى حد ما مما كانت عليه في لوحات الثقافة ثنائية الأبعاد ، وعلى الرغم من تشكل الأجسام الشبه الكروية ، إلا أنها كانت أكثر مرونة من تلك التي تنتجها الخلايا الثلاث الأخرى خطوط (الشكل 1).

شكل 1

تأثير أدوية العلاج الكيميائي على نمو خلايا خلايا سرطان الثدي ثنائية وثلاثية الأبعاد. تم زرع ستة خطوط من خلايا سرطان الثدي في اليوم 0 وزُرعت في ظروف ثنائية الأبعاد أو ثلاثية الأبعاد حتى اليوم السادس (العمود الأيسر). تم التقاط صور Brightfield لكل خط خلوي في اليوم السادس (العمود الأيمن). تمت معالجة كل خط خلوي مع أو بدون PTX أو ADR أو 5FU من اليوم الثالث حتى اليوم 6. يظهر عدد الخلايا القابلة للحياة الموجودة في اليوم السادس بالنسبة إلى عدد الخلايا الضابطة بدون دواء. تمثل الخطوط المتقطعة ثقافة ثنائية الأبعاد وخطوط صلبة تمثل ثقافة ثلاثية الأبعاد. تمثل كل نقطة بيانات القيمة المتوسطة والانحراف المعياري لستة آبار مكررة. تشير أشرطة مقياس 100 ميكرومتر.

حساسية الدواء في الثقافة ثنائية وثلاثية الأبعاد

معدل النمو النسبي لخطوط خلايا سرطان الثدي الستة في وجود أو عدم وجود عوامل العلاج الكيميائي الثلاثة (PTX و ADR و 5FU) في ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد أو ثلاثية الأبعاد موضح في الشكل 1. نطاق تركيزات الأدوية المستخدمة تم تعيينه استنادًا إلى بيانات الحرائك الدوائية السريرية (0.1 و 1 و 10 × الجدول 1 للجامعة الأمريكية بالقاهرة) من أجل استكشاف الأهمية السريرية للنتائج. بالنسبة لـ 5FU ، لم يكن هناك فرق واضح في الحساسية بين الثقافة ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد في أي من خطوط الخلايا التي تم اختبارها. تميل خطوط الخلايا الثلاثة التي طورت 3D-MCSs كثيفة (T-47D و BT-474 و BT-549) إلى إظهار مقاومة نسبية لـ PTX و ADR في الثقافة ثلاثية الأبعاد مقارنة بهذه المقاومة في 2D. على النقيض من ذلك ، فإن الثلاثة الآخرين الذين طوروا الأجسام الشبه الكروية ثلاثية الأبعاد (MCF-7 و HCC-1954 و MDA-MB-231) يميلون إلى أن يكون لديهم حساسية مماثلة لـ PTX و ADR في الثقافة ثنائية وثلاثية الأبعاد. تؤكد هذه النتائج أن تكوين MCSs الكثيفة في الثقافة ثلاثية الأبعاد يلعب دورًا في تحديد حساسية خطوط الخلايا لـ PTX و ADR.

موت الخلايا المبرمج الناجم عن PTX

لاستكشاف آلية الحساسية التفاضلية لـ PTX في الثقافات ثنائية وثلاثية الأبعاد ، خضعت 3 خطوط خلوية لمزيد من الدراسة BT-549 و BT-474 كممثلين لخطوط الخلايا التي تشكل 3D-MCSs كثيفة ، و MCF-7 مثال على النمط الظاهري ثلاثي الأبعاد الفضفاض. يوضح الشكل 2 أ أنه بالنسبة لخلايا BT-549 و BT-474 ، أدى التعرض لـ PTX (1 × AUC) إلى تقلص الخلية ، مما يدل على موت الخلايا المبرمج عند نموه في ثقافة ثنائية الأبعاد ، ومع ذلك بقيت 3D-MCSs الكثيفة في الثقافات ثلاثية الأبعاد . أسفر نفس العلاج PTX لخلايا MCF-7 عن تقلص كبير للخلايا في كل من الثقافات ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد (الشكل 2 أ). تمشيا مع هذه النتائج ، أدى علاج خلايا BT-549 أو BT-474 باستخدام PTX إلى زيادات أقل بكثير في PARP المشقوق في الثقافة ثلاثية الأبعاد مقارنة بالثقافة ثنائية الأبعاد ، بينما في MCF-7 (مع MCSs فضفاضة) نفس PTX أدى العلاج إلى درجة مماثلة من الزيادة في PARP المشقوق (الشكل 2 ب). أكدت هذه النتائج أن المقاومة النسبية لـ PTX في خطوط الخلايا ذات MCSs الكثيفة في الثقافة ثلاثية الأبعاد مقارنة بالثقافة ثنائية الأبعاد كانت جزئيًا بسبب انخفاض موت الخلايا المبرمج.

الشكل 2

تأثير PTX على موت الخلايا المبرمج في خطوط خلايا سرطان الثدي ثنائية وثلاثية الأبعاد. (أ) صور Brightfield لكل خط خلية نمت مع أو بدون PTX (1 × AUC) لمدة ثلاثة أيام. تشير أشرطة مقياس 100 ميكرومتر. (ب) الخلايا السرطانية التي تم نشرها في ثقافات ثنائية وثلاثية الأبعاد كانت مناعية للكشف عن PARP المشقوق ، مما يشير إلى موت الخلايا المبرمج. تم تجريد البقع وإعادة فحصها من أجل β-actin كعنصر تحكم في التحميل.

نقص الأكسجة في MCSs الكثيفة

لقد تم التكهن بأن تكوين MCSs الكثيفة يؤدي إلى نقص الأكسجة داخل الأجسام الشبه الكروية التي تحاكي أورام الجسم الحي ، ومن المعروف أن نقص الأكسجة هو أحد العوامل المرتبطة بمقاومة أدوية العلاج الكيميائي (12). لذلك ، قمنا بتقييم حالة الأكسجين في ثقافات ثنائية وثلاثية الأبعاد من خلال استخدام مسبار نقص الأكسجة LOX-1 ، الذي يولد إشارات مرئية باستخدام الفحص المجهري الفلوري. كما هو مبين في الشكل 3 ، لوحظت مناطق ناقصة التأكسج داخل 3D-MCSs الكثيفة من خطوط الخلايا BT-549 و BT-474 ، ولكن ليس في الأجسام الشبه الكروية السائبة التي شكلتها خلايا أو خلايا MCF-7 المزروعة في ثنائية الأبعاد. تشير هذه النتائج إلى أن حالة نقص الأكسجة في 3D-MCSs الكثيفة قد تكون أحد أسباب مقاومتها للأدوية.

الشكل 3

حالة نقص الأكسجين في 3D-MCS. تم السماح لكل خط خلوي بالنمو في ثقافة ثنائية أو ثلاثية الأبعاد لمدة ثلاثة أيام ثم تم تطبيق مسبار نقص الأكسجة LOX-1 لمدة 24 ساعة وتم تصوير الخلايا بواسطة الفحص المجهري الفلوري للكشف عن مستويات الأكسجين. تشير أشرطة مقياس 100 ميكرومتر.

تعبير Ki-67 و caspase

تم الإبلاغ عن أن نقص الأكسجة يسبب سكون الخلايا السرطانية في المرحلة G0 (13) ، وبالتالي قمنا بعد ذلك بتقييم التلوين باستخدام الجسم المضاد Ki-67 ، والذي تم الإبلاغ عنه أنه إيجابي في الخلايا باستثناء تلك الموجودة في مرحلة G0. كما هو مبين في الشكل 4 ، كان مؤشر Ki-67 أعلى في الثقافة ثنائية الأبعاد منه في الثقافة ثلاثية الأبعاد لجميع خطوط الخلايا الثلاثة التي تم اختبارها. تم تمييز الاختلاف بشكل خاص بالنسبة لخلايا BT-549 ، التي شكلت خلايا 3D-MCS كثيفة (84.0٪ خلايا إيجابية Ki-67 في 2D مقابل 46.5٪ في 3D).

الشكل 4

التعبير عن Ki-67 و caspases في خطوط خلايا سرطان الثدي ثنائية وثلاثية الأبعاد. يتم عرض صور حقل مشرق تمثيلي للتلوين الكيميائي المناعي (البني) لـ Ki-67 و caspase-3 و caspase-8 في خطوط خلايا سرطان الثدي ثنائية وثلاثية الأبعاد. تشير أشرطة مقياس 100 ميكرومتر.

بعد ذلك ، نظرًا لدراسة تشير إلى أن تقليل تنظيم كاسباس 3 و -8 في ظروف نقص الأكسجين قد يؤدي إلى مقاومة PTX في خلايا سرطان الثدي (14) ، قمنا بتقييم التعبير المناعي عن هذه البروتينات في ثقافات ثنائية وثلاثية الأبعاد. كما هو مبين في الشكل 4 ، كانت مستويات التعبير عن caspase-3 و -8 متطابقة تقريبًا بين الثقافات ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد لجميع خطوط الخلايا الثلاثة التي تم اختبارها ، باستثناء خلايا BT-474 ، حيث يتم التعبير عن caspase-3 كان أعلى بكثير في الثقافة ثنائية الأبعاد من هذا المستوى في الثقافة ثلاثية الأبعاد. بالإضافة إلى ذلك ، تم اكتشاف caspase-3 بشكل رئيسي في نوى خلايا BT-474 المستنبتة ثنائية الأبعاد ، مما يدل على نشاط caspase-3. أوضحت لنا هذه النتائج أن نقص الأكسجة في 3D-MCS قد يؤدي إلى سكون الخلية و / أو تقليل تنظيم الكاسباس 3 ، ويؤدي إلى مقاومة PTX.

إمكانات الثقافة الأولية ثلاثية الأبعاد لمحاكاة نمو الورم في الجسم الحي

لاستكشاف أهمية الثقافة ثلاثية الأبعاد لنمو الورم في الجسم الحي ، قمنا بمقارنة الورم المستأصل وثقافته الأولية ثنائية وثلاثية الأبعاد من حيث التعبير عن Ki-67 و caspase-3 و caspase-8. استخدمنا ورم PDX لهذا الغرض. كما هو مبين في الشكل 5 ، كانت نسبة الخلايا الإيجابية لـ Ki-67 في الخلايا المستنبتة الأولية ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد الناشئة من PDX ، ورم PDX الجديد ، والورم الأصلي للمريض 77.4 و 57.4 و 41.6 و 34.1٪ على التوالي . علاوة على ذلك ، بما يتفق مع خلايا BT-474 (الشكل 4) ، كان تعبير caspase-3 أعلى بكثير في ورم PDX وثقافته الأولية ثنائية الأبعاد مقارنة بثقافته الأولية ثلاثية الأبعاد ، بينما لم يلاحظ أي اختلاف في تعبير caspase-8 بين الثقافة ثنائية وثلاثية الأبعاد. تؤكد هذه النتائج أن الثقافة الأولية ثلاثية الأبعاد بدلاً من الثقافة الأولية ثنائية الأبعاد قد تشير بشكل أفضل إلى سكون الورم في الجسم الحي والميزات المضادة للاستماتة.

الشكل 5

التعبير عن Ki-67 و caspases في PDX وخلاياها ثنائية وثلاثية الأبعاد المستنبتة الأولية. يتم عرض صور المجال المشرق التمثيلية للتلوين الكيميائي المناعي (البني) لـ Ki-67 و caspase-3 و caspase-8 في الخلايا الأولية ثنائية وثلاثية الأبعاد التي تنشأ من PDX ، ورم PDX الجديد ، والورم الأصلي للمريض (Ki- 67 فقط). تشير أشرطة مقياس 100 ميكرومتر.

مناقشة

في هذه الدراسة ، أوضحنا أن بعض سلالات خلايا سرطان الثدي شكلت مكسًا كثيفًا ثلاثي الأبعاد ، وأن تكوين MCS كان مرتبطًا بانخفاض الحساسية لأدوية العلاج الكيميائي (الشكل 1). كشفت بياناتنا أيضًا أن مقاومة الأدوية قد تكون ناتجة عن نقص الأكسجة في MCS ، والذي ارتبط بزيادة عدد الخلايا في مرحلة G0 و / أو تقليل تنظيم الجزيئات proapoptotic مثل caspase-3 (الأشكال 2-4). علاوة على ذلك ، تم تمثيل سكون الورم الذي لوحظ في ورم PDX في الجسم الحي بشكل أفضل من خلال ثقافته الأولية ثلاثية الأبعاد مقارنة بثقافته الأولية ثنائية الأبعاد (الشكل 5).

تعتبر خطوط الخلايا السرطانية ثنائية الأبعاد المزروعة على الأسطح البلاستيكية غير قادرة على محاكاة حالات الورم بدقة في الجسم الحي (2-7). لذلك ، يمكن توقع أن تطوير الأدوية المضادة للسرطان على أساس الفحص باستخدام خطوط الخلايا ثنائية الأبعاد غير فعال. تشير حقيقة التخلص من العديد من الأدوية المضادة للسرطان أثناء التطوير السريري إلى أن النشاط المضاد للسرطان يميل إلى المبالغة في تقديره على منصة الفحص القائمة على الثقافة ثنائية الأبعاد. على النقيض من ذلك ، فقد ثبت أن أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد تحاكي البيئة المكروية للورم في الجسم الحي بشكل أفضل من الثقافة ثنائية الأبعاد (3-7) وقد أظهرت العديد من الدراسات السابقة أن الخلايا المزروعة ثنائية الأبعاد تميل إلى المبالغة في تقدير كفاءة أدوية العلاج الكيميائي مقارنةً بـ 3D- الخلايا المستنبتة (15-17). تمشيا مع هذه الدراسات ، أظهرت دراستنا الحالية أن خطوط الخلايا التي تنتج 3D-MCSs كثيفة أكثر مقاومة لـ PTX و ADR في 3D- من الثقافة ثنائية الأبعاد (الشكل 2 أ). عند قياس موت الخلايا المبرمج الناجم عن PTX ، كان هذا الاتجاه أكثر وضوحًا (الشكل 2 ب) ، مما يشير إلى أن تكوين 3D-MCS قد يحمي الخلايا من موت الخلايا. تشير هذه النتائج إلى أن الثقافة ثلاثية الأبعاد يحتمل أن تتجنب المبالغة في تقدير الفعالية المضادة للأورام التي لوحظت في ثقافة ثنائية الأبعاد. من الجدير بالذكر أن هذه الظاهرة قد لوحظت بتركيزات الأدوية القابلة للتحقيق سريريًا المحسوبة على أساس AUC في مرضى السرطان ، والتي كانت أقل من تركيزات الدواء القصوى (Cmax ، الجدول 1). بينما تم استخدام تركيزات الأدوية حول Cmax بشكل تقليدي للاختبار في التجارب المختبرية ، فقد تكون هذه التركيزات غير مناسبة لأن Cmax لا يستمر لساعات في الجسم الحي (18). لذلك ، نعتقد أن الأدوية التي تقتل الخلايا النامية ثلاثية الأبعاد بتركيزات أقل من Cmax يجب تقييمها لتكون نشطة.

تتمثل المزايا المحتملة لأنظمة الاستزراع ثلاثي الأبعاد على أنظمة الثقافة ثنائية الأبعاد في أن النوع الأول فقط قد يتميز بتدرجات أكسجين موجودة في أورام الجسم الحي. من المعروف أن نقص الأكسجة يسبب مقاومة الأدوية من خلال عدة آليات. إحدى الآليات التقليدية هي آلية إيقاف دورة الخلية التي يسببها نقص الأكسجة. أظهر سوليفان وآخرون أن نقص الأكسجة تسبب في زيادة عدد السكان غير المتدربين G0 المرتبط بمقاومة الإيتوبوسيد في خطوط خلايا سرطان الثدي (13). تمشيا مع هذه النتيجة ، كان أحد خطوط الخلايا التي تشكل MCSs كثيفة في 3D ، BT-549 ، يحتوي على مؤشر تسمية Ki-67 أقل بكثير (يمثل عددًا أكبر من G0) في 3D مقارنة بالخلايا ثنائية الأبعاد المستزرعة. ومع ذلك ، فإن خط الخلية الآخر الذي شكل 3D-MCSs كثيفة ، BT-474 ، كان أقل قليلاً من Ki-67 في 3D مقارنةً بالثنائي الأبعاد ، مع اختلاف 12.1٪ (الشكل 4) ، والذي كان في الواقع أصغر من ذلك في MCF -7 خلايا شكلت فقط MCSs فضفاضة. يشير هذا إلى أن مقاومة الأدوية المرتبطة بـ 3D-MCSs الكثيفة لا يمكن أن تُعزى دائمًا إلى زيادة عدد الخلايا الخاملة G0. لذلك ، قمنا بتقييم التعبير عن caspase-3 و -8 ، حيث تم تحديد تقليل تنظيم هذين الجزيئين المؤيدين لموت الخلايا المبرمج ، إلى جانب التغيير في التعبير عن ستة جزيئات أخرى ، على أنه من المحتمل أن يشاركوا في الحماية التي يسببها نقص الأكسجة ضد PTX المستحثة. موت الخلايا المبرمج من خلال دراسة سابقة (14). بما يتفق جزئيًا مع هذه الدراسة ، عبر BT-474 عن مستويات أقل من caspase-3 في 3D- مقارنة بالثقافة ثنائية الأبعاد. علاوة على ذلك ، وجدنا أن سكون الورم وتقليل تنظيم كاسباس 3 الذي لوحظ في ورم المريض الأصلي و / أو ورم PDX قد تم الحفاظ عليه بشكل أفضل في الخلايا المستنبتة الأولية ثلاثية الأبعاد مقارنة بالخلايا المزروعة الأولية ثنائية الأبعاد (الشكل 5). تشير هذه النتائج إلى أن الثقافة ثلاثية الأبعاد قد توفر منصة أفضل لفحص الأدوية تنتج نتائج أكثر صلة سريريًا.

عدة قيود على دراستنا تستحق الذكر. أولاً ، هذه الدراسة مستمدة من طبيعة النموذج المختبري. في الوقت الحالي ، هناك العديد من أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد إلى جانب النظام الذي استخدمناه ، ومع ذلك لم يتم اعتبار أي منها طريقة قياسية ، وليس من الواضح أي نظام هو الأكثر صلة إكلينيكيًا (3-7). إحدى الملاحظات الواضحة هي أن الثقافة ثلاثية الأبعاد لخطوط الخلايا لن تمثل أبدًا بدقة البيئة المكروية للورم في الجسم الحي ، لأن الأخيرة لها تفاعلات مع الأنسجة اللحمية أو نضح الدم. قد تؤدي الثقافة المشتركة مع الخلايا اللحمية أو الثقافة الأولية في ظروف ثلاثية الأبعاد إلى حل هذه المشكلات جزئيًا وهي قيد التحقيق في مختبرنا. يتم تقييم النماذج الحيوانية مثل PDXs كمنصة محتملة لفحص الأدوية للجيل القادم (19-22) ، ومع ذلك ، فإن الصعوبة في تطوير وتوسيع نموذج PDX ، وتكلفتها العالية ستحول دون استخدامها في الإنتاجية العالية تحري. لذلك ، فإن تحسين أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد مثل منصات فحص الأدوية أمر يستحق المضي قدمًا. ثانيًا ، على الرغم من أن نتائجنا تدعم أن نقص الأكسجة في الثقافة ثلاثية الأبعاد قد يلعب دورًا في مقاومة الأدوية ، إلا أننا لم نثبت الآليات الجزيئية الكامنة وراء ذلك في الدراسة الحالية. بالإضافة إلى ذلك ، لم نستكشف العديد من الآليات المحتملة الأخرى لمقاومة الأدوية التي يسببها نقص الأكسجة ، مثل تدفق الأدوية المعزز أو الالتهام الذاتي ، أو تثبيط الشيخوخة أو تلف الحمض النووي (12 ، 23). تم الإبلاغ عن آليات مقاومة الأدوية التي يسببها نقص الأكسجة بشكل رئيسي عن طريق العامل المحرض بنقص الأكسجة -1α (HIF-1α) (12 ، 24 ، 25). ومع ذلك ، في دراستنا ، لم نتمكن من اكتشاف HIF-1α بالكيمياء المناعية أو النشاف الغربي ، حتى في MCSs الكثيفة (البيانات غير معروضة).

في الختام ، تُظهر خلايا سرطان الثدي المستنبتة ثلاثية الأبعاد مقاومة نسبية للأدوية مقارنة بالخلايا المستنبتة ثنائية الأبعاد عند تكوين خلايا ثلاثية الأبعاد كثيفة ، والمقاومة مرتبطة بنقص الأكسجة. يمكن استخدام 3D-MCSs كمنصة اختبار المخدرات القائمة على الخلايا المختبرية.

شكر وتقدير

نشكر السيدة ميغومي إيزومي وموظفي مركز تلطيخ الأنسجة المتقدم بمستشفى جامعة كوبي (KATS) على دعمهم الفني الممتاز. تم دعم هذه الدراسة من قبل برنامج المراكز العالمية للتميز (HM) ، ومنحة المساعدة للبحث العلمي (C) (T.M.) ، ومنحة بحثية من مؤسسة Takeda Science Foundation (T.M).

مراجع

Hay M و Thomas DW و Rosenthal J وآخرون: معدلات نجاح التطوير السريري للأدوية التجريبية. Nat Biotechnol. 32: 40-51. 2014. عرض المقال: الباحث العلمي من Google: PubMed / NCBI


الخلايا الأولية البشرية: تطل على الحياة الحقيقية

يتم عزل الخلايا الأولية البشرية مباشرة من الأنسجة وتحتفظ بالخصائص المورفولوجية والوظيفية لأنسجتها الأصلية. على سبيل المثال ، تحافظ أنسجة الورم الأصلية من سرطان القولون والمستقيم على العديد من علامات الورم و microRNAs المعروفة. في المقارنة ، تعرض خطوط الخلايا اختلافات في تعبيرها (Pastor et al. ، 2010).

الخلايا الأولية ، مع ذلك ، لا تعيش إلى الأبد. إنهم يخضعون لعمليات الشيخوخة ولديهم إمكانات محدودة للتجديد الذاتي والتمايز. مع تقدمهم في العمر ، يظهرون تغيرات مورفولوجية ووظيفية ، ولهذا السبب يجب عليك استخدامها في المقاطع المبكرة. الخصائص الجينية وعمر المتبرعين مهمة أيضًا ، حيث يمكن لخلاياهم أن تتصرف بشكل مختلف في ظل نفس ظروف الاستنبات. يمكن أن يكون هذا أمرًا جيدًا عند التحقيق في كيفية اختلاف الميزات الخلوية المحددة بين السكان أو عند اختبار مركبات جديدة. من ناحية أخرى ، هل تتطلب اختباراتك تباينًا منخفضًا؟ ثم استخدم خلايا من نفس المتبرع. تتمثل إحدى ميزات الخلايا الأساسية البشرية في أنك لا تحتاج إلى الاعتماد على نماذج حيوانية. هذا يعني أنه يمكنك تجنب الاختلافات بين الأنواع - كما هو الحال في علم التشريح والمسارات الجزيئية والتمثيل الغذائي - والتي يمكن أن تؤثر على سمية الدواء وطريقة عملها.


مقارنة منهجيات السقالات الخالية من السقالات لتشكيل كروي

يعتمد نوع تقنية زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد المختارة على نوع الخلايا وأصل الأنسجة (أي خط الخلية والخلية الأولية) والهدف من الدراسة والحاجة إلى قدرات إنتاجية عالية. هناك عدد كبير من أدوات الزراعة المتاحة تجاريًا لتشكيل كروي ثلاثي الأبعاد ويمكن فصلها إلى تقنيات قائمة على السقالات وخالية من السقالات 8.

التقنيات القائمة على السقالة

تعتبر المصفوفة خارج الخلية (ECM) مكونًا مهمًا للبيئة المكروية الخلوية في الأنسجة الأصلية حيث تكون الاتصالات من الخلية إلى المصفوفة جزءًا لا يتجزأ من البقاء على قيد الحياة وتكاثر الخلايا وتمايزها وترحيلها. تهدف السقالات إلى محاكاة ECM الأصلي ويمكن أن تتكون من مجموعة متنوعة من المواد البيولوجية والاصطناعية ذات المساميات المختلفة والنفاذية والكيمياء السطحية والصلابة التي تهدف إلى محاكاة البيئة المكروية لأنسجة معينة لتعزيز نمو الخلايا والهجرة 1.4. تتضمن أمثلة طرق الثقافة ثلاثية الأبعاد المستندة إلى السقالة الألواح المربعة 9 ، وخرز microcarrier 10 وأنظمة الموائع الدقيقة الأكثر تعقيدًا 4،10،11،12. كل من تكوين وتصلب المصفوفة خارج الخلية المحيطة بالخلايا وكذلك الخصائص البيولوجية مثل توافق الخلية أو الالتصاق لها تأثيرات كبيرة على إشارات الخلية وسلوكها 13 ، 14.

تُستخدم السقالات البيولوجية مثل الكولاجين و Matrigel ™ (المشتقة من خلايا ساركوما الفأر Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) بشكل شائع لتشكيل كروي 4. فهي لا توفر فقط الدعم المادي للخلايا لتلتصق وإعادة تنظيم الهياكل ثلاثية الأبعاد ، بل يمكنها أن تساهم في عوامل النمو القابلة للذوبان والهرمونات والمكونات الأخرى غير المحددة ، والتي يمكن أن تؤثر على التعبير الجيني والبروتيني 13 ، 14. لذلك ، يحتاج الباحثون إلى النظر في تفاعلات المصفوفة هذه عند اختيار سقالة ثلاثية الأبعاد لتطبيق معين لأن هذه التفاعلات يمكن أن تربك النتائج.

تستخدم السقالات البوليمرية الهلاميات المائية الاصطناعية أو مواد بوليمرية أخرى متوافقة حيوياً لتوليد الدعامات المادية للثقافات ثلاثية الأبعاد. يمكن أن توفر مرونة تصميم أكثر من السقالات البيولوجية ، تم تعديلها للحصول على خصائص ECM المرغوبة لنوع الخلية محل الاهتمام لتشجيع تجميع الخلايا مع الحفاظ على وظائف الأنسجة 4. هذه البوليمرات خاملة بيولوجيا ، والتي تتغلب على المشاكل التي تنشأ من استخدام السقالات البيولوجية ، كما ذكرنا أعلاه. يستخدم البولي (إيثيلين جلايكول) (PEG) بشكل شائع لهذا التطبيق بسبب عدم سميته وعدم مناعته 4. العيب الرئيسي للسقالات الاصطناعية هو أنها قد تتطلب فنيًا ماهرًا ووقتًا إضافيًا لتنفيذ خطوات التصنيع الشاقة 15.

في محاولة لزيادة الإنتاجية ، أظهر التصنيع الدقيق لتشكيل مصفوفات ميكروويل هيدروجيل مقعرة إمكانية توليد أجسام كروية متعددة الخلايا ذات حجم موحد 9. أحد الأمثلة على ذلك هو صفيحة هيدروجيل صغيرة تعتمد على بولي (إيثيلين جلايكول) (PEG) ، والتي تتيح التوليد الفعال للأجسام الجنينية ذات الحجم الموحد المستخدمة في دراسات التمايز العصبي 9 ، فضلاً عن استزراعها. ومع ذلك ، فإن التوصيف اللاحق وتحليل الأجسام الشبه الكروية الخلوية على مصفوفات الهيدروجيل هذه وكذلك الإنتاج الضخم للجهاز يمثل تحديات للباحثين والمصنعين على حد سواء.

تعد منصات الموائع الدقيقة طريقة أكثر تعقيدًا ، مما يضيف مستوى إضافيًا من التعقيد من خلال إدخال جانب نضح في بيئة الثقافة 10،14. يُشار إلى هذه الأنظمة متعددة القنوات عمومًا باسم "عضو على رقاقة" ، وهي تكرر الوظائف الرئيسية للأعضاء الحية مما يسمح بالتغذية المستمرة وإدخال الأكسجين بالإضافة إلى التخلص من النفايات ، وبالتالي خلق بيئة بيولوجية أكثر واقعية وديناميكية 8. عادةً ما تكون القنوات الصغيرة مغلفة أو مملوءة بالهيدروجيل من أجل الاصطياد وتوفير سقالة لنمو الخلايا 10،11. يسهل هذا النظام أيضًا توليد الأجسام الشبه الكروية الأكبر والأكثر تعقيدًا ويسمح أيضًا بالحفاظ على الأجسام الشبه الكروية للدراسات طويلة المدى حيث يمكن التحكم بإحكام في معلمات بيئتها المكروية 11.

تقنيات خالية من السقالات

في المقابل ، لا تستخدم الطرق الكروية الخالية من السقالات المواد الحيوية أو مكونات ECM لدعم الارتباط والترحيل من خلية إلى خلية. تعمل هذه التقنيات على تعزيز الالتصاق من خلية إلى أخرى (فوق خلية إلى سطح) باعتباره المحرك الرئيسي لتكوينها. في عملية التجميع الذاتي القسري هذه ، تفرز الخلايا مكونات ECM الخاصة بها ، والتي تلخص بشكل أكثر دقة في الجسم الحي الأحداث التي تحدث أثناء مرحلة التطور الجنيني والتكوين وتكوين الأعضاء 10. يستخدم علماء بيولوجيا الخلايا السرطانية عادةً طرقًا خالية من السقالات لتشكيل الأجسام الشبه الكروية للورم لدراسة التعبير الجيني أو حساسية الدواء 14.

يمكن تقسيم الطرق الخالية من السقالات إلى طرق التحريض وخالية من الانفعالات 11. Rotating flasks and bioreactors are a relatively simple way to form spheroids through continuous stirring of the culture medium, which keeps cells in suspension to form aggregates 1,10,15 . The main drawback is that a broad size range of spheroids is generated and the shear stress from continuous agitation is undesirable. Agitation-free methods include the use of hanging drop plates (gravity forced aggregation) 1,10,15 , low cell attachment plates 1,17 , and emerging techniques like magnetic levitation 18 , and magnetic 3D bioprinting 19 . The advantages of scaffold-free methods are that they can be applied to many different cell types and are relatively easy to execute.

Figure 2 outlines some of the most common methods, both scaffold-based and scaffold-free, for 3D spheroid formation discussed here.

Figure 2. Methods of Spheroid Formation
A. Hanging Drop Method – cells are seeded in small droplets of medium and are forced into cellular aggregates due to gravity.
B. Low cell attachment plates – surfaces are modified to promote cellular aggregation into spheroids rather than cell adhesion to cultureware surface.
C. Spinner flasks – stirred or rotating vessels prevent cell adhesion to flasks through continued agitation promoting spheroids formation in suspension.
D. Matrices – cells are seeded into natural or synthetic matrices and scaffolds allowing spheroids to form on these frameworks.
E. Microcarrier beads – cells adhere to and proliferate on the surface of natural or synthetic solid beads coated with matrices that allow cells to adhere and proliferate to form spheroids.
F. Micropatterned plates – plates are etched with matrices promoting spheroid formation in these areas.
G. Magnetic levitation – cells are magnetized using nanoparticles and incubated under magnetic forces, which causes the cells to be suspended within the culture to form spheroids.
H. Magnetic bioprinting – magnetized areas are printed onto the bottom of cultureware using magnetic forces. This method can be used to assemble cells in different 3D patterns, such as cylindrical or honeycomb.
I. Microfluidics – cell spheroids situated in microchannels in a perfusion system allowing for flow of nutrients and oxygen to the cells and waste to be removed simulating vasculature found in organ systems.


الانتماءات

Division of Hematology, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Yuan-Hung Lo, Kasper Karlsson & Calvin J. Kuo

Division of Oncology, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

المؤلف المراسل


How cancer cells fuel their growth

يتم توفير الصور للتنزيل على موقع مكتب MIT الإخباري للكيانات غير التجارية والصحافة وعامة الجمهور بموجب ترخيص Creative Commons Attribution Non-Commercial No Derivatives. لا يجوز لك تغيير الصور المقدمة ، بخلاف قصها حسب الحجم. يجب استخدام حد ائتمان عند إعادة إنتاج الصور إذا لم يتم توفير أحدها أدناه ، فامنح الصور إلى "MIT".

الصورة السابقة الصورة التالية

Cancer cells are notorious for their ability to divide uncontrollably and generate hordes of new tumor cells. Most of the fuel consumed by these rapidly proliferating cells is glucose, a type of sugar.

Scientists had believed that most of the cell mass that makes up new cells, including cancer cells, comes from that glucose. However, MIT biologists have now found, to their surprise, that the largest source for new cell material is amino acids, which cells consume in much smaller quantities.

The findings offer a new way to look at cancer cell metabolism, a field of research that scientists hope will yield new drugs that cut off cancer cells’ ability to grow and divide.

“If you want to successfully target cancer metabolism, you need to understand something about how different pathways are being used to actually make mass,” says Matthew Vander Heiden, the Eisen and Chang Career Development Professor and an associate professor in the Department of Biology, and a member of MIT’s Koch Institute for Integrative Cancer Research.

Vander Heiden is the senior author of the study, which appears in the journal Developmental زنزانة on March 7. The paper’s lead author is MIT graduate student Aaron Hosios.

Since the 1920s, scientists have known that cancer cells generate energy differently than normal cells, a phenomenon dubbed the “Warburg effect” after its discoverer, German biochemist Otto Warburg. Human cells normally use glucose as an energy source, breaking it down through a series of complex chemical reactions that requires oxygen. Warburg discovered that tumor cells switch to a less efficient metabolic strategy known as fermentation, which does not require oxygen and produces much less energy.

More recently, scientists have theorized that cancer cells use this alternative pathway to create building blocks for new cells. However, one strike against this hypothesis is that much of the glucose is converted into lactate, a waste product that is not useful to cells. Furthermore, there has been very little research on exactly what goes into the composition of new cancer cells or any kind of rapidly dividing mammalian cells.

“Because mammals eat such a diversity of foods, it seemed like an unanswered question about which foods contribute to what parts of mass,” Vander Heiden says.

To determine where cells, including those in tumors, were getting the building blocks they needed, the researchers grew several different types of cancer cells and normal cells in culture dishes. They fed the cells different nutrients labeled with variant forms of carbon and nitrogen, allowing them to track where the original molecules ended up. They also weighed the cells before and after they divided, enabling them to calculate the percentage of cell mass contributed by each of the available nutrients.

Although cells consume glucose and the amino acid glutamine at very high rates, the researchers found that those two molecules contribute little to the mass of new cells — glucose accounts for 10 to 15 percent of the carbon found in the cells, while glutamine contributes about 10 percent of the carbon. Instead, the largest contributors to cell mass were amino acids, which make up proteins. As a group, amino acids (excluding glutamine) contribute the majority of the carbon atoms found in new cells and 20 to 40 percent of the total mass.

“These experiments reveal important details that reinforce our fundamental understanding of the metabolic underpinnings of molecular biosynthesis and cellular proliferation,” says Jared Rutter, a professor of biochemistry at the University of Utah who was not involved in the research. “The MIT team has performed a rigorous and quantitative assessment of the contributions of glucose, glutamine, and other molecules to the mass of proliferating mammalian cells in culture.”

Although initially surprising, the findings make sense, Vander Heiden says, because cells are made mostly of protein.

“There’s some economy in utilizing the simpler, more direct route to build what you’re made out of,” he says. “If you want to build a house out of bricks, it’s easier if you have a pile of bricks around and use those bricks than to start with mud and make new bricks.”

Refocusing the question

It remains something of a mystery why proliferating human cells consume so much glucose. Consistent with previous studies, the researchers found that most of the glucose burned by these cells is excreted as lactate.

“This led us to conclude that the importance of high glucose consumption is not necessarily the manipulation of carbon that allows you to make cell mass, but more for the other products that it provides, such as energy,” Hosios says.

Vander Heiden’s lab is now pursuing a more comprehensive understanding of how the Warburg effect may help cells reproduce. “It refocuses the question,” he says. “It isn’t necessarily about how the Warburg effect helps cells put glucose into cell mass, but more about why does glucose-to-lactate conversion help cells use amino acids to build more cells.”

Other authors of the paper include Vivian Hecht, a former MIT graduate student Laura Danai, a Koch Institute postdoc Scott Manalis, the Andrew (1956) and Erna Viterbi Professor in the MIT departments of Biological Engineering and Mechanical Engineering and a member of the Koch Institute Jeffrey Rathmell, a professor at Vanderbilt University School of Medicine Marc Johnson, a Vanderbilt University postdoc and Matthew Steinhauser, an assistant professor of medicine at Harvard Medical School and Brigham and Women’s Hospital.

The research was funded by the National Institutes of Health, the Burroughs Wellcome Fund, and the Damon Runyon Cancer Research Foundation.


New Research Results Explain How Dormant Tumor Cells Become Active in Later Years

Scientists using a three-dimensional cell culture system have identified a mechanism by which dormant, metastatic tumor cells can begin growing again after long periods of inactivity. The new findings indicate that the switch from dormancy to proliferative, metastatic growth may be regulated, in part, through signaling from the surrounding microenvironment, which leads to changes in the skeletal architecture of dormant tumor cells. Targeting this mechanism may also provide strategies for inhibiting the switch from dormancy to proliferation. The results of this study by National Cancer Institute (NCI) scientists and their collaborators, appears in the August 1, 2008, issue of Cancer Research. NCI is part of the National Institutes of Health.

The recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and follow-up therapy. According to NCI’s Jeffrey E. Green, M.D., one of the lead researchers of this study, "Recent evidence suggests that, in many cases, tumor cells have already seeded metastatic sites even when the primary tumor is diagnosed at an early stage." Approximately 30 percent of breast cancer patients diagnosed with early-stage disease have been found to have breast cancer cells in their bone marrow. However, these cells seem to exist primarily as micrometastases that do not manifest themselves clinically in any way.

Although many of these disseminated tumor cells may not survive for extended periods of time, a subset of them may represent dormant but viable cells that could begin to proliferate years later. These dormant cells can be resistant to conventional therapies, such as chemotherapy, that target actively dividing cells such cells could account for disease recurrence after apparently successful treatment of primary tumors.

It has been proposed that tumor cells can switch from a dormant state to become active micrometastases, but the size of the resulting tumors may be limited by the availability of an adequate blood supply, which is needed to provide oxygen and nutrients for cell growth. Discerning the mechanisms that either maintain prolonged cellular dormancy or activate dormant tumor cells to a proliferative stage has been a goal of scientists for many years. The development of therapeutic approaches to eliminate these inactive micrometastatic tumor cells has been hampered by the absence of models in living systems that mimic cellular dormancy and the emergence of clinical metastatic disease.

The tumor microenvironment has been increasingly recognized as a critical regulator of cancer progression. The extracellular matrix (ECM), a key component of the microenvironment, is in immediate contact with tumor cells. The ECM significantly affects tumor biology and progression by providing factors for cell growth and survival and for stimulating the growth of new blood vessels to feed the tumor. Also, cell adhesion to the ECM triggers signaling pathways that can regulate various phases of cell growth. Thus, interactions between tumor cells and the ECM are critical modulators of the metastatic potential of tumor cells.

In this study, NCI investigator Dalit Barkan, Ph.D., and colleagues characterized a novel application of a three-dimensional culture system in which the growth of several different types of tumor cells in the ECM correlated with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at metastatic, secondary sites in a living system. A three-dimensional system can be used to culture a variety of different cells and tissues in the laboratory for prolonged periods of time. The results revealed that a stage of prolonged tumor cell inactivity, presumably preceding a later stage that is dependent on blood vessel formation for metastatic growth, exists due to a brake being applied to the cell division cycle, which is the regulated series of steps that a cell goes through when it replicates. The researchers were also able to demonstrate that the switch from inactive to proliferative, metastatic growth is strongly influenced by interactions with the ECM.

"We hope that, with additional studies, we can begin to discover new ways to therapeutically keep the dormant-to-active switch in the ‘off’ position, thus limiting the chance that micrometastases become active in later life," said Green.

For more information on Dr. Green’s research, please go to http://ccr.cancer.gov/staff/staff.asp?profileid=13662.

For more information about cancer, please visit the NCI website at http://www.cancer.gov, or call NCI’s Cancer Information Service at 1-800-4-CANCER (1-800-422-6237).

حول المعاهد الوطنية للصحة (NIH): تضم المعاهد الوطنية للصحة ، وهي وكالة الأبحاث الطبية في البلاد ، 27 معهدًا ومركزًا وهي جزء من وزارة الصحة والخدمات الإنسانية الأمريكية. المعاهد الوطنية للصحة هي الوكالة الفيدرالية الأساسية التي تجري وتدعم البحوث الطبية الأساسية والسريرية والمتعددة ، وتحقق في الأسباب والعلاجات والعلاجات لكل من الأمراض الشائعة والنادرة. لمزيد من المعلومات حول المعاهد الوطنية للصحة وبرامجها ، قم بزيارة www.nih.gov.

المعاهد الوطنية للصحة و hellip تحويل الاكتشاف إلى الصحة ®

المرجعي

Barkan D, Kleinman H, Simmons JL, Asmussen H, Kamaraju AK, Hoenorhoff MJ, Liu Z, Costes SV, Cho EH, Lockett S, Khanna C, Chambers AF, Green JE. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. ابحاث السرطان. August 1, 2008.


Enzyme Immunoassay

Enzyme immunoassays (EIAs) rely on the ability of antibodies to detect and attach to specific biomolecules called antigens. The detecting antibody attaches to the target antigen with a high degree of specificity in what might be a complex mixture of biomolecules. Also included in this type of assay is a colorless enzyme attached to the detecting antibody. The enzyme acts as a tag on the detecting antibody and can interact with a colorless substrate, leading to the production of a colored end product. EIAs often rely on layers of antibodies to capture and react with antigens, all of which are attached to a membrane filter (see Figure (PageIndex<8>)). EIAs for viral antigens are often used as preliminary screening tests. If the results are positive, further confirmation will require tests with even greater sensitivity, such as a western blot or an NAAT. EIAs are discussed in more detail in EIAs and ELISAs.

Figure (PageIndex<8>): Similar to rapid, over-the-counter pregnancy tests, EIAs for viral antigens require a few drops of diluted patient serum or plasma applied to a membrane filter. The membrane filter has been previously modified and embedded with antibody to viral antigen and internal controls. Antibody conjugate is added to the filter, with the targeted antibody attached to the antigen (in the case of a positive test). Excess conjugate is washed off the filter. Substrate is added to activate the enzyme-mediated reaction to reveal the color change of a positive test. (credit: modification of work by &ldquoCavitri&rdquo/Wikimedia Commons)

What typically indicates a positive EIA test?

Along with the RT/PCR analysis, David&rsquos saliva was also collected for viral cultivation. In general, no single diagnostic test is sufficient for antemortem diagnosis, since the results will depend on the sensitivity of the assay, the quantity of virions present at the time of testing, and the timing of the assay, since release of virions in the saliva can vary. As it turns out, the result was negative for viral cultivation from the saliva. This is not surprising to David&rsquos doctor, because one negative result is not an absolute indication of the absence of infection. It may be that the number of virions in the saliva is low at the time of sampling. It is not unusual to repeat the test at intervals to enhance the chance of detecting higher virus loads.

Should David&rsquos doctor modify his course of treatment based on these test results?


The Development of Cancer

One of the fundamental features of cancer is tumor clonality, the development of tumors from single cells that begin to proliferate abnormally. The single-cell origin of many tumors has been demonstrated by analysis of X chromosome inactivation (Figure 15.2). As discussed in Chapter 8, one member of the X chromosome pair is inactivated by being converted to heterochromatin in female cells. X inactivation occurs randomly during embryonic development, so one X chromosome is inactivated in some cells, while the other X chromosome is inactivated in other cells. Thus, if a female is heterozygous for an X chromosome gene, different alleles will be expressed in different cells. Normal tissues are composed of mixtures of cells with different inactive X chromosomes, so expression of both alleles is detected in normal tissues of heterozygous females. In contrast, tumor tissues generally express only one allele of a heterozygous X chromosome gene. The implication is that all of the cells constituting such a tumor were derived from a single cell of origin, in which the pattern of X inactivation was fixed before the tumor began to develop.

الشكل 15.2

Tumor clonality. Normal tissue is a mosaic of cells in which different X chromosomes (X1 and X2) have been inactivated. Tumors develop from a single initially altered cell, so each tumor cell displays the same pattern of X inactivation (X1 inactive, X (more. )

The clonal origin of tumors does not, however, imply that the original progenitor cell that gives rise to a tumor has initially acquired all of the characteristics of a cancer cell. On the contrary, the development of cancer is a multistep process in which cells gradually become malignant through a progressive series of alterations. One indication of the multistep development of cancer is that most cancers develop late in life. The incidence of colon cancer, for example, increases more than tenfold between the ages of 30 and 50, and another tenfold between 50 and 70 (Figure 15.3). Such a dramatic increase of cancer incidence with age suggests that most cancers develop as a consequence of multiple abnormalities, which accumulate over periods of many years.

الشكل 15.3

Increased rate of colon cancer with age. Annual death rates from colon cancer in the United States. (Data from J. Cairns, 1978. Cancer: Science and Society, New York: W. H. Freeman.)

At the cellular level, the development of cancer is viewed as a multistep process involving mutation and selection for cells with progressively increasing capacity for proliferation, survival, invasion, and metastasis (Figure 15.4). The first step in the process, tumor initiation, is thought to be the result of a genetic alteration leading to abnormal proliferation of a single cell. Cell proliferation then leads to the outgrowth of a population of clonally derived tumor cells. Tumor progression continues as additional mutations occur within cells of the tumor population. Some of these mutations confer a selective advantage to the cell, such as more rapid growth, and the descendants of a cell bearing such a mutation will consequently become dominant within the tumor population. The process is called clonal selection, since a new clone of tumor cells has evolved on the basis of its increased growth rate or other properties (such as survival, invasion, or metastasis) that confer a selective advantage. Clonal selection continues throughout tumor development, so tumors continuously become more rapid-growing and increasingly malignant.

الشكل 15.4

Stages of tumor development. The development of cancer initiates when a single mutated cell begins to proliferate abnormally. Additional mutations followed by selection for more rapidly growing cells within the population then result in progression of (more. )

Studies of colon carcinomas have provided a clear example of tumor progression during the development of a common human malignancy (Figure 15.5). The earliest stage in tumor development is increased proliferation of colon epithelial cells. One of the cells within this proliferative cell population is then thought to give rise to a small benign neoplasm (an adenoma or polyp). Further rounds of clonal selection lead to the growth of adenomas of increasing size and proliferative potential. Malignant carcinomas then arise from the benign adenomas, indicated by invasion of the tumor cells through the basal lamina into underlying connective tissue. The cancer cells then continue to proliferate and spread through the connective tissues of the colon wall. Eventually the cancer cells penetrate the wall of the colon and invade other abdominal organs, such as the bladder or small intestine. In addition, the cancer cells invade blood and lymphatic vessels, allowing them to metastasize throughout the body.

الشكل 15.5

Development of colon carcinomas. A single initially altered cell gives rise to a proliferative cell population, which progresses first to benign adenomas of increasing size and then to malignant carcinoma. The cancer cells invade the underlying connective (more. )


Americas

Site will be displayed in English.

We use these cookies to ensure our site functions securely and properly they are necessary for our services to function and cannot be switched off in our systems. They are usually only set in response to actions made by you which amount to a request for services, such as logging in, using a shopping cart or filling in forms. You can set your browser to block or alert you about these cookies, but some parts of our services will not work without them. Like the other cookies we use, strictly necessary cookies may be either first-party cookies or third - party cookies.

We use these cookies to remember your settings and preferences. For example, we may use these cookies to remember your language preferences.
Allow Preference Cookies

We use these cookies to collect information about how you interact with our services and to help us measure and improve them. For example, we may use these cookies to determine if you have interacted with a certain page.
Allow Performance/Statistics Cookies

We and our advertising partners use these cookies to deliver advertisements, to make them more relevant and meaningful to you, and to track the efficiency of our advertising campaigns, both on our services and on other websites and social media.
Allow Marketing Cookies