معلومة

استخراج ما وراء النصوص


أحاول إجراء تحليل ما وراء النسخ لغرف الأبحاث. من المعروف أن مدخلات الحمض النووي منخفضة نوعًا ما (<1pg). على الرغم من هذا ، ما زلت أريد أن أحاول تجربته. أعتقد أنه قد يكون من الأفضل إجراء تجارب الاستخراج مسبقًا حيث يتم التلاعب ببعض المعلمات. يمكنني بعد ذلك تحديد القيم الأفضل من أجلها من تجارب الاستخراج هذه.

على سبيل المثال ، أنا أقرأ ورقة تمت مراجعتها من قبل الزملاء بعنوان "التحقق من مكتبات الحمض النووي لمدخلات picogram و femtogram لميتاجينوميات ميتاجينوميات ميكروسكوبية" حيث استخدموا مجموعة أدوات مكتبة Illumina Nextera XT DNA على عينات منخفضة الكتلة الحيوية. اثنان من المعلمات التي تم التلاعب بها هما:

1) أرقام دورة PCR (القيم = 12 ، 14 ، 16 ، 18 ، 20) 2) تخفيف أجهزة الصراف الآلي (القيم = غير مخفف ، 1: 5 ، 1:10 ، 1:20 ، 1:50)

آمل أن أستخدم نفس النوع من تجارب الاستخراج لتحديد أي مجموعة من القيم من هاتين المعلمتين هي الأفضل لغرفة نظيفة. سؤالي الأول هو: كيف يمكنني تحديد المجموعة الأفضل (حيث يوجد 25 مجموعة)؟ لدي فكرتان (لكني منفتح على الآخرين):

1) تحقق من كمية الحمض النووي الريبي المشتق 2) تحقق من بعض مقاييس الجودة على الحمض النووي الريبي

بما أنني آمل أن أقوم بعمل ثلاثة توائم من كل مجموعة من 25 مجموعة ، سيكون لدي 75 عينة. آمل ألا أضطر إلى إجراء التسلسل لأنه يستغرق وقتًا طويلاً وربما يكون مكلفًا لاختيار أفضل مجموعة. هل هناك طريقة لاختيار المجموعة التي تعمل بشكل أفضل دون الحاجة إلى التسلسل؟

سؤالي الثاني هو: هل هناك أي معلمات أخرى في سير العمل هذا يمكنني أيضًا اختبارها إذا لم أحصل على نتائج جيدة في هذه الغرف النظيفة ذات الكتلة الحيوية المنخفضة؟

(كما يمكنك أن تقول ، ليس لدي الكثير من الخبرة المباشرة في البيولوجيا الجزيئية ، لذلك لا تتردد في تصحيح أو استجواب أي من منشوراتي و / أو "تجاهل" إجابتك). شكرا لتقاسم النصائح (لأي سؤال)!


  1. ضع في اعتبارك عمل ثلاث نسخ من 4 مجموعات فقط من الدورة / التخفيف: منخفض + منخفض ، منخفض + مرتفع ، مرتفع + منخفض ، مرتفع + مرتفع. أبسط.

  2. الأهم: تثبت أنه يمكنك استخراج الحمض النووي من غرفة نظيفة. إذا قمت بالاستخراج من غرفة نظيفة حقيقية ولم تحصل على نتيجة من PCR ، فربما يرجع ذلك إلى أنك فشلت في جمع أي شيء أو ربما لم يكن هناك شيء. الفكرة - رش كمية معروفة من الحمض النووي في غرفة ستكون بمثابة غرفتك النظيفة الزائفة. ثم قم بعمل بروتوكول الاستخراج الخاص بك. يمكنك اختبار معلمات الدورة / التخفيف باستخدام الاستخراج الوهمي للغرفة النظيفة والحصول على هذه المتغيرات على النحو الأمثل عندما تجمع من غرفة نظيفة "برية" حقيقية لم تتعامل معها بالحمض النووي.


Metatranscriptomics كأداة لتحديد الأنواع الفطرية والأنواع الفرعية في المجتمعات المختلطة - دليل على المفهوم في ظل ظروف المختبر

يتيح التسلسل عالي الإنتاجية (HTS) توليد كميات كبيرة من بيانات تسلسل الجينوم بتكلفة معقولة. يمكن الآن تسلسل الكائنات الحية في المجتمعات الميكروبية المختلطة وتحديدها بطريقة مستقلة عن الثقافة ، وعادةً ما يتم ذلك باستخدام تسلسل أمبليكون لباركود الحمض النووي. تتمتع مجموعة RNA-seq (metatranscriptomics) بالعديد من المزايا على تسلسل amplicon القائم على الحمض النووي: فهي أقل عرضة لتحيزات التضخيم ، وتلتقط الكائنات الحية فقط ، وتمكن من استخدام مجموعة أكبر من الجينات لتحديد التصنيف. باستخدام مجتمع وهمي نموذجي يشتمل على 17 عزلة فطرية ، قمنا بتقييم ما إذا كانت metatranscriptomics يمكنها التعرف بدقة على الأنواع الفطرية والأنواع الفرعية في المجتمعات المختلطة. بشكل عام ، تم تصنيف 72.9 ٪ من نسخ RNA ، والتي تم تحديد الغالبية العظمى منها (99.5 ٪) بشكل صحيح على مستوى الأنواع. من بين 15 نوعًا تم تسلسلها ، تم استرداد 13 نوعًا وتحديدها بشكل صحيح. اكتشفنا أيضًا تباينًا على مستوى الإجهاد داخل المستخفية مجمعات الأنواع: 99.3٪ من النصوص المخصصة ل المستخفية تم تصنيفها كواحدة من السلالات الأربعة المستخدمة في المجتمع الوهمي. كانت ملوثات المختبر و / أو التصنيفات الخاطئة متنوعة ، ولكنها لم تمثل سوى 0.44٪ من النصوص. ومن ثم ، تُظهر هذه النتائج أنه من الممكن الحصول على تحديد دقيق للأنواع والفطريات على مستوى السلالة من بيانات metatranscriptome طالما تم التخلص من الأصناف التي تم تحديدها عند الوفرة المنخفضة لتجنب الإيجابيات الكاذبة المستمدة من التلوث أو سوء التصنيف. تسلط هذه الدراسة الضوء على كل من المزايا والتحديات الحالية في تطبيق metatranscriptomics في علم الفطريات السريرية والدراسات البيئية.


البحوث الأصلية المادة

يوهونغ هوانغ 1،2،3 & # x02020 ، Zhuolin Yi 2،3 & # x02020 ، يانلينج جين 2،3 ، Mengjun Huang 2،3 ، كايز هو 2،3 ، دايو ليو 1 ، Huibo Luo 4 ، دونغ تشاو 5 ، هوى هي 6 ، يانغ فانغ 2،3 * و هاي تشاو 1،2،3 *
  • 1 مختبر رئيسي لتطبيق معالجة اللحوم في مقاطعة سيتشوان ، كلية الصيدلة والهندسة البيولوجية ، جامعة تشنغدو ، تشنغدو ، الصين
  • 2 مختبر رئيسي لعلم الأحياء الدقيقة البيئي في مقاطعة سيتشوان ، معهد تشنغدو للبيولوجيا ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، تشنغدو ، الصين
  • 3 مختبر رئيسي لعلم الأحياء الدقيقة البيئي والتطبيقي ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، تشنغدو ، الصين
  • 4 صنع الخمور التكنولوجيا الحيوية وتطبيق المختبر الرئيسي لمقاطعة سيتشوان ، كلية الهندسة الحيوية ، جامعة سيتشوان للعلوم والهندسة ، تسيغونغ ، الصين
  • 5 مجموعة Wuliangye ، ييبين ، الصين
  • 6 قسم هندسة صنع الخمور ، كلية موتاي ، رينهواي ، الصين

الخمور الصينية هي واحدة من أشهر المشروبات الروحية المقطرة في العالم ، وهي أكبر فئة من المشروبات الروحية من حيث المبيعات. كانت تقنية التخمير الصلبة التقليدية والفريدة المستخدمة في إنتاج الخمور الصينية قيد الاستخدام المستمر منذ عدة آلاف من السنين. المجتمع الميكروبي المتنوع والديناميكي في بادئ الخمور هو المساهم الرئيسي في تخمير الخمور. ومع ذلك ، لا يُعرف الكثير عن التوزيع البيئي والأهمية الوظيفية لأفراد المجتمع هؤلاء. في هذه الدراسة ، تم استخدام metatranscriptomics لاستكشاف شامل لأعضاء المجتمع الميكروبي النشط والنصوص الرئيسية ذات الوظائف الهامة في عملية إنتاج بادئ الخمور. تم العثور على الفطريات لتكون أكثر أعضاء المجتمع وفرة ونشاطا. تم تحديد ما مجموعه 932 إنزيمًا نشطًا للكربوهيدرات ، بما في ذلك عائلة النشاط المساعد 9 و 10 بروتينات عالية الوضوح ، عند 62 & # x000B0C في ظل الظروف الهوائية. تم تحديد بعض الإنزيمات المقاومة للحرارة المحتملة عند 50 و 62 و 25 & # x000B0C (مرحلة النضج). تم الكشف عن زيادة المحتوى والإفراط في التعبير عن الإنزيمات الرئيسية المشاركة في تحلل السكر والنشا ، وأيض البيروفات والإيثانول عند 50 و 62 & # x000B0C. تم تنظيم الإنزيمات الرئيسية لدورة السترات عند 62 & # x000B0C ، ومشتقاتها الوفيرة ضرورية لتوليد النكهة. هنا ، تمت دراسة التمثيل الغذائي والإنزيمات الوظيفية للمجتمعات الميكروبية النشطة في بادئ الخمور NF ، والتي يمكن أن تمهد الطريق لبدء التحسينات في جودة المشروبات الكحولية واكتشاف الميكروبات التي تنتج إنزيمات جديدة أو منتجات ذات قيمة مضافة عالية.


تحميل البيانات

Hands_on التدريب العملي: تحميل البيانات

  1. أنشئ سجلًا جديدًا لهذا البرنامج التعليمي وامنحه اسمًا مناسبًا

نصيحة: إنشاء تاريخ جديد

  1. انقر فوق أيقونة galaxy -gear (خيارات التاريخ) في الجزء العلوي من لوحة المحفوظات
  2. حدد الخيار خلق جديد إبداع جديد من القائمة

نصيحة: إعادة تسمية التاريخ

  1. انقر فوق التاريخ بدون اسم (أو الاسم الحالي للتاريخ) (انقر لإعادة تسمية التاريخ) في الجزء العلوي من لوحة السجل
  2. اكتب الاسم الجديد
  3. اضغط دخول

يستورد الأداة: تحميل 1 T1A_forward و T1A_reverse من Zenodo أو من مكتبة البيانات (اسأل مدرسك)

نصيحة: الاستيراد عبر الروابط

  • انسخ موقع الارتباط
  • افتح Galaxy Upload Manager (galaxy -upload أعلى يمين لوحة الأدوات)

  • يختار لصق / جلب البيانات
  • الصق الرابط في حقل النص

  • صحافة يبدأ

  • قريب النافذة

  • بشكل افتراضي ، يستخدم Galaxy عنوان URL كاسم ، لذا أعد تسمية الملفات باسم أكثر فائدة.

نصيحة: استيراد البيانات من مكتبة البيانات

  • اذهب داخل البيانات المشتركة (اللوحة العلوية) ثم مكتبات البيانات

  • ابحث عن المجلد الصحيح (اسأل مدرسك)

  • حدد الملفات المطلوبة
  • اضغط على للتاريخ زر بالقرب من الجزء العلوي وحدد كمجموعات بيانات من القائمة المنسدلة
  • في النافذة المنبثقة ، حدد المحفوظات التي تريد استيراد الملفات إليها (أو إنشاء واحدة جديدة)
  • انقر فوق يستورد

بشكل افتراضي ، يأخذ Galaxy الرابط كاسم ، لذا أعد تسميته.

إعادة تسمية galaxy -نقل الملفات إلى T1A_forward و T1A_reverse

نصيحة: إعادة تسمية مجموعة البيانات

  • انقر على galaxy -pencil رمز القلم الرصاص لمجموعة البيانات لتعديل سماتها
  • في اللوحة المركزية ، قم بتغيير ملف اسم حقل
  • انقر على يحفظ زر

تحقق من أن نوع البيانات هو fastqsanger (على سبيل المثال ليس fastq). إذا لم يكن كذلك ، يرجى تغيير نوع البيانات إلى fastqsanger.

نصيحة: تغيير نوع البيانات

  • انقر على galaxy -pencil رمز القلم الرصاص لمجموعة البيانات لتعديل سماتها
  • في اللوحة المركزية ، انقر فوق galaxy -chart-select-data أنواع البيانات علامة تبويب في الأعلى
  • حدد fastqsanger
  • انقر على تغيير نوع البيانات زر

Metatranscriptomics: نهج لاسترداد جينات حقيقية النواة الجديدة من البيئات الملوثة وذات الصلة

توفر Metatranscriptomics ، وهي مجموعة فرعية من metagenomics ، معلومات قيمة حول التنميط الكامل للتعبير الجيني للمجتمعات الميكروبية المعقدة في نظام بيئي. تركز دراسات Metagenomic بشكل أساسي على المحتوى الجيني وتحديد الميكروبات الموجودة داخل المجتمع ، بينما توفر metatranscriptomics تنوع الجينات النشطة داخل هذا المجتمع ، وملف تعريف التعبير الخاص بها وكيف تتغير هذه المستويات بسبب التغيير في الظروف البيئية. تم تطبيق Metatranscriptomics على أنواع مختلفة من البيئات ، من دراسة الميكروبات البشرية ، إلى تلك الموجودة في النباتات والحيوانات وداخل التربة والأنظمة المائية. تعد Metatranscriptomics ، استنادًا إلى استخدام mRNA المعزول من العينات البيئية ، نهجًا مناسبًا لتعدين مجموعة الجينات حقيقية النواة للجينات ذات الصلة بالتكنولوجيا الحيوية. أيضًا ، من الضروري تطوير خطوط أنابيب معلوماتية بيولوجية مختلفة لتحليل البيانات التي تم الحصول عليها من تحليل metatranscriptomic. في هذا الاستعراض ، نلخص metatranscriptomics المطبقة على بيئات التربة لدراسة التنوع الوظيفي ، ومناقشة مناهج عزل الجينات المشاركة في تدهور المادة العضوية وتوفير التسامح مع المعادن السامة ، ودور metatranscriptomics في أبحاث الميكروبيوم ، وخطوط أنابيب المعلوماتية الحيوية المختلفة المستخدمة في تحليل البيانات والتحديات الفنية لاكتساب رؤية ذات مغزى بيولوجي لهذا النهج.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


تقنية قوية لنسخ البيانات الوصفية لدراسات النطاق السكاني للنظام الغذائي وميكروبيوم الأمعاء وصحة الإنسان

تعد القراءة الوظيفية لميكروبيوم الأمعاء ضرورية لتمكين التحكم الدقيق في وظائف ميكروبيوم الأمعاء ، والتي تدعم صحة الإنسان وتمنع أو تقلل من مجموعة واسعة من الأمراض المزمنة. يقدم تحليل نصوص البراز نظرة وظيفية شاملة لميكروبيوم الأمعاء ، ولكن على الرغم من فائدته ، نادرًا ما يتم استخدامه في الدراسات السريرية نظرًا لتعقيده وتكلفته وتحديات المعلومات الحيوية. تلقت هذه الطريقة أيضًا انتقادات بسبب التباين المحتمل داخل العينة والتغيرات السريعة وتدهور الحمض النووي الريبي. هنا ، نصف طريقة قوية وآلية لنسخ البراز metatranscriptomic ، تسمى Viomega ، والتي تم تطويرها خصيصًا للدراسات على نطاق السكان. يشمل Viomega جمع العينات ، والحفاظ على عينة درجة الحرارة المحيطة ، واستخراج الحمض النووي الريبي (RNA) الكلي ، والإزالة الفيزيائية للـ RNAs الريبوزومي (rRNAs) ، وإعداد مكتبات Illumina الاتجاهية ، وتسلسل Illumina ، والتصنيف التصنيفي بناءً على قاعدة بيانات & GT110.000 جينوم ميكروبي ، والتعبير الجيني الكمي للميكروبات التحليل باستخدام قاعدة بيانات

100 مليون جين ميكروبي. طبقنا هذه الطريقة على 10000 عينة براز بشري وأجرينا العديد من الدراسات الصغيرة لإثبات ثبات العينة واتساقها. باختصار ، Viomega عبارة عن منصة تقنية غير مكلفة وعالية الإنتاجية وآلية ودقيقة للبراز metatranscriptomic للدراسات واسعة النطاق ومجموعة واسعة من التطبيقات.

1 المقدمة

تحتوي الأمعاء البشرية على عدد كبير من الكائنات الحية الدقيقة المتعايشة التي تؤدي مجموعة متنوعة من وظائف التمثيل الغذائي. يمكن أن يكون للأيضات التي تنتجها هذه الكائنات الدقيقة تأثيرات عميقة على فسيولوجيا الإنسان ، مع روابط مباشرة بالحالة الصحية والمرضية [1-4]. من المحتمل أن يساهم دسباقتريوز القناة الهضمية في تطور وتطور العديد من الأمراض والاضطرابات ، مثل أمراض القلب والأوعية الدموية وارتفاع ضغط الدم والسمنة والسكري وأمراض المناعة الذاتية [5-9]. هناك أيضًا دليل قوي على أن الكائنات الحية الدقيقة في القناة الهضمية تتفاعل بشكل مباشر مع الجهاز العصبي ، مما يؤدي إلى إنشاء محور الأمعاء والدماغ [10]. لقد ثبت أن محور الأمعاء والدماغ يعدل تطور الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر واضطراب طيف التوحد (ASD) ومرض باركنسون [11-14].

يلعب ميكروبيوم الأمعاء دورًا مهمًا في التوازن الفسيولوجي ، مما يؤدي إلى زيادة البحث العلمي في مدى دور ميكروبيوم الأمعاء في صحة الإنسان والمرض. لقد تطور البشر مع الميكروبيوم وأصبحوا معتمدين على إنتاجه الكيميائي الحيوي ، مثل بعض الفيتامينات والأحماض الدهنية قصيرة السلسلة [١٥ ، ١٦]. يمكن أن ينتج ميكروبيوم الأمعاء أيضًا مواد كيميائية حيوية ضارة متورطة في حالات مرضية مختلفة [15]. لفهم العلاقات بين ميكروبيوم الأمعاء وحالة صحة الإنسان تمامًا ، يجب تحديد الوظائف الكيميائية الحيوية للكائنات الحية الدقيقة وتحديدها كمياً. تم استخدام العديد من الأساليب القائمة على التسلسل من الجيل التالي لتحليل ميكروبيوم الأمعاء ، ولكل منها مزايا وعيوب واضحة. الطريقة الأبسط والأقل تكلفة والأكثر شيوعًا هي التسلسل الجيني 16S rRNA [17] ، والذي يقوم بترتيب جزء صغير من جين 16S الريبوسومي بدائية النواة والمحفوظة للغاية [18]. يمكن أن توفر هذه الطريقة تحليلًا تصنيفيًا لمستوى الجنس [19 ، 20] ، لكنها لا تقيس الوظائف البيوكيميائية للكائنات الدقيقة [18] أو تميز الكائنات الحية عن الكائنات الميتة. بالإضافة إلى ذلك ، يستبعد تسلسل الرنا الريباسي 16S التقليدي بعض البكتيريا ومعظم العتائق وجميع الكائنات حقيقية النواة والفيروسات [21] ، مما يؤدي إلى رؤية محدودة للنظام البيئي لميكروبيوم الأمعاء.

يوفر التسلسل الميتاجينومي (DNA البندقية) دقة على مستوى الإجهاد لجميع الكائنات الحية الدقيقة القائمة على الحمض النووي [18] (لا يكتشف فيروسات الحمض النووي الريبي أو عاثيات الحمض النووي الريبي). ومع ذلك ، يمكنه فقط تحديد القدره الوظائف البيوكيميائية للميكروبيوم ولا يمكنها تحديد أو تحديد المسارات الكيميائية الحيوية النشطة. يعد هذا عيبًا لدراسة الحالات المرضية المرتبطة بخلل التنسج ، مثل مرض التهاب الأمعاء (IBD) ، والذي ثبت أنه يحتوي على تباين بين المسارات المحتملة الميتاجينومية والمسارات البيوكيميائية الفعلية المعبر عنها في المرض ومجموعات التحكم [22].

يقدم التحليل الترانسكريبتومي (metatranscriptomics ، تسلسل الحمض النووي الريبي ، و RNAseq) نظرة ثاقبة للأنشطة الكيميائية الحيوية لميكروبيوم الأمعاء عن طريق قياس مستويات التعبير عن الجينات الميكروبية النشطة ، مما يسمح بتقييم أنشطة المسار ، مع توفير دقة تصنيفية على مستوى الإجهاد لجميع الأنشطة الأيضية النشطة. الكائنات الحية والفيروسات [23 ، 24]. حتى الآن ، كانت التحليلات الوصفية لعينات البراز محدودة بسبب تكلفة وتعقيد كل من الأساليب المختبرية والمعلوماتية الحيوية [25]. عن طريق إزالة الرنا الريباسي الأقل إفادة ، يمكن إنشاء بيانات نسخ أكثر قيمة مع عمق تسلسل أقل [24 ، 26] ، مما يؤدي إلى انخفاض تكاليف التسلسل لكل عينة.

تم تطوير تقنية آلية للتحليل المترانسكريبتومي للعينات السريرية البشرية ، تسمى Viomega. في هذه الدراسة ، تم تطبيق Viomega على 10000 عينة براز بشري لاكتساب فهم أفضل لتصنيفات مستوى الإجهاد والوظائف الميكروبية. تم إجراء العديد من الدراسات على نطاق صغير لتحديد الاستقرار metatranscriptomic في القولون السفلي وقياس التباين داخل العينة لتحليلات metatranscriptomic.

2. المواد والأساليب

2.1. المشاركون في الدراسة ، والأخلاق ، وجمع العينات ونقلها

في هذه الدراسة ، استخدم Viome بيانات من 10000 مشارك. وافق جميع المشاركين في الدراسة على أن يكونوا في الدراسة ، وتمت الموافقة على جميع إجراءات الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المعتمد اتحاديًا (IRB). تم تجنيد المشاركين من أي عمر وجنس ومجموعة عرقية.

تم جمع عينات البراز باستخدام مجموعة Gut Intelligence من Viome من قبل كل مشارك في الدراسة في مساكنهم الخاصة. تضمنت المجموعة أنبوبًا لجمع العينات مع مغرفة مدمجة ، ومادة حافظة من الحمض النووي الريبي ، وحبات زجاجية معقمة. تم جمع عينة من البراز بحجم حبة البازلاء ووضعها داخل الأنبوب ورجها بقوة لمجانسة العينة ، وتعريضها لمادة RNA الحافظة. تم شحن العينة بعد ذلك في درجة حرارة الغرفة باستخدام ساعي مشترك إلى معامل Viome لتحليلها. تراوحت أوقات الشحن من يوم إلى اثني عشر يومًا. أكمل كل مشارك استبيانًا يتضمن معلومات عامة عن نمط الحياة والصحة.

2.2. التحليل المترانسكريبتوميك لعينات البراز

من أجل التحليل metatranscriptomic لعينة براز 10،000 ، تم استخدام منصة آلية من عينة إلى نتيجة ملكية تسمى Viomega. تم تحليل عينات البراز باستخدام الضرب بالخرز في مادة كيميائية قوية ، ثم تم وضعها على معالج سائل آلي ، والذي يؤدي جميع الطرق المختبرية النهائية. تمت معالجة العينات على دفعات في صفيحة ميكروية تحتوي على 96 بئرًا ، وتتكون كل دفعة من أربعة وتسعين عينة من البراز البشري ، والتحكم السلبي في العملية (NPC ، والماء) ، والتحكم الإيجابي في العملية (PPC ، RNA الاصطناعية المخصصة). تم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة الملكية. باختصار ، تم استخدام حبيبات مغطاة بالسيليكا وسلسلة من الغسل لتنقية الحمض النووي الريبي بعد التحلل وتم التصفية من الحمض النووي الريبي في الماء. تم تحلل الحمض النووي باستخدام DNase الخالي من RNase.

تمت إزالة غالبية الحمض النووي الريبي بدائية النواة (الرنا الريباسي: 16S و 23S) باستخدام طريقة التهجين الطرحي المخصصة. تمت إضافة مجسات DNA مع تسلسل مكمل للـ rRNAs إلى إجمالي الحمض النووي الريبي ، وتم تسخين الخليط وتبريده ، وتمت إزالة مجمعات المسبار-الرنا الريباسي باستخدام خرز الستربتافيدين المغناطيسية. تم تحويل RNAs المتبقية إلى مكتبات تسلسل اتجاهي مع محولات فريدة مزدوجة الباركود وكواشف عالية النقاء. تم تجميع المكتبات والتحكم في جودتها باستخدام dsDNA Qubit (Thermo Fisher Scientific) ومحلل التجزئة (تحليلي متقدم). تم ترتيب تجمعات المكتبة على أدوات Illumina NextSeq أو NovaSeq باستخدام 300 مجموعة دورة.

تعمل وحدة المعلوماتية الحيوية في Viomega على Amazon Web Services وتتضمن مراقبة الجودة والتوصيف التصنيفي والتحليل الوظيفي. تعمل أدوات مراقبة الجودة على تقليم وتصفية القراءات الأولية وتحديد كميات الكلام المتبادل من عينة إلى عينة وتلوث الخلفية بواسطة الأصناف الميكروبية. تنشئ Viomega تعيينات تصنيف تستند إلى القراءة باستخدام عملية متعددة الخطوات. تتم محاذاة قراءات التسلسل مع قاعدة بيانات خاصة بالتوقيعات الجينية المحسوبة مسبقًا على ثلاثة مستويات تصنيفية: السلالة والأنواع والجنس. يتم حساب التواقيع الفريدة من جينومات كاملة الطول عن طريق إزالة التكرارات القصيرة اللاحقة ذات الطول المحدد ،

(- mers) ، مشتركة بين أكثر من جينوم واحد مع الاحتفاظ بالمرور الفريدة التي تشكل التوقيع [27]. تم إنشاء قاعدة بيانات تصنيف Viomega من قاعدة بيانات RefSeq كبيرة تحتوي على أكثر من 110.000 جينوم ميكروبي. بعد إنشاء التخصيصات التصنيفية الأولية ، تمت إزالة الإيجابيات الخاطئة المحتملة باستخدام خوارزمية Auto-Blast التي تستخدم قاعدة بيانات أكبر من الكائنات الحية.

تم تقييم الهوية والنشاط النسبي للجينات الميكروبية والوظائف الأنزيمية في عينات البراز باستخدام خوارزمية خاصة. على مستوى عالٍ ، يتضمن هذا نهجًا متعدد المستويات لمواءمة قراءات العينة مع كتالوج الجينات المتكامل (IGC) [28] مكتبة الجينات لتحديد الجينات في العينة أولاً ثم تحديدها كميًا. تم تحديد كمية الجينات الإعلامية (أي غير الرنا الريباسي) بوحدات من النصوص لكل مليون (TPM) للسماح بإجراء مقارنات عبر العينات. باستخدام موسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) [29] رسم الخرائط التوضيحية لجينات IGC إلى تقويم العظام KEGG (KOs) ، تم تحديد الوظائف والنشاط الإنزيمي في هذه العينات على أنها TPM الكلية. يسمح رسم خرائط KEGG أيضًا بالوحدات الوظيفية وتحليل المسار.

2.3 دراسات على نطاق صغير

للتحقق من صحة تحلل العينة في خط أنابيب Viomega ، نمت الكائنات الحية التالية في مرق المغذيات عند 37 درجة مئوية و 450 دورة في الدقيقة في ميني شيكر احتضان VWR: العصوية الرقيقة سلالة ماربورغ (ATCC 6051-U) ، محطة الوتدية سلالة NCTC 2399 (ATCC 6872) ، Citrobacter freundii سلالة ATCC 13316 ، NCTC 9750 (ATCC 8090) ، و المسال سلالة CDC 1284-57 ATCC 12926 (ATCC 27592). بالإضافة إلى ذلك ، نمت الكائنات الحية التالية في مرق قالب الخميرة عند 37 درجة مئوية و 450 دورة في الدقيقة في ميني شيكر احتضان VWR: خميرة الخميرة سلالة S288C (ATCC 204508) و المبيضات dubliniensis سلالة CBS 7987 (ATCC MYA-646).

لتوضيح دقة التصنيف التصنيفي على مستوى الأنواع لتقنية Viomega ، تم استخدام منتج 10 Strain Even Mix Full Cell Material (ATCC® MSA-2003 ™). كما هو مذكور من قبل الشركة المصنعة ، يتكون هذا المنتج من خليط متساوٍ من الكائنات الحية التالية: بكتيريا سيريوس العصويه (ATCC 10987) ، المراهقون المشقوقون (ATCC 15703) ، كلوستريديوم بيجرينكي (ATCC 35702) ، Deinococcus radiodurans (ATCC BAA816) ، المكورات المعوية البرازية (ATCC 47077) ، الإشريكية القولونية (ATCC 700926) ، اكتوباكيللوس جاسيري (ATCC 33323) ، رودوباكتر سبيرويدس (ATCC 17029) ، المكورات العنقودية البشروية (ATCC 12228) و العقدية الطافرة (ATCC 700610).

3. النتائج والمناقشة

3.1. التحقق من صحة تقنية Viomega
3.1.1. عينة تحلل

يمكن أن يؤدي تحلل العينة غير المتكافئ إلى حدوث أخطاء كبيرة في أي طريقة نظرًا لأن تكوين العينة يمكن أن يختلف بشكل كبير من حيث الكائنات الحية الدقيقة سهلة التحليل (الفيروسات والبكتيريا الجرام (-)) والبكتيريا التي يصعب تحليلها بصعوبة شديدة (+) خميرة. تستخدم Viomega مزيجًا من عينات العينات الكيميائية (المُفسدة) والفيزيائية (الضرب بالخرز) ، والتي ثبت أنها تتمتع بأفضل كفاءة. لاختبار هذه الطريقة ، تمت زراعة سلالتين من بكتيريا جرام (-) وسلالتين من بكتيريا جرام (+) وسلالتين من الخميرة إلى نطاق كثافة بصرية يتراوح من 0.4 إلى 0.8 وحدة فلكية. كميات متساوية من كل كائن حي في ثلاث نسخ ثم خضعت لمحلول عينة كيميائية وفيزيائية ، وتم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من كل عينة. كانت غلات الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها متسقة ولا تظهر أي تحيز ضد بكتيريا جرام (+) أو الخميرة (متوسط ​​المحصول:


يكشف التحليل الترانسكربتومي للجذور الخارجية عن الجينات المرتبطة بـ صiloderma–صفينا التعايش: منهجيات محسنة لتقييم التعبير الجيني فى الموقع

تشكل الفطريات Ectomycorrhizal (EM) ارتباطات تكافلية مع جذور النباتات التي تنظم تبادل المغذيات بين نباتات الغابات والتربة. تُظهر مناهج الميتاجينوميات البيئية التي تستخدم تسلسل الجيل التالي وعدًا كبيرًا لدراسة التعايش الكهرومغناطيسي ، ومع ذلك ، فقد تم تقييد دراسات الترانسكريبتوميك بسبب الصعوبات المتأصلة المرتبطة بعزل وتسلسل الحمض النووي الريبي من الميكوريزا. نحن هنا نطبق طريقة محسّنة لاستخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي المشترك باستخدام مجموعات جذر الصنوبر الفطري EM التي تم جمعها ميدانيًا ، جنبًا إلى جنب مع بروتوكولات لتحديد التصنيف للحمض النووي الريبي المعبر عنه ، واستنتاج وظيفة EM بناءً على metatranscriptomics النباتية والفطرية. استخدمنا أجزاء منسوخة من جينات الحمض النووي الريبي الريبوسومي لتحديد العديد من الأصناف الفطرية المهيمنة نسبيًا المرتبطة بالصنوبر الفصيصي بما في ذلك أمفينيما, رussula و صiloderma النيابة. أحد الأصناف ، صiloderma croceum، لديه جينوم متاح للعامة سمح لنا بتحديد أنماط المحتوى الجيني ووفرة النسخ. أكثر من 1500 معبر عنها بكثرة صiloderma تم الكشف عن الجينات من جذور الفطريات ، بما في ذلك جينات التمثيل الغذائي للبروتين ، وإشارات الخلية ، ونقل الإلكترون ، وتخليق التربين وأنشطة أخرى خارج الخلية. فى المقابل، صiloderma أظهر الجين المشفر لناقل الأمونيا أعلى وفرة في عينات التربة. تسلط منهجيتنا الضوء على إمكانات النسخ الوصفية لتحديد الجينات المرتبطة بالتعايش ووظيفة النظام البيئي باستخدام العينات التي تم جمعها ميدانيًا.

الشكل S1. موقع مواقع التجميع.

الشكل S2. تسلسلات الحمض النووي الريبي الريبوسومي الجزئية الكبيرة (منطقة D2 ، 180 نقطة أساس) لأكثر الأصناف الفطرية السائدة المكتشفة من مجموعات جذر الفطريات (الشكل 3).

الشكل S3. التنسيب الوراثي لتسلسل LSU RNA لمدة ثلاثة بيلوديرما النيابة. على أساس منطقة الوحدة الفرعية الكبيرة الريبوسومية D2. تمت محاذاة التسلسلات مقابل التسلسلات المرجعية المحددة تصنيفياً لـ بيلوديرما النيابة. من GenBank مع تحليلات النشوء والتطور ClustalW التي أجريت باستخدام معيار البخل في PAUP 3.0. تظهر شجرة التمهيد ("التمهيد السريع" مع 300 نسخة مكررة) موضع ثلاثة بيلوديرما النيابة.

الشكل S4. تسلسل النوكليوتيدات والببتيد بيلوديرما المؤثرات: (A) PiCr1 و (B) PiBas و (C) PiSs1 و (D) PiEsp. تظهر تسلسلات الإشارات المفترضة في تسلسل الببتيد (غامق ومسطّر). في (أ) ، يظهر الترتيب المتماثل لبقايا السيستين (C) بخط غامق.

الشكل S5. أظهرت المخططات الشريطية الهياكل الثلاثية المتوقعة لـ (A) PiCr و (B) PiBas و (C) PiSs1 و (D) PiEsp. تم عرض الهياكل الحلزونية (الوردية) والصفائح (الصفراء). يتم تسمية طرفي N و C. تم توقع الهياكل الثلاثية للبروتين باستخدام I-TASSER v 3.0 (Zhang 2008 Roy وآخرون. ، 2010 روي وآخرون. ، 2012). درجة C هي درجة ثقة لتقدير جودة النماذج المتوقعة من قبل I-TASSER. يتم حسابه بناءً على أهمية محاذاة قالب الترابط ومعلمات التقارب لمحاكاة تجميع الهيكل. تقع درجة C في النطاق من -5 إلى 2 ، حيث تشير الدرجة C ذات القيمة الأعلى إلى نموذج يتمتع بدرجة عالية من الثقة.

الشكل S6. صور جزئية للتصور لقراءات عينات الجذر تم تعيين Bowtie إلى مرجع 28S rRNA (gi300394395 ، بيلوديرما فلاكس) باستخدام عارض الجينوم التكاملي 2.2 × (Thorvaldsdóttir وآخرون. 2013). تم العثور على تسلسلات أقل ومتغيرة في منطقة متغيرة (D1 و D2) مقارنة بالمناطق المحفوظة في 28S. يشير المربع الأحمر إلى المنطقة (180 نقطة أساس) حيث تم استخراج القراءات لتحديد الأصناف الفطرية في هذه الدراسة. تشير الأشرطة المعينة باللون الأزرق إلى أن حجم الإدخال المستنتج على الجين المرجعي أصغر من المتوقع نظرًا لأن الحجم الفعلي للإدخال الأحمر هو حجم الإدخال المستنتج على الجين المرجعي أكبر من المتوقع نظرًا لحجم الإدخال الفعلي.

الشكل S7. تسلسل الأحماض الأمينية المتوقعة لـ PiAMT.

الجدول S1. مقارنة بين طرق استخراج الحمض النووي الريبي لجذور الصنوبر (EM) والإبر.

الجدول S2. قراءة ونسبة القراءة المرتبطة بنصوص الفطريات والبكتيريا والصنوبر في مجموعات جذر EM التي اكتشفتها Illumina HiSeq.

الجدول S3. التركيب التصنيفي لمجموعات جذر EM استنادًا إلى (A) تسلسل ITS DNA amplicon (B) نسخ متواليات ITS RNA ، و (C) الريبوسوم RNA (منطقة LSU D2). (أ - ج) يتم عرض الأعداد المطلقة (عدد القراءة) والقيمة النسبية (نسبة القراءة٪).

الجدول S4. التعبير العالي عن مجموعات الجينات Piloderma في عينات التربة والجذور.

تم اختيار العائلات الجينية ذات النسبة المئوية للقراءة و GT0.02 في عينة على الأقل. أظهر الجدول S4A عدد قراءات عائلات الجينات الفردية التي تم الحصول عليها من عينات الجذر والتربة. أظهر الجدول S4B قائمة معرف بروتين Piloderma من قاعدة بيانات PilCr1 لكل مجموعة جينية.

الجدول S5. التعبير النسبي عن بينوس تايدا جينات مجموعات الجذر الفطري. تم تطبيق حزمة Deseq 1.14.0 (Anders and Huber ، 2010) لتطبيع القراءات المعينة صنوبر تايدا قاعدة بيانات EST (Deseq & gt 100 cutoff). Simon Anders and Wolfgang Huber (2010): تحليل التعبير التفاضلي لبيانات عد التسلسل. بيولوجيا الجينوم 11: R106.

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


شكر وتقدير

الكتاب ممتنون بصدق للدكتور. C. Li و C. Fitzsimmons لتوفير كافة السجلات المظهرية لعجول الأبقار. شكراً جزيلاً لـ X. Sun و F. Cox لمساعدتهم في بناء مكتبة عزل الحمض النووي / الحمض النووي الريبي وتسلسلها. نشكر جميع أعضاء مجموعة الدكتور L.L Guan على مساعدتهم في أخذ العينات.

التمويل

تم دعم هذا العمل ماليًا من قبل وكالة ألبرتا للثروة الحيوانية واللحوم (إدمونتون ، كندا) بموجب أرقام المنح 2013R029R و 2015P008R. بالإضافة إلى ذلك ، تم دعم FL و LLG أيضًا من خلال منحة طلاب الدراسات العليا في Alberta Innovates-Technology Futures و NSERC Discovery Grant ، على التوالي. تم تمويل CJC من قبل مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية ، المملكة المتحدة (BBSRC) أرقام المنح: BB / E / W / 10964A01 و BBS / OS / GC / 000011B. تم تمويل TCAH من خلال الصندوق النيوزيلندي للشراكات العالمية في أبحاث انبعاثات الثروة الحيوانية (GPLER).

توافر البيانات والمواد

تم إيداع تسلسل الكرش الميتاجينوم ، و metatranscriptome القائم على الحمض النووي الريبي ، وتسلسل metatranscritpome المخصب بالـ mRNA في أرشيف قراءة تسلسل NCBI (SRA) برقم الانضمام PRJNA448333.


نتائج

تكوين المجتمع لمجموعات البروتيست العظمى

في المجموع ، تم الحصول على 32808 نسخة من النسخ SSU rRNA من الطلائعيات من 12 metatranscriptomes للتربة (الجدول 1). في جميع الحالات ، أسفرت التكرارات البيولوجية لكل موقع عن تركيبة مجتمعية متشابهة جدًا (الشكل 1) وتم تجميعها معًا في تحليل الكتلة (الشكل 2). جميع مجموعات البروتيست الخمس العملاقة وفقًا لـ Adl et al. (2012) تم العثور عليها في كل موقع (الجدول 1 الشكل 1). مجموعة SAR ، التي تتكون من المجموعات العملاقة المستقلة سابقًا سtramenopiles ، أlveolata و رhizaria ، سيطرت على المجتمعات النشطة في جميع المواقع مع تسلسل Rhizaria الأكثر عددًا. لاحظنا انقسامًا واضحًا في تكوين المجتمع الأولي (الشكل 2) مع هيمنة Alveolata في تربة الخث ذات الرطوبة العالية ومحتوى المواد العضوية المرتفع ، مقابل هيمنة Rhizaria و Amoebozoa في الأراضي العشبية وتربة الغابات ، بما في ذلك نفايات الغابات (الشكل 1).

التركيب المجتمعي للمجموعات الكبيرة من الطلائعيات في التربة التي تم فحصها. للحصول على معلومات مفصلة عن معلمات التربة ، انظر الجدول 1.

طريقة المجموعات غير الموزونة للأزواج (UPGMA) لتحليل المجموعات لتقييم الاختلافات بين المجتمعات المحتوية على التربة في التربة. للحصول على معلومات مفصلة عن خصائص التربة والاختصارات ، انظر الجدول 1.

كانت Rhizaria مكونة بشكل حصري تقريبًا من Cercozoa (الشكل 3 أ) مع هيمنة الرنا الريباسي للجلطات الصغيرة التي تنتمي إلى فئة Filosa-Sarcomonadea (تم دمجها سابقًا في Cercomonadida) وكلاهما ، Cercozoa والجلد الأميبي في فئة Filosa-Imbricatea (سابقًا Silicofilosea) . حدث Foraminiferan SSU rRNAs بشكل ثابت نسبيًا ، وإن كان بكميات منخفضة في جميع العينات (الشكل 3 أ) باستثناء موقع أرض الخث 'Knutsen' ، حيث كانت أكثر وفرة وشكلت 22 ٪ من جميع Cercozoa. كانت Alveolate SSU rRNAs متغيرة تمامًا بين العينات وتهيمن عليها في تربة الخث (الشكل 1) مع فصيلة Ciliophora وأوامرها الرئيسية Spirotrichea و Colpodea و Oligohymenophorea الأكثر وفرة ، في حين أن Apicomplexa الطفيلية الحصرية لا تزال تمثل ما يصل إلى 11 ٪ من جميع Alveolata ( الشكل 3 ب). كانت المجموعة الثالثة في SAR ، Stramenopiles ، أقل وفرة ، مع Oomycetes يمثل stramenopiles السائدة في تربة الغابات (الشكل 3 ج) ، في حين أن النسخ الوفيرة من Bacillariophyta التمثيل الضوئي كانت مميزة في تربة أراضي الخث المشبعة بالمياه. تم العثور على الحمض الريبي النووي الريبي Chrysophyceaen SSU بكثرة في تربة الأراضي العشبية والقمامة ، وكذلك كانت نسخ Bicosoecida. تمثل المجموعة العملاقة Amoebozoa ما يصل إلى 30 ٪ من SSU rRNAs ، مع أعلى وفرة في عينات تربة الأراضي العشبية والغابات (الشكل 1 والجدول 1). كانت المجموعات الأولية الأخرى ، أي Excavata و Archaeplastida و Opisthokonta (باستثناء الفطريات والحيوانات) أقل وفرة بشكل عام (الشكل 1 والجدول 1 انظر الجدول التكميلي 1 لمزيد من المعلومات).

يُظهر تكوين المجتمع داخل مجموعة SAR supergroup بشكل مستقل التراكيب المجتمعية داخل الكتل الفردية لـ SAR ، أي Rhizaria (أ) ، Alveolata (ب) و Stramenopiles (ج). المبينة هي وسائل مكررات بيولوجية. Labels and sites as described in Table 1 and Figures 1 and 2.

SSU rRNA transcripts of protist clades highly represented in cultivation-based approaches were analysed to evaluate whether these clades were also recovered in our metatranscriptomes. Among the clades targeted were flagellates of the supergroups SAR (Glissonomadida and Cercomonadida (Sarcomonadea Rhizaria), Chrysophyceae and Bicosoecida (Stramenopiles) and Excavata (Bodonidae and Euglenida), as well as amoebae in the supergroup Excavata (Heterolobosea). All clades were found at each location, with cercomonads being highly abundant in grassland and forest habitats. Glissomonads were abundant especially in grasslands (5% of all protists). Bodonids were also common (1.9% of all protists) whereas euglenids, chrysophytes, bicosoecids and heteroloboseans comprised only about 1% of all protist transcripts (Supplementary Table 1). Exhaustive analyses of the most abundant clades of amoebae are presented in the next section.

Community composition of amoebozoa

The supergroup Amoebozoa was of particular interest, as no comprehensive molecular taxonomic analysis of this protist supergroup in soil exists to date because of PCR-primer biases (Baldwin et al., 2013 Bates et al., 2013). For this purpose, we constructed a high-resolution reference database and taxonomy of Amoebozoa (see Table 2 and Materials and Methods for details). Using this taxonomic assignment approach, the rather short SSU rRNA sequence reads could reliably be classified at least to the order, often even to the genus level. Amoebozoa were highly diverse at each sampling site, with rRNAs assigned to four classes, that is, Tubulinea, Discosea, Variosea and Mycetozoa with major orders Euamoebida, Leptomyxida, Arcellinida and Centramoebida (Smirnov et al., 2011) (Figure 4). The community composition within Amoebozoa differed significantly between sites. For instance, sequences assigned to the dominant class Tubulinea made up between 27.4% and 69.2% in Solvatn peat and forest soils, respectively, and were inversely related to Discosea with 41.6–12.7% in Solvatn peat and forest soils. Similar to the patterns observed at the class level, the proportional distribution within classes differed between sites. Among Tubulinea, the dominant order Euamoebida reached highest relative abundances in grasslands and forest mineral soils, while testate amoebae of the order Arcellinida became more abundant in organic rich substrates of litter and peat soils, and Leptomyxida were characteristic of forest habitats. The remaining tubulinean orders Echinamoebida and Nolandida were generally rare. Among the class Discosea, SSU rRNAs assigned to the subclass Longamoebia were almost entirely (96.1%) composed of the order Centramoebida. Sequences of the discosean subclass Flabellinia were generally less abundant (7.0% oas) and mostly derived from the order Vannellida (50.1% of flabellinian SSU rRNAs). Sequences assigned to the subphylum Conosa could only reliably be assigned to the class level, as taxonomy and the phylogenetic affiliations, especially of protists in the class Variosea, are still largely unresolved (Adl et al., 2012). Variosea was the dominant conosan class in grassland, forest and the Solvatn peat soil, while Mycetozoa were more abundant in forest litter and Knutsen peat soil (Figure 4).

Community composition within the supergroup Amoebozoa in the investigated soils. Shown are means of biological replicates. Labels and sites as described in Table 1 and Figures 1 and 2.

Widespread were amoebozoan SSU rRNA sequences with high sequence identity to potential parasites. At all sites occurred diverse sequences related to facultative human pathogens of the genus Acanthamoeba ( ⩾ 97% sequence identity 1.1–4.4% oas) while sequences most closely resembling Balamuthia were discovered in low relative abundance (0.1–0.5% oas) in all except the grassland soils. Transcripts related to groups of non-Amoebozoan parasitic taxa were also found, such as sequences most closely resembling the human pathogen Naegleria fowleri (Heterolobosea in the supergroup Excavata ⩾ 97% sequence identity) in all four arctic peat samples. Further, opisthokonta Ichthyosporea (mainly animal parasites) were ubiquitously found (0.4–3.3% oas Supplementary Table 1) as well as predominantly plant-parasitic plasmodiophorans (up to 0.8% oas).

Widespread presence of foraminifera and choanoflagellida in soils

SSU rRNA transcripts of the typically marine groups Foraminifera and Choanoflagellida revealed their general presence and activity in all samples (Figure 5), and for the first time, allowed to estimate the relative abundance of these taxa in soils. They comprised between 0.1% and 3.5% of all protist SSU rRNAs.

SSU rRNA transcript abundance±s.d. of Foraminifera and Choanoflagellida in the soil metatranscriptomes. Labels and sites as described in Figure 2 and Table 1.

To enable better taxonomic assignment and phylogenetic placement of these enigmatic soil protist groups we, assembled larger SSU rRNA sequences from the short 454 reads. Three assembled SSU rRNA contigs of Foraminifera (742–890 bp length) were quite similar ( ⩾ 91%) to sequences obtained in a recent focused PCR-based molecular survey targeting soil Foraminifera (Lejzerowicz et al., 2010), but showed substantial sequence dissimilarity to described species (maximum SSU rRNA sequence identity of ≤76%). Several unassembled SSU rRNA sequences, however, closely matched sequences typically obtained from freshwater and marine environments, such as the genera Astrammina, Bathysiphon, Allogromia and diverse uncultured species (Supplementary Table 2).

Many Choanoflagellida-affiliated SSU rRNA sequences closely matched (with ⩾ 99% maximum identity) published sequences of uncultivated choanoflagellates (for example, with GenBank accession numbers HQ219439 (freshwater), EF024012 (soil), JF706236 and GQ330606 (peat soil)) while others reached similarities of >95% with uncultivated choanoflagellate sequences among typical freshwater and marine genera, such as Monosiga, Codonosiga, Salpingoeca, and more rarely with Lagenoeca, Stephanoeca, Didymoeca, Diaphanoeca, Desmarella و Acanthoeca. Five assembled long SSU rRNAs (763–1163 bp) had high sequence similarities of 96–99% to uncultivated freshwater choanoflagellates (Figure 6), but the closest hit to a formally described species was <92%.

Maximum likelihood tree of Choanoflagellida placing assembled long SSU rRNA contigs (red) with sequences of described and uncultivated choanoflagellates. Seventy-one sequences with 1232 unambiguously aligned positions were used the tree is unrooted values higher than 50 for maximum likelihood analyses (left) and 0.50 for Bayesian analyses (right) shown. Black circles indicate full support.


معلومات الكاتب

الانتماءات

Canadian Center for Computational Genomics, McGill University and Genome Quebec Innovation Center, Montréal, H3A 1A4, Canada

Department of Human Genetics, McGill University, Montreal, H3A 1B1, Canada

Institut de recherche en biologie végétale, University of Montreal, Montreal, QC, H1X 2B2, Canada

F. E. Pitre, J. Marleau, M. St-Arnaud, M. Labrecque, S. Joly & N. J. B. Brereton

Montreal Botanical Garden, Montreal, QC, H1X 2B2, Canada

F. E. Pitre, M. St-Arnaud, M. Labrecque & S. Joly

Aquatic and Crop Resource Development (ACRD), National Research Council Canada, Montréal, QC, H4P 2R2, Canada

Department of Agri-food and Environmental Science, University of Florence, Viale delle Idee, Sesto Fiorentino, FI, Italy

Institut National de la Recherche Scientifique, Centre INRS–Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Canada

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

مساهمات

EY, MSA, SJ, ML and FP conceived and designed the study. JM, WGN and AP performed the plant growth trials, sample and sequencing preparation. EG and NJBB analysed the data and drafted the manuscript. All authors commented on and approved the final manuscript.


شاهد الفيديو: المصمم آدم. تعلم طريقة إحترافية لإظهار النص من خلف عنصر (شهر نوفمبر 2021).