معلومة

7.4: التمرين 2 - توقع أحجام منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل - علم الأحياء


في المختبر التالي ، ستحلل منتجات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الاغاروز الذي يفصل جزيئات الحمض النووي وفقًا لأحجامها. يجب أن تحتوي جميع منتجات PCR على جزء من التقى المنطقة المحيطة بجين 5’s بسبب التمهيدي أ. قد يحتوي منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل أو لا يحتوي على أجزاء من التقى CDS للجينات ، اعتمادًا على ما إذا كنت تقوم بتحليل سلالة مع الأم أو معطلة التقى الجين. تحتوي هذه السجلات على CDS الخاص بك التقى الجين مع 1 كيلو بايت من المنبع و 1 كيلو بايت من تسلسل المصب. في S. cerevisiae، عادة ما توجد هذه العناصر التنظيمية في حدود 1 كيلو بايت من CDS.

A هو 357 نيوكليوتيدات منبع SAM1بدء الكودون (نيوكليوتيد 1001). تضيف منتجات Primer B المرتكزة 280 نقطة أساس من أقراص CDS إلى منتج PCR. الحجم المتوقع لمنتج PCR هو 357 + 280 نقطة أساس ، أو 637 نقطة أساس. إذا تم استخدام سلالة الحذف لـ PCR ، فإنSAM1 لا ينتج عن البادئات A و B منتج PCR. في حين أن، SAM1 التمهيدي أ وكانص سيولد التمهيدي B منتج 607 نقطة أساس (357 + 250) ، لأن كانص التمهيدي B يرتبط بالنيوكليوتيدات 231-250 من كانص CDS.

ستحتاج إلى نافذتي متصفح لهذا التمرين. يجب أن يعمل كل عضو في المجموعة بجين واحد.

ابحث عن التسلسل الجيني لجينك.

• انتقل إلى صفحة ملخص الجين في SGD (yeastgenome.org)
• انقر فوق علامة التبويب التسلسل في أعلى صفحة الملخص.
• قم بالمؤشر لأسفل إلى تسلسل الجينات لـ S288C. حدد "تسلسل الجينوم +/- 1 كيلو بايت" من مربع القائمة المنسدلة.
• لاحظ أدناه إحداثيات البداية والنهاية للتسلسل وحساب طول التسلسل. (يجب أن ترى كود بدء ATG عند النيوكليوتيدات 1001-1003.)

طول التسلسل (بي بي) __________

طول تسلسل الترميز ___________

محاذاة تسلسل التمهيدي مع التسلسل الجيني.

للعثور على موضع البادئات في التسلسل الجيني ، سنستخدم أداة BLAST من NCBI. يرمز "بلاست" إلى "أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية" ويمكن استخدامه لمحاذاة تسلسل البروتين أو الحمض النووي. سوف تتعلم المزيد عن خوارزميات بلاست في الفصل التاسع.

  • قم بتوجيه المستعرض الخاص بك إلى موقع NCBI وحدد BLAST من قائمة الموارد الموجودة على اليمين.
  • حدد Nucleotide BLAST من قائمة برامج BLAST الأساسية.
  • انقر على المربع "محاذاة تسلسلين أو أكثر". انسخ ال "التسلسل الجيني +/- 1 كيلوبايت " من عند

    SGD والصق التسلسل في مربع تسلسل الموضوع السفلي.

  • اكتب تسلسل Primer A للجين الخاص بك في مربع الاستعلام.
  • اضبط خوارزمية بلاست لتسلسل قصير. تسلسلات التمهيدي التي نستخدمها

    هي 25 نيوكليوتيدات طويلة. هذا أقصر من القيمة الافتراضية 28 لـ "الكلمات" في BLASTN (خوارزمية مقارنة متواليات النيوكليوتيدات). لن يقوم BLAST بمحاذاة تسلسلين إذا كان التطابق أصغر من 28 نيوكليوتيد. قم بتوسيع "معلمات الخوارزمية" في أسفل الصفحة. حدد "حجم الكلمة" أقل من 28.

  • انقر فوق انفجار. تُظهر نتائج BLAST جدولًا يوضح كل تطابق بين التمهيدي وتسلسل الجينوم. يجب أن تكون النتيجة الأولى تطابقًا تامًا بين التمهيدي وتسلسل الجينوم. (تحقق من كتابتك إذا لم تكن مطابقة تمامًا!) سجّل البداية والنهاية النيوكليوتيدات في تسلسل الحمض النووي الجيني حيث تتطابق مع التسلسل التمهيدي.
  • كرر محاذاة BLAST للبرايمر ب. انقر فوق "تحرير وإعادة الإرسال" في أعلى صفحة نتائج بلاست. امسح مربع الاستعلام واكتب تسلسل التمهيدي ب. انقر فوق BLAST وقم بتسجيل نتائج المحاذاة. في النتائج ، لاحظ أن أرقام النوكليوتيدات الأولية تتصاعد ، بينما أرقام نوكليوتيدات الحمض النووي الجينومي بترتيب تنازلي. وذلك لأن تسلسل Primer B هو التكملة العكسية لتسلسل الجينات.

    ارسم خريطة لمواقع الربط الجيني والتمهيدي في المساحة أدناه. قم بتضمين كود البدء والمسافات في bp.

احسب أحجام منتجات PCR التي سيتم إنشاؤها باستخدام:

التمهيدي أ والبرايمر ب

التمهيدي أ و كانص التمهيدي ب


تحديد درجات حرارة التلدين لتفاعل البلمرة المتسلسل

أنجيلا آر بورتا ، إدوارد إنرز تحديد درجات حرارة التلدين لتفاعل البوليميراز المتسلسل. مدرس الأحياء الأمريكي 1 أبريل 2012 74 (4): 256-260. دوى: https://doi.org/10.1525/abt.2012.74.4.9

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو أسلوب شائع يستخدم في تدريس العلوم في المدارس الثانوية والجامعية. غالبًا لا يفهم الطلاب تمامًا المبادئ الأساسية للتقنية وكيف يؤثر تحسين البروتوكول على النتيجة والتحليل. في مختبر البيولوجيا الجزيئية هذا ، يتعلم الطلاب خطوات تفاعل البوليميراز المتسلسل مع التركيز على تكوين التمهيدي ودرجة حرارة التلدين ، والتي يتلاعبون بها لاختبار التأثير على تضخيم الحمض النووي الناجح. يصمم الطلاب تجارب لاختبار فرضياتهم ، ويعززون نهجًا قائمًا على الاكتشاف للتدريس المختبري وتطوير التفكير النقدي ومهارات التفكير.

يعد تحليل الحمض النووي بواسطة تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) تقنية بسيطة بشكل ملحوظ تسمح بتضخيم كميات دقيقة من الحمض النووي. أدى التوافر التجاري للمجموعات إلى جعل المختبرات التي تستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل أكثر شيوعًا في فصول العلوم بالمدارس الثانوية والجامعية. يستخدم الطلاب تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد نوع الحمض النووي وبصمات الأصابع (Baker et al. ، 2002) ، لتحديد الملوثات البكتيرية (Baker et al. ، 1999) ، والاستنساخ لجين معين مهم (Dong et al. ، 2008). غالبًا ما تكون معلمات هذه التجارب قياسية ومحددة مسبقًا. يدير الطلاب التفاعلات دون أن يكون لديهم تقدير حقيقي للتفاصيل التجريبية الهامة المطلوبة لتضخيم جزء معين من الحمض النووي.

تتضمن دورة PCR ثلاث خطوات: التمسخ ، التلدين التمهيدي ، وتمديد التمهيدي. تتطلب كل خطوة من هذه الخطوات حضانة خليط التفاعل عند درجات حرارة مختلفة. في الخطوة الأولى ، التمسخ ، يتم تحضين الحمض النووي عند 93-95 درجة مئوية من 30 ثانية إلى دقيقتين. هذا يكسر الروابط الهيدروجينية بين أزواج قاعدة النيوكليوتيدات (bp) ويفصل بين خيوط الحمض النووي. في الخطوة الثانية ، التلدين التمهيدي ، يتم تحضين التفاعل عند 45-65 درجة مئوية لمدة 45 ثانية إلى دقيقة واحدة ، ويسمح وجود البادئات التكميلية بالتهجن لاستهداف الحمض النووي. الخطوة الثالثة ، التمديد التمهيدي ، يتم إجراؤها عند 72 درجة مئوية من 15 ثانية إلى دقيقة واحدة وتنطوي على تخليق الحمض النووي ، حيث يتم استخدام البادئات لتجميع خيطين ابنتيين جديدين مكملان للخيوط الأم الأصلية. سوف تقوم دورات PCR اللاحقة بتكرار كل منتج PCR في خليط التفاعل ، مما يؤدي إلى التضخيم الأسي لتسلسل هدف DNA.

احتاج المبتكرون الأوائل لـ PCR إلى تحسين هذا الإجراء. في البداية ، يجب إضافة بوليميراز DNA جديد بعد كل خطوة تمسخ. في النهاية ، تم اكتشاف شكل مستقر حرارياً في بكتيريا الينابيع الساخنة ثيرموس أكواتيكوس (طق) ، ومن هنا المصطلح طق بوليميريز الحمض النووي. تتطلب كل فترة حضانة نقل أنابيب الاختبار يدويًا من درجة حرارة إلى أخرى حتى ظهور الدورة الحرارية ، والتي تنظم درجات حرارة الدراجات تلقائيًا.

حتى في "العالم الحقيقي" للبحث العلمي ، يتم استخدام مجموعات PCR المتاحة تجاريًا ، ولكن عادةً ما يتم توفير مكونين مهمين من PCR من قبل العالم. يقوم الباحثون بتزويد البادئات الخاصة بهم ، والتي تم تصميمها لتصلب تسلسل DNA محدد ، وتضخيم قالب الحمض النووي. سيكون PCR المثالي محددًا ، مما ينتج عنه منتج تضخيم واحد فقط ، ويكون فعالًا ، وينتج عنه زيادة مضاعفة نظريًا للمنتج لكل دورة PCR ، ولديه الدقة ، ويعيد إنتاج التسلسل الدقيق للقالب. تتأثر كل من هذه المعلمات بالمتغيرات داخل خليط تفاعل PCR مثل مكونات المخزن المؤقت ، ورقم التدوير ، ودرجة الحرارة ، ومدة كل خطوة دورة ، وتكوين التمهيدي ، وقالب الحمض النووي. في هذا التمرين المختبري ، يستخدم الطلاب مجموعتين من البادئات لتحديد درجة حرارة التلدين المثلى في تكوين منتج PCR لتحسين كفاءة التضخيم. نستخدم هذا التمرين في دورة مختبر فسيولوجيا الخلية لطلاب المرحلة الجامعية العليا. كما أنه مناسب لدورات AP Biology ، حيث قد يتوفر التمويل لمزيد من التدريبات المعملية المتقدمة.


يتكون الملحق من ثلاثة أزواج من الكروموسومات المحاكية ، ممثلة بالكروموسوم 1 (نسختان) ، والكروموسوم 2 (نسختان) ، والكروموسوم 3 (نسختان). لاحظ أن كل كروموسوم يختلف فقط في عدد VNTRs الموجودة. يتم وضع خط تحت VNTR مرة واحدة. ثم يتكرر النمط المسطر للنيوكليوتيدات عدة مرات ، ويختلف في كل نسخة من الكروموسوم. على سبيل المثال ، في الكروموسوم 1 ، نمط VNTR لـ ccttaacgat موجود إما 9 مرات أو 21 مرة بينما باقي تسلسل الكروموسوم متطابق. يجب أن يُعطى كل طالب تسلسلين من الكروموسوم 1. من المهم أن نلاحظ أنه في البشر ، تكون إصدارات معينة من الكروموسوم أكثر بروزًا من غيرها. إذا كان لديك 20 طالبًا ، فيجب عليك عمل 40 نسخة من الكروموسوم 1 ، ولكن قد يكون لديك 30 من تلك النسخ التي تحتوي على 9 تكرارات من VNTR بينما تحتوي 10 نسخ فقط على 21 نسخة مكررة (كمثال). بمعنى آخر ، مثلما يتلقى الطلاب نسختين من الكروموسوم 1 ، واحدة من والدهم والأخرى من والدتهم ، في هذا التمرين قد يكون لدى الطلاب 9 نسخ متطابقة لكلا النسختين ، سيحصل البعض على 9 نسخ متكررة و 21 نسخة متكررة ، وقد يرسم البعض كلا النسختين ذات 21 تكرارًا.

يتم إعداد الكروموسومات الثانية والثالثة بنفس الطريقة ، على الرغم من اختلاف VNTRs في الطول ونمط التسلسل. يوصى عند عمل نسخ من الكروموسومات بتقليد الظروف الحقيقية عن طريق تغيير نسبة كل كروموسوم يستطيع الطلاب الوصول إليه. في النهاية ، سيحصل كل طالب على نسختين من الكروموسومات 1 و 2 و 3 ، ويمثل كل زوج كروموسوم واحد من والدة الطالب وواحد من الأب. في هذه الممارسة ، نقصر التجربة على ثلاثة كروموسومات فقط مع اختلافين VNTR لكل كروموسوم. في الواقع ، غالبًا ما توجد VNTRs في أكثر من شكلين لكل موقع كروموسوم ، وبالتالي يمكن تمثيلها بأكثر من نسختين من كل كروموسوم إذا اختار المدرب ذلك. أيضًا ، لن يزداد التنوع في مجموعات الكروموسومات بشكل كبير إلا عند استخدام 23 زوجًا من الكروموسومات (العدد الفعلي للأزواج التي تحتويها الخلايا البشرية) مع إمكانية VNTRs متعددة لكل كروموسوم. أخيرًا ، يتم عرض الكروموسومات المتوفرة في هذا التمرين فقط بتنسيق أحادي السلسلة. اشرح لكل طالب أن الحمض النووي مزدوج الشريطة وأنه يجب أن نتخيل كل G (جوانين) يتفاعل مع C (السيتوزين) وكل A (الأدينين) يتفاعل مع T (الثايمين). لم يتم تسمية الكروموسومات بنهايات 5 و 3. يمكن توضيح أهمية هذه التفاصيل وتأثيرها على تصميم التمهيدي إذا اختار المدرب القيام بذلك يتطلب ذلك مجرد استبدال ملصق 5-في كل منطقة معدة بعلامة النجمة. في محاولة لمنع القيود في استخدام المعلم ، لم يتم توضيح تفاصيل الاتجاهية 5 - 3 - في هذا التمرين وليست مطلوبة من الناحية المفاهيمية لفهم الدور العام لـ VNTRs في التعرف على نمط DNA الفريد.


شاهد الفيديو: DNA extraction and PCR - Dr Amera A Genedy (كانون الثاني 2022).