معلومة

أي المصطلحات أفضل: نظام التعبير غير المتجانسة أم نموذج الخلية غير المتجانسة؟


أقرأ ورقة في مجلة وقرأت أن المؤلفين عبروا عن المجال خارج الخلية للبروتين NCAM2 الذي يوجد عادة في الدماغ في خلايا CHO. أعلم أن هذا مثال على تعبير غير متجانس.

ومع ذلك ، عند الإشارة إلى خلايا CHO التي تفرط في التعبير عن NCAM2 ، أتساءل عما إذا كان مصطلح "نظام التعبير غير المتغاير" أكثر ملاءمة مقارنة بـ "نموذج الخلية غير المتجانسة"؟

هي موضع تقدير أي رؤى.


أود أن أقترح أن المصطلح المفضل يعتمد على ما إذا كنت تتحدث عن الخلايا أو تتحدث عن التعديلات.

بعبارة أخرى ، أود أن أشير إلى حزمة تعبير NCAM2 باسم "نظام التعبير غير المتغاير" ، والذي يتم دمجه بعد ذلك في منصة CHO من أجل إنشاء "نموذج خلية متغاير".

سبب هذا الاقتراح هو أن حزمة التعبير هي البنية الأساسية التي بدونها لا يوجد تعبير ، وأنه من المحتمل نقل هذه الحزمة إلى خطوط خلوية أخرى لإنشاء نماذج خلوية أخرى.


منشأة أساسية لتعبير البروتين وتنقيته

بعد أن تقرر أي بروتين أو مجال (مجالات) البروتين الذي ترغب في استنساخه والتعبير عنه ، عليك التفكير في نظام التعبير الذي ترغب في استخدامه. تتوفر حاليًا أنظمة التعبير التالية:

هنا نقصر أنفسنا على الأنظمة الثلاثة التالية لأنها الأكثر ملاءمة لإنتاج البروتينات على نطاق واسع:

  • الإشريكية القولونية: التعبير عن البروتينات في بكتريا قولونية هي الطريقة الأسهل والأسرع والأرخص. هناك العديد من نواقل التعبير التجارية وغير التجارية المتاحة مع علامات N- و C- طرفية مختلفة والعديد من السلالات المختلفة التي تم تحسينها للتطبيقات الخاصة (للمستخدمين المحليين: انظر قاعدة بيانات الإجهاد).
  • خميرة: الخميرة هي كائن حقيقي النواة ولها بعض المزايا والعيوب على الإشريكية القولونية. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية في أن مزارع الخميرة يمكن أن تنمو إلى كثافات عالية جدًا ، مما يجعلها مفيدة بشكل خاص لإنتاج البروتين المسمى بالنظائر من أجل الرنين المغناطيسي النووي. أكثر سلالات الخميرة استخدامًا هما Saccharomyces cerevisiae والخميرة methylotrophic Pichia pastoris.
  • خلايا الحشرات المصابة بفيروس باكولوفيروس: تعد خلايا الحشرات نظامًا حقيقيًا للنواة أعلى من الخميرة وهي قادرة على إجراء تعديلات ما بعد الترجمة أكثر تعقيدًا من النظامين الآخرين (انظر مقارنة أنظمة التعبير). لديهم أيضًا أفضل آلية لطي بروتينات الثدييات ، وبالتالي ، يمنحك أفضل فرصة للحصول على بروتين قابل للذوبان عندما تريد التعبير عن بروتين من أصل ثديي. عيوب خلايا الحشرات هي التكاليف الأعلى والمدة الأطول قبل الحصول على البروتين (عادة أسبوعين).
  • خلايا الثديات: تستخدم معظم المعامل خطوط خلايا HEK (الكلى الجنينية البشرية) أو CHO (مبيض الهامستر الصيني) للتعبير التحضيري عن البروتينات الأكثر تعقيدًا والتي تحتاج أيضًا إلى تعديلات مناسبة بعد الترجمة. يمكن استخدام كلا الخطين الخلويين لكل من تعبير خط الخلية العابر والمستقر والذي يستغرق وقتًا أطول بسبب توليد خطوط خلوية مستقرة ولكنه يوفر إنتاجية أعلى وتباينًا أقل إذا كان الإنتاج طويل الأجل للبروتين المستهدف مطلوبًا. في حين أن هذه الخلايا عادة ما تتمتع بقدرة عالية على إنتاج البروتين المُفرَز (حتى 10 أو 100 ميلي غرام لكل لتر ، وغالبًا ما تكون عدة جرامات لكل لتر في خطوط الخلايا للبروتينات التجارية) ، فإن مستويات التعبير عن البروتينات داخل الخلايا عادة ما تكون أقل بكثير.

لتحديد النظام الأفضل ، اسأل نفسك الأسئلة التالية:


مقدمة

يوفر استخدام أنظمة التعبير غير المتجانسة وناقلات التعبير أداة قوية لدراسة الوظائف الخلوية لجينات معينة في بيئتها الخلوية الطبيعية أو في الكائنات المضيفة المتخصصة (بورو وآخرون ، 2005). في هذا السياق ، يتم استنساخ الجين المعني مع محفز مناسب في مضيف غير متجانس (Gr & # x000e4slund et al. ، 2008). هذا النهج له أهمية خاصة في دراسة الأمراض الطفيلية ، مثل داء البلهارسيات ، حيث يتم إعاقة التوصيف الوظيفي للطفيلي خاصة لأن هذه الكائنات غير قابلة للتلاعب الجيني ولا يمكن استزراع دورة حياتها بأكملها في المختبر (الرفاعي وآخرون ، 2011 Suttiprapa et al. ، 2012 Liang et al. ، 2013). على الرغم من أنه من الصعب تحقيق التلاعب الجيني في الديدان الطفيلية ، فقد تم الإبلاغ عن تقدم كبير نحو تطوير المنشقات المعدلة وراثيًا مثل إسكات الجينات عن طريق تدخل الحمض النووي الريبي (RNAi) وتنقل العدوى العابر والمستقر بما في ذلك التوليد بوساطة تكامل الجينوم باستخدام ناقلات مختصة أو الفيروسات القهقرية (بيكمان) and Grevelding، 2012 Mann et al.، 2014). لذلك ، قد يساعد التعبير البروتيني في مضيف غير متجانس في فهم العمليات الفسيولوجية وتحديد الأهداف المحتملة مع التطبيقات الطبية الحيوية والتكنولوجيا الحيوية.

البلهارسيا المنسونية هو أحد العوامل المسببة لداء البلهارسيات المعوية البشرية. سمح توافر تسلسل الجينوم وكمية كبيرة من المعلومات النصية والبروتينية بتطبيق مجموعة متنوعة من المنهجيات لتحديد وتوصيف الجزيئات المشاركة في الآليات الفسيولوجية المختلفة مثل إشارات الخلية الضرورية لل S. mansoniبيولوجيا الطفيليات (Knudsen et al.، 2005 Curwen et al.، 2006 Cass et al.، 2007 Guillou et al.، 2007).

تلعب كينازات البروتين (PK) أدوارًا رئيسية في مسارات الإشارات وقد تم اقتراحها كأهداف محتملة لتطوير أدوية جديدة مضادة للبلهارسيا (Dissous et al. ، 2007). ما يقرب من 1.9٪ (252 بروتين) من المتوقع S. mansoni يتوافق البروتين البروتيني مع PKs. ومع ذلك ، فإن أقل من 15 ٪ من الكينازات لديها دليل وظيفي تجريبي ، بما في ذلك عضو عائلة JNK (Andrade et al. ، 2011). على عكس عدد المتماثلات في الأنواع الأخرى ، حدد أندرادي وزملاؤه (2011) بروتينًا واحدًا فقط ينتمي إلى عائلة JNK الفرعية (Smp_172240) في S. mansoni بروتين. ضربة قاضية لـ SmJNK عن طريق تدخل RNA (RNAi) في البلهارسيا قللت بشكل كبير من العدد الإجمالي للبيض والطفيليات البالغة في الفئران المصابة (Andrade ، 2012). بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الديدان المستعادة من الفئران المصابة تخلفًا في نمو الأعضاء التناسلية والأعضاء التناسلية (Andrade ، 2012). تشير هذه النتائج إلى أن SmJNK قد يلعب دورًا في تحول الطفيلي والبقاء على قيد الحياة في مضيف الثدييات. ومع ذلك ، فإن هذا الخط من النهج له قيود منهجية واحدة. في المنشقات ليس من الممكن بعد إجراء تجارب تكميلية وظيفية. من أجل تعزيز معرفتنا فيما يتعلق بوظيفة الجين SmJNK ، استكشفنا الديدان الخيطية أنواع معينة انيقة كمنصة غير متجانسة للتحقيق في ما إذا كان S. mansoni يمثل JNK بروتينًا وظيفيًا فسيولوجيًا.

C. ايليجانس هي نيماتودا تربة شفافة ، حرة العيش ، بطول 1 مم ظهرت كنموذج حيواني مهم في مختلف المجالات بما في ذلك علم الأحياء العصبية ، وعلم الأحياء التطوري ، وعلم الوراثة. C. ايليجانس كان أول جينوم لكائن متعدد الخلايا يتم تسلسله بالكامل (The C. ايليجانس كونسورتيوم التسلسل ، 1998). يقدم هذا النموذج العديد من المزايا ، بما في ذلك التقنيات الراسخة للمعالجة الوراثية والتجريبية. تحول C. ايليجانس للتحقيق في وظيفة الجينات من مجموعة من أنواع النيماتودا الطفيلية ، بما في ذلك الحوض 1 و cpl-1 من عند كونتورتوس Haemonchus ، gst-3 من عند كلابية الذنب الانفتالية و fktf-1b من عند ستركلويدس ستركوراليس (Grant، 1992 Kwa et al.، 1995 Britton et al.، 1999 Redmond et al.، 2001 Britton and Murray، 2002 Kampk & # x000f6tter et al.، 2003 Massey et al.، 2006).

ال C. ايليجانس يشفر الجينوم خمسة بروتينات مصنفة على أنها تنتمي إلى الفصيلة الفرعية JNK (jnk-1و ZC416.4 و T07A9.3 و Y51B9A.9 و C49C3.10). بناءً على العلاقات التطورية لبروتين JNK ، ايليجانس جنك -1 تم العثور عليه ليكون تقويم العظام لـ SmJNK (البيانات غير ظاهرة). في ايليجانس ، جنك -1 يشارك في تعديل الحركة المنسقة (فيلانويفا وآخرون ، 2001). ايليجانس جنك -1 طفرات الحذف قصيرة العمر ، وأكثر عرضة للمعادن الثقيلة والإجهاد الحراري (Villanueva et al. ، 2001 Wolf et al. ، 2008). الإفراط في التعبير عن jnk-1 يزيد من مقاومة الإجهاد التأكسدي ويطيل عمر الدودة (Villanueva et al. ، 2001 Oh et al. ، 2005). بناءً على هذه المعلومات ، اختبرنا ما إذا كان الإفراط في التعبير عن SmJNK في C. ايليجانس سيؤدي أيضًا إلى ظهور أنماط ظاهرية مماثلة ، مما يتيح إثبات أن إنزيم المنشقات نشط وقادر على استكمال وظيفة الجين الأصلي.


نتائج ومناقشة

بناء نظام التعبير عن الحيوانات الأليفة وإدخالها في S. elongatus PCC 7942

طور ستودييه وموفات نظامًا للتعبير الجيني قائمًا على استخدام بوليميريز RNA الحصري للتعبير عن الجينات غير المتجانسة [19]. تم تطوير منصة تعبير البروتين هذه المعروفة باسم نظام تعبير pET ، عن طريق إدخال جين بوليميريز RNA لعاثية البكتيريا T7 في الإشريكية القولونية الجينوم. يتميز T7 RNA polymerase بوجود نسخ انتقائي وفعال للغاية بسبب الارتباط النوعي العالي لمحفز T7 ، والذي لا يحدث بشكل طبيعي في جينوم الخلية المضيفة. وبالتالي ، يتم استخدام هذه المنصة على نطاق واسع للتعبير عن البروتين غير المتجانسة في بكتريا قولونية. في العمل الحالي ، استخدمنا نظام pET للتعبير عن إنزيم الخلوي في S. elongatus PCC 7942.

بيرجمان وآخرون. [22] أنشأ مكتبة ميتاجينومية لعزل β-glucosidases الجديد من المجتمع الميكروبي في تربة الأمازون. تم عزل اثنين من الجينات بدائية النواة تنتمي إلى عائلات GH3 و GH1 (AMBGL17 و AMBGL18 ، على التوالي). على الرغم من عدم وجود دليل على أن AMBGL17 أكواد جينية لخلية خلية حقيقية ، فقد تم اعتباره وظيفيًا كواحد لأن رموز منطقة ORF الخاصة به β-glucosidase ينتمي إلى عائلة GH3. نظرًا لأن النشاط الأنزيمي لـ AMBGL17 قد تم تمييزه بالفعل كيميائيًا وكشف أن هذا الإنزيم لا يمتلك فقط نشاطًا إنزيميًا عاليًا وتقاربًا مع الركيزة (الخامسالأعلى: 16 ملم ثانية −1 ، كم: 0.30 ± 0.017 ملم ، كقط: 38.57 ثانية -1) ولكن أيضًا كفاءة تحفيزية أعلى (كقط/كم) من العديد من-glucosidases الموصوفة في الأدبيات (128.56 ثانية -1 ملي مولار -1) ، تم اختيارها للعمل الحالي [22].

لبناء نظام تعبير pET ، تم استخدام موقعين محايدين (NSI و NSIII) لإدخال الجينات في جينوم البكتيريا الزرقاء من خلال إعادة التركيب المتماثل [23]. تم إدخال ترميز الجين T7 RNA polymerase (T7RNAP) في موقع محايد 1 (NSI) تحت سيطرة Ni 2+-inducible PnrsB مروج (الشكل 1 أ). تم تأكيد إدخال كاسيت التعبير T7RNAP في جينوم البكتيريا الزرقاء بواسطة PCR مع تضخيم جزء 1.4 كيلو بايت ، والذي يتوافق مع المسافة بين موضع الجينوم Synpcc7942_2499 (بروتين غشاء flotillin الذي يحيط بموقع NSI) وجين مقاومة سبيكتينوميسين (aadA) الجين: بروتين مقاومة أمينوغليكوزيد AadA) الموجود في التركيب الجيني (الشكل 1 أ ، ج). بعد تأكيد إدخال الجين T7RNAP في جينوم البكتيريا الزرقاء ، تم إجراء تحول ثان باستخدام بلازميد pHN1_AMBGL17 (الشكل 1 ب) لدمج جين β-glucosidase (AMBGL17) في موقع محايد 3 (NSIII). تم تأكيد التكامل من خلال تضخيم جزء بحجم 1.8 كيلو بايت يتوافق مع المسافة بين الموضع الجيني Synpcc7942_0741 (جين بروتين ذيل Phage I) وجين مقاومة الكلورامفينيكول (جين cmlR: بروتين مقاومة الكلورامفينيكول) الموجود في التركيب الجيني الثاني (الشكل. 1 ب ، ج).

خصائص أشرطة التعبير وتأكيد تكامل نواقل pSyn_T7RNAP و pHN1_AMBGL17 في جينوم Synechococcus elongatus PCC 7942. أ pSyn_T7RNAP: موقع إعادة التركيب المتماثل (NSI a و NSI b) ، جين مقاومة سبيكتينوميسين (aadA) ، منطقة المروج (PnrsB) ، T7 RNA polymerase ، منطقة إنهاء النسخ (rrnB). ب pHN1_AMBGL17: موقع إعادة التركيب المتماثل (NSIII a و NSIII b) ، جين مقاومة الكلورامفينيكول (cmlR) ، منطقة المروج (PT7) ، β-glucosidase (AMBGL17) ، منطقة إنهاء النسخ (rrnB). تشير الأسهم المتقطعة إلى موضع التلدين للبادئات ذات الأحجام الخاصة. ج تأكيد التكامل الجينومي بواسطة PCR. وزن: S. elongatus النوع البري ، NC: تفاعل تحكم سلبي (بدون قالب DNA) ، 1 كيلو بايت زائد: 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم DNA

تسمى المستعمرات ذات التحول المزدوج S. elongatus صT7تم تأكيد AMBGL17 عن طريق تضخيم جزء من الحمض النووي بحجم 1.8 كيلو بايت يتكون من جزء من الموضع الجيني Synpcc7942_0741 (بروتين ذيل Phage I) وجزء من جين مقاومة الكلورامفينيكول الموجود في التركيب الجيني (الشكل 1 ج). يعد اختيار المتجه (التكاملي أو التكراري) للمعالجة الجينية أمرًا ضروريًا لضمان التحول الناجح. في هذا العمل ، اخترنا استخدام النواقل التكاملية لضمان استقرار الجينات من خلال إعادة التركيب ، مع الحفاظ على المدى الطويل للسلالة المعدلة وراثيًا ، على النحو الذي اقترحه Heidorn et al. [24].

آثار التحوير الجيني وإضافة النيكل على معدلات نمو الخلايا

كما Synechococcus elongatus قد يحتوي PCC 7942 من 1 إلى 10 نسخ جينوم ، ولا يمكننا ضمان دمج الجينات غير المتجانسة (T7RNAP و AMBGL17) في جميع نسخ الجينوم ، مما يجعل من المستحيل تقريبًا الحصول على تعبير متجانس بين السلالات المختلفة. إلى جانب ذلك ، يمكن أن تُفقد هذه الجينات أثناء انقسام الخلية ، حتى في وجود عامل انتقائي. نتيجة لهذه الحقيقة ، أجرينا فحص qPCR لـ 10 سلالات من البكتيريا الزرقاء المعدلة وراثيًا (PT7AMBGL17) لتقييم اختلاف التعبير الجيني بينهم واختيار السلالة التي قدمت أفضل مستوى من التعبير لاستخدامها في التجارب الإضافية (البيانات غير معروضة). لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية في النمو عند النوع البري والمزدوج المعدل وراثيا (P.T7تمت مقارنة سلالات AMBGL17) ، مما يشير إلى أن تكامل الحمض النووي الأجنبي لم يؤثر على نمو البكتيريا الزرقاء (الشكل 2 أ). ومع ذلك ، فإن إضافة 5 ميكرومتر Ni 2+ في مرحلة الكمون (Lag) كان لها تأثير سام على كل من الخلايا المحولة والبرية ، مما أدى إلى موت كلا السلالتين (الشكل 2 أ). مرحلة التأخر هي فترة تتكيف فيها البكتيريا الزرقاء مع الظروف البيئية وتتميز بقلة انقسام الخلايا أو عدم انقسامها ، ولكن نشاط التمثيل الغذائي مكثف [25]. تشير التأثيرات السامة المرئية التي نتجت عن إضافة النيكل في هذه المرحلة من الزراعة إلى أن مضخات تدفق النيكل لم يتم تنشيطها ، مما قد يتسبب في تراكم النيكل داخل الخلية ، مما يؤدي إلى التأثير السام الملحوظ. في المرحلة الثابتة ، عندما ينخفض ​​النشاط الأيضي ويزداد انقسام الخلايا ، لم يؤثر النيكل على حيوية الخلية ، مما يدل على أن تنشيط نظام PET ليس سامًا للنوع البري أو السلالات المعدلة وراثيًا المزدوجة (الشكل 2 ج). بناءً على هذه النتائج ، تم استخدام الحث في المرحلة الثابتة في جميع التجارب اللاحقة.

Synechococcus elongatus منحنيات النمو PCC 7942. أ آثار تكامل الجينوم لأشرطة التعبير اثنين على المعدلة وراثيا S. elongatusT7AMBGL17) مقارنة بمعدل النمو من النوع البري. ب آثار 5 ميكرومتر نيكل (ني 2+) بالإضافة إلى S. elongatus الثقافات البرية والمتحولة خلال مرحلة التأخر. ج آثار 5 ميكرومتر نيكل (ني 2+) بالإضافة إلى S. elongatus الثقافات البرية والمتحولة خلال المرحلة الثابتة

تحديد مستويات التعبير من نظام T7

يعتمد تحريض التعبير عن الجين المستهدف في نظام pET على استخدام P.nrsB المروج ، وهو جزء من مشغل nrsBACD المسؤول عن مقاومة البكتيريا الزرقاء للتعرض للنيكل [26]. عند وجود النيكل في الخلية ، فإن البروتين التنظيمي الذي يمنع التفاعل بين بوليميراز الحمض النووي الريبي الداخلي و PnrsB من خلال تعديل شكله ، ومنع نشاط الحجب ، وبالتالي تحرير منطقة المروج ، بحيث يمكن بدء نسخ جين بوليميريز T7 RNA (الشكل 3 أ ، ب). يرتبط بوليميراز T7 RNA المركب بمحفزه المحدد (PT7) بدء النسخ الحصري لـ β-glucosidase المؤتلف (AMBGL17) (الشكل 3 ب). على الرغم من أن P.nrsB يعتبر معززًا ذا نشاط منخفض غير محدد ، تظهر بيانات التعبير الجيني لدينا ذلك في S. elongatus تم تنشيط نظام pET في القاعدية ، حتى بدون إضافة محفز إلى الثقافة (0 ساعة) (الشكل 3 ج). ربما كان هذا بسبب وجود أيونات معدنية ثنائية التكافؤ مثل Co 2+ و Zn 2+ و Cu 2+ في وسط BG-11 ، والتي تكون قادرة على إحداث تعبير عن بعض المروجين ، كما ورد سابقًا متزامن ص. PCC 6803 ، نوع آخر من البكتيريا الزرقاء [27]. بعد 24 ساعة من الحث ، زاد تعبير T7RNAP حوالي 5.5 ضعفًا على النقطة الزمنية غير المستحثة (0 ساعة) ، والتي كانت كافية لرفع التعبير الجيني AMBGL17 بمقدار 22 ضعفًا (الشكل 3 ج).

التعبير عن نظام T7 بتنسيق Synechococcus elongatus PCC 7942. أ مزدوج المعدل وراثيا Synechococcus elongatusT7AMBGL17) قبل إضافة Ni 2+. يرتبط البروتين القمعي بالحمض النووي ويمنع تفاعل بوليميريز الحمض النووي الريبي الداخلي مع P.nrsB ينتج عنه تعبير بوليميريز T7 RNA. ب آلية تفعيل نظام T7 في S. elongatus صT7AMBGL17. بعد إضافة Ni 2+ ، يرتبط هذا الكاتيون بالبروتين القمعي ، مما يؤدي إلى تغيير التشكل الذي يمنع تفاعله مع الحمض النووي في PnrsB المنطقة والنتائج في نسخ بوليميراز T7RNA بواسطة بوليميريز الحمض النووي الريبي الداخلي. مستويات عالية من التعبير عن بوليميراز T7 RNA ، والذي يعمل P.T7 محفز وينتج مستويات عالية من التعبير عن جين AMBGL. يشير سمك الأسهم إلى شدة النسخ. ج التعبير النسبي عن جينات T7 RNA polymerase (T7RNAP) و β-glucosidase (AMBGL17) في S. elongatus صT7AMBGL17. تم تحديد مستوى التعبير الجيني بواسطة qPCR ، وتم تطبيع النتائج باستخدام الجينات التأسيسية rnpB (R-subunit of ribonuclease P) و rpoD (Delta subunit of RNA polymerase). تظهر الأحرف المختلفة (الأحرف الكبيرة: T7RNAP الصغيرة: AMBGL17) فروقًا ذات دلالة إحصائية (ص & lt 0.05)

يُعرف T7 RNA polymerase بمستواه العالي من النسخ ومعدل الخطأ المنخفض ، وبالتالي فإن كميات صغيرة نسبيًا من هذا الإنزيم تنشط النظام [19]. سمح استخدام نظام pET بالتعبير الجيني القوي لـ AMBGL17 في S. elongatus PCC 7942 ، مما يدل على أن النظام نشط وفعال. لذلك ، في عملنا ، مستويات عالية من تعبير T7RNAP ليست مطلوبة للتعبير العالي عن الجين محل الاهتمام ، كما لوحظ سابقًا [18].

من خلال تحليل البيانات على مدار أيام ، لاحظنا انخفاضًا في التعبير الجيني T7RNAP ، ونتيجة لذلك ، وصل AMBGL17 إلى الصفر تقريبًا في اليوم الثامن من الاستقراء (الشكل 3 ج). على الأرجح ، حدث هذا لأنه عند إضافة النيكل لتنشيط نظام pET ، تم أيضًا تنشيط مشغل nrsBACD. يحتوي هذا الأوبون على جينات ترميز البروتينات التي تشكل معقدًا وظيفته ضخ النيكل خارج الخلية. لذلك ، بمرور الوقت ، تم تعطيل النظام وتوقف الحث AMBGL17.

اقترح إنجلوند وليندبرج أن إحدى الطرق لمنع ضخ النيكل خارج الخلية هي استخدام الجينات التي تشكل عامل nrsBACD كمواقع لإعادة التركيب المتماثل للجين المحور [27]. في هذه الحالة ، يمكن أن يؤدي خروج نظام تدفق النيكل إلى إطالة فترة التعبير عن النظام عن طريق زيادة إنتاج البروتين باستخدام تركيز أقل للمحفِّز. ومع ذلك ، تظل وظيفة مشغل nrsBACD قيد التقييم.

إنتاج β-Glucosidase

على الرغم من أن معظم فحوصات الإنزيم تنطوي على تحلل الخلايا ، فإن الاختبارات التي أجريت سابقًا في مختبرنا (البيانات غير معروضة) أظهرت أن وجود كميات كبيرة من صبغة الفيكوسيانين الموجودة في محلول البكتيريا الزرقاء يتداخل مع قراءة المركب اللوني (الفقرة-نيتروفينول- pNP). نظرًا لأن الركيزة (pNPβG) ومنتج الإنزيم (pNP) قابلة للاختراق ، فهي قادرة على عبور غشاء الخلية ، فقد تم اختيارها للقيام بالنشاط الأنزيمي في وسط المزرعة ، دون تحلل الخلايا.

من خلال قياس نشاط β-glucosidase على مدار 24 ساعة ، لاحظنا فرقًا كبيرًا بين S. elongatus صT7AMBGL17 وسلالات من النوع البري (الشكل 4). تم تحديد ثلاثة جينات ترميز ل β-glucosidases الداخلية المحتملة في جينوم S. elongatus توجد هذه الجينات PCC 7942 في مواقع Synpcc7942_0354 و Synpcc7942_0854 و Synpcc7942_1574. من المحتمل أن يكون واحد على الأقل من هذه-glucosidases المحتملة وظيفية ، مما يفسر النشاط الذي لوحظ في سلالة من النوع البري.

نشاط β-glucosidase في الخطوط البرية والمزدوجة المعدلة وراثيًا (PT7AMBGL17) عند 6 و 8 و 24 ساعة باستخدام 4-nitrophenyl-β- d -glucopyranoside (pNPβG) كركيزة. تظهر الحروف المختلفة فروق ذات دلالة إحصائية (ص & lt 0.05)

في أول 6 ساعات من الحضانة ، كان نشاط β-glucosidase أعلى بمقدار 1.70 ضعفًا في السلالة المعدلة وراثيًا مقارنة بالنوع البري ، مع زيادة هذا الاختلاف إلى 7.4 مرات بعد 18 ساعة من الحضانة ، مما يشير إلى أن نشاط β-glucosidase في السلالة المعدلة وراثيًا سيكون في الغالب يتم إجراؤها بواسطة AMBGL17 غير المتجانسة. ومع ذلك ، انخفض هذا الاختلاف في غضون 24 ساعة إلى 3.5 ضعفًا ، ربما لأن معظم الركائز (pNPβG) المضافة إلى الثقافة تم استهلاكها بسرعة من خلال كمية أكبر من β-glucosidases التي تنتجها السلالة المعدلة وراثيًا. لم يحدث هذا مع السلالة البرية ، التي تحتوي على كمية أقل من الإنزيمات ، وبالتالي تستغرق وقتًا أطول لاستهلاك الركيزة. إذا تمت إضافة المزيد من pNPβG إلى وسط الثقافة ، فمن المحتمل أن يتم ملاحظة زيادة في النشاط. تم التعبير عن العديد من-glucosidases المأشوبة في البكتيريا والخمائر ، ولكن لا توجد حتى الآن تقارير عن استخدام البكتيريا الزرقاء كمنصة إنتاج لهذا الإنزيم. أظهر العمل الحالي ، لأول مرة ، أنه من الممكن استخدام البكتيريا الزرقاء كمصانع حيوية لإنتاج-glucosidases المؤتلف.


الخميرة كنظام نموذج غير متغاير للكشف عن وظيفة المستجيب من النوع الثالث

المستجيبات من النوع الثالث (T3E) هي بروتينات فوعة رئيسية يتم حقنها بواسطة مسببات الأمراض البكتيرية داخل خلايا مضيفها لتخريب العمليات الخلوية والمساهمة في المرض. تمثل الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae نظامًا غير متجانس مهمًا للتوصيف الوظيفي لبروتينات T3E في بيئة حقيقية النواة. الأهم من ذلك ، أن الخميرة تحتوي على عمليات حقيقية النواة مع التكرار المنخفض وخالية من آليات المناعة التي تتصدى لـ T3Es وتخفي وظيفتها. غالبًا ما أدى التعبير في خميرة المؤثرات من مسببات الأمراض النباتية والحيوانية التي تزعج العمليات الخلوية المحفوظة إلى أنماط ظاهرية قوية تم استغلالها لتوضيح وظائف المستجيب والخصائص الكيميائية الحيوية وأهداف المضيف. ساهمت قابلية التتبع الجيني للخميرة وقابليتها للدراسات الوظيفية عالية الإنتاجية في نجاح هذا النظام الذي تم استخدامه في السنوات الأخيرة لدراسة أكثر من 100 مؤثر. هنا ، نقدم نظرة نقدية على هذا العمل ووصف المزايا والقيود الملازمة لاستخدام الخميرة في أبحاث T3E. الأهداف "المفضلة" لـ T3Es في الخميرة هي مكونات الهيكل الخلوي و GTPases الصغيرة لعائلة Rho. نحن نصف كيف يتم أيضًا تغيير إشارات بروتين كيناز (MAPK) الذي يتم تنشيطه بواسطة الميتوجين ، وتهريب الحويصلات ، وهياكل الأغشية ، وموت الخلايا المبرمج بواسطة T3Es في الخميرة وكيف يعكس ذلك وظيفتها في المضيف الطبيعي. نحن نصف كيف يمكن إجراء دراسات بنية-وظيفة المستجيب وتحليل العمليات أو المسارات المستهدفة المرشحة في الخميرة. نحن نحلل بشكل نقدي التقنيات التي تم استخدامها في الخميرة لتعيين وظائف كيميائية حيوية لـ T3E ، بما في ذلك النسخ النصية والبروتيوميات ، بالإضافة إلى شاشات القاتلة أو اكتساب الوظيفة أو شاشات القتل الاصطناعية. وصفنا أيضًا كيف يمكن استخدام الخميرة لاختيار الجزيئات التي تمنع وظيفة T3E في البحث عن عقاقير جديدة مضادة للبكتيريا ذات تطبيقات طبية. أخيرًا ، نقدم رأينا حول قيود S. cerevisiae كنظام نموذجي وتطبيقاته المستقبلية الواعدة.

بيان تضارب المصالح

وقد أعلن الباحثون إلى أن لا المصالح المتنافسة موجودة.

الأرقام

الشكل 1. أكثر الأنماط الظاهرية شيوعًا التي لوحظت في ...

الشكل 1. أكثر الأنماط الظاهرية شيوعًا التي لوحظت في س . الخباز بناءً على تعبير T3E.


عناصر

يتم توفير مكونات أنظمة التعبير في أدلة المستخدم الخاصة بها.

ملحوظة: يتطلب هذا المنتج استكمال اتفاقية الترخيص قبل الشراء.

أمثلة على البروتينات المعبر عنها باستخدام Brevibacillus نظام التعبير الثاني

أمثلة على البروتينات المعبر عنها باستخدام Brevibacillus يتم عرض Expression System II في الجدول أدناه. تم تحقيق مستويات عالية من التعبير لمجموعة متنوعة من البروتينات (الإنزيمات ، والمستضدات ، والسيتوكينات) بغض النظر عن أصلها الجيني (جرثومي ، أو بدائي ، أو حقيقيات النوى). نظرًا لأن بروتينات حقيقيات النوى المفرزة غالبًا ما تعتمد على روابط ثاني كبريتيد سليمة للنشاط ، فمن الصعب عمومًا إنتاج بروتينات نشطة باستخدام أنظمة تعبير نموذجية تعتمد على بدائيات النوى. ومع ذلك ، نظرًا للمزايا الإفرازية لـ Brevibacillus نظام التعبير الثاني, مستويات التعبير العالية للبروتين المؤتلف النشط ممكنة حتى بالنسبة للبروتينات ذات روابط ثاني كبريتيد واسعة النطاق.

البروتينات أصول الإنتاج (جم / لتر) اقتباسات المنتج
الانزيمات
وألفا أميليز B. licheniformis 3.7
سفينغوميليناز B. cereus 3.0
زيلانيز ب. هالودوران 0.2
CGTase B. macerans 1.5 Yamamoto et al. 2011
شيتوزاناز ب. الجسور 1.4
البروتياز المستقر حرارياً أ. بيرنيكس 0.1
نوكلياز مستقر حراريًا هوريكوشي بي 0.7
PDI بشر 1.0 سوجيموتو وآخرون. 2011
المستضدات
مستضد السطح E. rhusiopathiae 0.9
مستضد السطح T. الشاحبة 0.8
السيتوكينات
EGF بشر 1.5 ميزوكامي وآخرون 2010
NGF الفأر 0.2
IFN- وجاما فرخة 0.5 Yamamoto et al. 2009
TNF- وألفا بقري 0.4
GM-CSF بقري 0.2
GH تخبط 0.2

مراجع

Takagi، H.، Kadowaki، K. & amp Udaka، S. فحص وتوصيف البكتيريا المفرطة إنتاج البروتين دون نشاط exoprotease يمكن اكتشافه. الزراعية. بيول. تشيم. 53, 691 و ndash699 (1989).

اقتباسات المنتج

Mizukami ، M. ، Hanagata ، H. & amp Miyauchi ، A. Brevibacillus نظام التعبير: نظام ناقل المضيف للإنتاج الفعال للبروتينات الإفرازية. بالعملة. فارم. التكنولوجيا الحيوية. 11, 251 و ndash258 (2010).

سوجيموتو ، س. وآخرون. استنساخ وتعبير وتنقية سيرين بروتياز إسب خارج الخلية ، وهو إنزيم مهين للأغشية الحيوية ، من المكورات العنقودية البشروية. J. أبل. ميكروبيول. 111, 1،406 و ndash1،415 (2011).

تاكانو ، ت. وآخرون. التعبير عن جين Cycledextrin Glucanotransferase Bacillus macerans في Bacillus brevis. بيوسكي. التكنولوجيا الحيوية. بيوتشيم. 56, 808 و ndash809 (1992).

تيرامورا ، ن. وآخرون. استنساخ جين كولاجيناز المستحدث من البكتيريا سالبة الجرام Grimontia (Vibrio) hollisae 1706B وفعالية تعبيره بتنسيق Brevibacillus choshinensis. J. باكتيريول. 193, 3،049 و ndash3،056 (2011).

توجو ، هـ. وآخرون. إنتاج إيزوميراز ثاني كبريتيد البروتين البشري بواسطة Bacillus brevis. J. Biotechnol. 33, 55-62 (1994).

Yamagata، H.، Nakahama، N.، Suzuki، Y.، Tsukagoshi، N. & amp Udaka، S. Bacillus brevis من أجل التوليف الفعال وإفراز عامل نمو البشرة البشرية. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية. 86, 3589 و ndash3.593 (1989).

Yamamoto، A.، Fujino، M.، Tsuchiya، T. & amp Iwata، A. يسرع عامل تحفيز مستعمرة الكلاب المحببة المؤتلف من التعافي من قلة العدلات التي يسببها السيكلوفوسفاميد في الكلاب. دكتور بيطري. إمونول. مناعي. 142, (2011).

Yamamoto، A.، Iwata، A.، Saito، T.، Watanabe، F. & amp Ueda، S. التعبير وتنقية عامل تحفيز مستعمرة الكلاب المحببة (cG-CSF). دكتور بيطري. إمونول. إمونوباثول. 130, 221 و ndash225 (2009).

ياشيرو ، ك. وآخرون. إنتاج عالي المستوى من الدجاج المؤتلف Interferon- & gamma بواسطة Brevibacillus choshinensis. البروتين Expr. بوريف. 23, 113 و ndash120 (2001).

معلومات المنتج الإضافية

يرجى الاطلاع على شهادة تحليل المنتج للحصول على معلومات حول ظروف التخزين ومكونات المنتج والمواصفات الفنية. يرجى الاطلاع على قائمة مكونات المجموعة لتحديد مكونات المجموعة. توجد شهادات التحليل وقوائم مكونات الأدوات ضمن علامة التبويب "المستندات".


الملخص

المضادات الحيوية التي تتداخل مع الغشاء السيتوبلازمي البكتيري لها إمكانات طويلة المدى لعلاج الأمراض المعدية حيث من المتوقع أن يؤدي هذا النمط من العمل إلى تردد مقاومة منخفض. الفانكورسميسين هو مضاد حيوي منتج طبيعي غير مدروس يتكون من جزء طرفي من حامض رباعي النواة مدمج في سلسلة بولي كيتيد خطية عالية الأوكسجين ومعقدة كيميائيًا تجسيميًا. يُظهر فانكورسميسين تركيزات مثبطة دنيا (MICs) من 0.125 إلى 2 ميكروغرام / مل مقابل مجموعة من البكتيريا إيجابية الجرام ذات الصلة سريريًا والمقاومة للمضادات الحيوية. من خلال دراسة طريقة عمل شاملة ، باستخدام العصوية الرقيقة سلالات المراسل ، DiSC3(5) فحوصات إزالة الاستقطاب ، والفحص المجهري الفلوري ، لقد أظهرنا أن فانكورسميسين يستهدف بشكل انتقائي الغشاء السيتوبلازمي للبكتيريا إيجابية الجرام عبر آلية إزالة الاستقطاب غير المشكِّلة للمسام والمعتمدة على التركيز. يسمح تسلسل الجينوم الكامل للسلالة المنتجة بتحديد تشفير مجموعة الجينات 141 كيلو بايت في التخليق الحيوي لفانكورسميسين ونموذج أولي لتخليقها الحيوي. يمكن أن يؤدي الحجم والبنية المعقدة لفانكورسميسين إلى إرباك محاولات توليد نظائرها الاصطناعية. للتغلب على هذه المشكلة وتسهيل الدراسات المستقبلية ، حددنا ، واستنسخنا ، وعبّرنا عن مجموعة الجينات التخليقية الحيوية 141 كيلو بايت في البوصة في Streptomyces coelicolor M1152. إن توضيح طريقة عمل فانكورسميسين ، جنبًا إلى جنب مع نظام التعبير غير المتجانسة ، سيسهل إلى حد كبير إجراء المزيد من الدراسات حول هذا والجزيئات ذات الصلة.


خلفية

يُظهر عرض سطح الخلية بروتينًا مستهدفًا أو ببتيدًا على سطح الخلية من خلال اندماج البروتين المستهدف لبروتين مرساة. كنموذج كائنات دقيقة حقيقية النواة ، خميرة الخميرة (S. cerevisiae) مثالي لعرض سطح الخلية لأنه: (1) كائن دقيق "يُنظر إليه عمومًا على أنه آمن" (2) مناسب للتعبير عن البروتينات حقيقية النواة لأن التعديلات اللاحقة للترجمة محفوظة في الكائنات حقيقية النواة (3) تسهل خلفيتها الجينية الواضحة الهندسة الوراثية المتنوعة و (4) نموها السريع يوفر الوقت [1]. تم استخدام أنظمة عرض سطح الخميرة على نطاق واسع في تطوير اللقاحات والأجسام المضادة ، وفحص المكتبة ، وأنظمة الكشف عن أجهزة الاستشعار الحيوية ، والتحويل الحيوي [2]. أصبح عرض سطح الخميرة أداة قوية لهندسة البروتين للتطبيقات في التكنولوجيا الحيوية والطب الحيوي [3 ، 4].

بشكل عام ، يتم دمج البروتينات غير المتجانسة مع مجال الربط لبروتينات جدار الخلية لعرض السطح [5،6،7]. في S. cerevisiae، تتكون بروتينات جدار الخلية من فئتين رئيسيتين: (1) بروتينات جليكوزيل فوسفاتيديلينوسيتول (GPI) ، و (2) عائلة البروتينات ذات التكرارات الداخلية (PIR) [8]. ترتبط بروتينات PIR بـ β-1،3-glucan مباشرة في جدار الخلية ، من خلال رابط حساس للقلويات [9]. في S. cerevisiae، تشتمل عائلة PIR على Pir1p و Pir2p و Pir3p و Pir4p و Pir5p. تحتوي بروتينات GPI على مرساة GPI التي يتم تصنيعها في الشبكة الإندوبلازمية ويتم نقلها إلى الطرف الكربوكسيل للبروتين. ثم يتم نقل هذه البروتينات إلى جدار الخلية من خلال جهاز جولجي [10]. تم تحديد ما يقرب من 60 بروتين GPI في S. cerevisiae [8, 11].

نظام عرض الخميرة الأكثر استخدامًا هو نظام بروتين GPI التجاري a-agglutinin. يتكون هذا النظام من وحدتين فرعيتين ، Aga1p و Aga2p. يتم دمج البروتينات غير المتجانسة في الطرف C لـ Aga2p ، وتشكل Aga2p معقدًا مع Aga1p عبر روابط ثاني كبريتيد ، ويتم تثبيت Aga1p على سطح الخميرة من خلال مرساة GPI. تم تطبيق نظام a-agglutinin على نطاق واسع في تطوير اللقاحات والأجسام المضادة ، وفحص المكتبة وأنظمة الكشف عن أجهزة الاستشعار الحيوية. على سبيل المثال ، تم تطوير لقاح حي فموي محتمل ضد كوكسيديا الدجاج من خلال عرض Eimeria tenella بروتين EtMic2 على سطح الخلية عبر a-agglutinin [12]. تم تثبيت مكتبة الأجسام المضادة أحادية السلسلة Fv (scFv) على سطح الخلية عبر a-agglutinin لفحص scFvs التي تتعرف على مستضدات علامات الورم المختلفة [13]. تم عرض مكتبة طفرات مستقبلات حيوية على سطح الخلية لتحسين كل من الاستقرار والألفة تجاه الروابط [14]. على الرغم من أن a-agglutinin هو نظام عرض مستخدم على نطاق واسع ، إلا أن النظام يتطلب مكونين يحتاجان إلى تكوين معقد ، أي Aga1p و Aga2p. In addition, the heterologous proteins anchored on the cell surface via disulfide bonds may not be stable under reducing condition. The two-component a-agglutinin system has been reported to have lower display efficiency than a one-component system, such as the α-agglutinin system [15]. Therefore, construction of new high-efficiency display systems for use in S. cerevisiae should be advantageous over available two-component system.

Several yeast surface display systems have been developed using GPI anchor proteins [16]. For example, the anchor domains of GPI proteins, including Cwp1p, Cwp2p, Aga1p, Tip1p, Flo1p, Sed1p, YCR89w, and Tir1p, were fused with α-galactosidase (α-Gal) and the display efficiency was compared. Cwp2p and Sed1p showed higher surface display levels than the other proteins [7]. When β-glucosidase (BGL1) and endoglucanase II (EGII) were displayed using the Sed1p anchoring region and SED1 promoter, the enzyme activity was significantly higher than when using α-agglutinin (Sag1) system [17]. Although Sed1p-based display is highly efficient, using one anchor protein to display multiple proteins may lead to display saturation and relatively low display efficiency of each protein. Notably, disruption of SED1 improved the display efficiency of BGL1 fused with Sed1p [18]. Therefore, developing new efficient yeast surface display systems remains essential for industrial applications.

In this study, we first reconstructed the a-agglutinin system, using only the GPI-containing domain of Aga1p as the anchor protein, to improve the display efficiency of heterologous proteins. Moreover, several new display systems were also developed, and among them, a Dan4p-based system showed the best display efficiency. Linkers were then added between heterologous proteins and anchor proteins to increase the activity of the heterologous proteins.


معلومات الكاتب

Present address: Biologics Development, Bristol-Myers Squibbs, 35 South Street, Hopkinton, MA, 01748, USA

الانتماءات

Department of Chemical Engineering, The University of Texas at Austin, 200 E Dean Keeton St. Stop C0400, Austin, TX, 78712, USA

Amanda M Lanza, Kathleen A Curran, Lindsey G Rey & Hal S Alper

Institute for Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin, 2500 Speedway Avenue, Austin, TX, 78712, USA

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

المؤلف المراسل


دعم المعلومات

الشكل S1.

The successive cloning steps in the Gateway technology. The Gateway Technology uses the λ recombination system to facilitate transfer of heterologous DNA sequences (flanked by modified Att sites) between vectors. BP Reaction: Facilitates recombination of an AttB-PCR product with an AttP-containing donor vector to create an AttL-containing entry clone. This reaction is catalysed by BP Clonase. LR Reaction: Facilitates recombination of an AttL-containing entry clone with an AttR-containing destination vector to create an AttB-containing expression clone. This reaction is catalysed by LR Clonase.

الشكل S2.

Influence of the number of TMs on the expression in the different systems. The bars represent the percentage of positively expressed proteins in each expression host for a given category. Light blue: بكتريا قولونية أحمر: L. اللاكتيس أصفر: R. Sphaeroides لون أخضر: A. thaliana Dark blue: بنثاميانا, Orange: insect cells. Global expression represents the percentage of positively expressed proteins in all expression hosts for a given category.

Figure S3.

Influence of the protein size on the expression in the different systems. The bars represent the percentage of positively expressed proteins in each expression host for a given category. Light blue: بكتريا قولونية أحمر: L. اللاكتيس أصفر: R. Sphaeroides لون أخضر: A. thaliana Dark blue: بنثاميانا, Orange: insect cells. Global expression represents the percentage of positively expressed proteins in all expression hosts for a given category.


شاهد الفيديو: المركبات الأروماتية الحلقية غير المتجانسة 1. الكيمياء العضوية. المركبات الأروماتية (كانون الثاني 2022).