معلومة

ما الذي يحدد التعبير البروتيني الناجح في الإشريكية القولونية؟


تظهر بعض البروتينات بشكل جيد في مضيف غير متجانس ؛ آخرون- لا تفعل. من المعروف أن بعض المتطلبات تحدد تعبير البروتين ، مثل مُروج قوي (مثل T7) للنسخ وموقع ارتباط قوي بالريبوسوم للترجمة. أنا أعمل مع بروتين يتكون من وحدتين فرعيتين - ألفا وبيتا. كلاهما على بلازميد مع مروج T7 أمام الوحدة الفرعية بيتا (أي أن البناء هو مروج T7 ، CDS للوحدة الفرعية بيتا ، CDS لوحدة ألفا الفرعية). تعبر الوحدة الفرعية بيتا جيدًا ، لكن ألفا لا تعبر عنها. هل تعتقد أن هذا له علاقة بالبيئة المحلية (المروجين ، RBS ، إلخ) وما مدى اعتماده على ذلك؟ كيف يمكنني زيادة تعبير البروتين؟


أحد الجوانب المهمة عند التعبير عن بروتين من كائن حي مختلف في E. coli هو أن استخدام الكودون للكائن الأصلي يختلف على الأرجح عن استخدام الكودون للإشريكية القولونية المستخدمة للتعبير (تحيز استخدام Codon).

على الرغم من أن الشفرة الجينية متدهورة ، إلا أن جميع الكودونات ليست متساوية. قد تشفر لنفس الأحماض الأمينية ، لكن الكائنات الحية تميل إلى تفضيل أكواد معينة على غيرها ، وتميل الحمض النووي الريبي لهذه الكودونات إلى التواجد بتركيزات مختلفة. عندما يكون لديك الآن الكثير من الكودونات في التسلسل الخاص بك والتي تعد نادرة جدًا في الإشريكية القولونية ، فإن التعبير سوف يعاني لأن الحمض النووي الريبي لهذه الكودونات غير موجود بتركيزات عالية بما يكفي للحفاظ على الترجمة.

هناك طريقتان للتعويض عن ذلك ، إما أن تحصل على الإشريكية القولونية لإنتاج المزيد من الحمض النووي الريبوزي النادر ، أو تقوم بتحسين التسلسل الخاص بك لاستخدام أكواد مختلفة. بالنسبة للحل الأول ، يمكنك شراء سلالات معينة من الإشريكية القولونية التي تحتوي على البلازميدات التي تشفر الحمض النووي الريبي (tRNAs) النادرة في الإشريكية القولونية ، وإحدى تلك السلالات هي على سبيل المثال. سلالة Rosetta BL21.

لتحسين استخدام الكودون ، هناك العديد من الشركات التي تقدم توليف التسلسلات المحسنة. هناك أيضًا أدوات متاحة عبر الإنترنت ، لكن ليس لدي خبرة مباشرة في ذلك.

كما أن التحسين ليس سهلاً مثل مجرد استخدام الكودون الأكثر انتشارًا في كل مرة ، فقد ثبت أن تحسين الكودونات لمطابقة سرعة الترجمة في الكائن الأصلي يمكن أن يعزز إنتاجية التعبير. بالنسبة لبعض البروتينات ، قد يكون من الضروري إيقاف المواقع أثناء الترجمة لضمان الطي المناسب. إذا لم ينثني البروتين بشكل صحيح ، فسوف يتحلل بسرعة وسيتأثر محصولك. هذا موصوف في مقالة "تم تحسين التعبير غير المتماثل للبروتين من خلال مواءمة ترددات استخدام كودون للجين المستهدف مع تلك الخاصة بمضيف التعبير" من Angov et al.

ستجد نظرة عامة لطيفة حول الموضوع بأكمله في مقالة "أنت واحد في googol: تحسين الجينات للتعبير البروتيني" من Welsh et al.


هل حاولت وضع الجينين الخاصين بك على بلازميدين منفصلين (لهما أصول مختلفة من التكاثر واختيار المضادات الحيوية بالطبع) وشاركت في التعبير بهذه الطريقة؟ إذا كانت الوحدة الأولى من الوحدتين الفرعيتين تعبر بشكل جيد عن الثانية ، فربما يرجع ذلك إلى أن الريبوسومات تتساقط من الرنا المرسال قبل نسخ الجين الثاني بالكامل. هل الجينات حقيقية النواة في الأصل؟ أعتقد أنه من الصعب "خداع" الإشريكية القولونية ريبوسومات لمعالجة المتواليات غير المتجانسة كعامل أوبرا ، ولكن ربما يمكن لشخص لديه معرفة أكبر بالترجمة بدائية النواة أن يساعد.

في الواقع ، من المحتمل أن تساعد إضافة محفز T7 ثانٍ أمام الجين 2 قليلاً:

يتم نسخ الجينات إما من المروجين الفرديين أو من مروج واحد ، مما يؤدي إلى مرنا طويل متعدد الكواكب. تم الإبلاغ عن أن التعبير متعدد الكريات يؤدي إلى تعبير أقل عن البروتين المشفر في اتجاه مجرى النهر ، والذي يمكن استغلاله للتأثير على قياس العناصر الكيميائية لمركب البروتين (9). تم الإبلاغ عن تعبير أعلى بعدة أضعاف مع المروجين الفرديين مقارنة بالنسخ المتعدد الكيسات (10). (مصدر)

أعلم من التجربة الشخصية أن التعبير المشترك باستخدام اثنين من البلازميدات يمكن أن يعمل جيدًا مع الجينات الصحيحة!


غطى عالم مجنون قضايا التحيز المحتمل في الكودون (والتي يمكن تحسينها باستخدام Rosettas) ، ولكن بشكل عام ، رأيت تباينًا هائلاً في معدلات التعبير بين النواقل المختلفة (pET-28 مقابل pET-24) دون أي سبب واضح. حقق مختبرنا نجاحًا هائلاً مع النواقل المحفزة IPTG (الانتقال من pBC-SK إلى pET-24 زيادة التعبير 50 ​​ضعفًا).

بعيدًا عن التعبير ، يمكن أن يُفقد البروتين عند تحضير المستخلص الخالي من الخلايا. قد لا يكون موجودًا في حبيبات الخلية إذا تم تصديره من خلال إشارة الببتيد ، أو قد يتم التخلص منه في حبيبات "الحطام" عند تدوير الخلايا المتحللة إذا كانت ضعيفة الذوبان. لقد سمعت نظرية مفادها أن قضايا القابلية للذوبان قد تكون مبالغًا فيها من قبل النواقل التي تشبع آلات التصدير ، والتي يمكن أن تعيق التوليف و / أو تكون فعالة لدرجة أنها تسبب هطول الأمطار. ال دليل نظام PET يقترح أن أوقات تعبير أطول (بين عشية وضحاها) عند درجة حرارة أقل (15-20 درجة مئوية) يمكن أن تساعد في مشاكل قابلية الذوبان. مهما كان السبب ، فإن هندسة الببتيد الإشارة زاد بشكل كبير من التعبير للعديد من بروتيناتنا.


لقد وجدت ورقة لطيفة للغاية: تصميم جينات للتعبير الناجح للبروتين ، والتي تغطي معظم العوامل التي تحدد تعبير البروتين. أنشر أجزاء منه ، لأنني متأكد من أنه سيكون مفيدًا لبعضكم.

يمكن التحكم في الترجمة على مستوى البدء والاستطالة. بدء الترجمة يعتمد في المقام الأول على تسلسل موقع ربط الريبوسوم (RBS) والهيكل الثانوي للـ mRNA المبكر. المحددات الأخرى لتعبير البروتين غير مفهومة جيدًا ولكنها فعالة بنفس القدر.

1. الشروع في الترجمة

العنصر الرئيسي الذي يؤثر على بدء الترجمة في بدائيات النوى هو RBS التي تحدث بين 5 و 15 قاعدة قبل الكودون AUG لإطار القراءة المفتوح (ORF). يؤدي ربط الريبوسوم إلى تسلسل Shine-Dalgarno (SD) داخل RBS إلى توطين الريبوسوم في كودون البدء ... تقارب RBS للريبوسوم هو عامل حاسم يتحكم في الكفاءة التي تبدأ بها سلاسل البولي ببتيد الجديدة. هذا التفاعل في منافسة مع تفاعلات اقتران القاعدة المحتملة التي تنطوي على منطقة RBS التي قد تتشكل داخل mRNA نفسه. وبالتالي ، فإن متواليات SD ذات الاقتران الأضعف للقاعدة بالريبوسوم تكون أكثر عرضة للتداخل من بنية الرنا المرسال. ومع ذلك ، تشير بعض التجارب إلى أن متواليات SD ذات التقارب الشديد يمكن أن تكون ضارة ، خاصة في درجات الحرارة المنخفضة ، عن طريق توقف الاستطالة الأولية. ومن الأهمية بمكان أيضًا المسافة بين RBS وكودون البدء مع قواعد 5-7 من توافق SD AGGAGG باعتباره الأمثل.

تشير العديد من الأدلة إلى أن 15-25 كودونات أولية من ORF تستحق عناية خاصة في تحسين الجينات. أظهرت الدراسات أن تأثير الكودونات النادرة على معدل الترجمة قوي بشكل خاص في هذه الكودونات الأولى ، للتعبير في كل من الإشريكية القولونية والسكاروميسيس سيريفيسيا. في E. coli ، يبدو أن انخفاض peptidyl-tRNA أثناء ترجمة الكودونات الأولية قد زاد من خلال وجود أكواد NGG النادرة. يبدو أن هذه التأثيرات مستقلة عن البنية الثانوية للـ mRNA المحلي. من الصحيح أيضًا أنه يمكن استرداد التعبير عن طريق استبدال التسلسل 5 'حتى بالنسبة للتسلسلات التي لا تظهر بنية mRNA قوية بشكل خاص أو تحتوي على أكواد نادرة أو عناصر ضارة أخرى واضحة في هذه المنطقة.

2. تحيز كودون

الطريقة الثانية التي يمكن من خلالها استخدام ترددات كودون المضيف هي مطابقة ترددات كودون المضيف في الجين المصمم. يمكن القيام بذلك ببساطة عن طريق اختيار كل كودون باحتمالية تطابق تردد الكودون المضيف ... باستخدام مجموعات من الجينات المتنوعة على نطاق واسع في ميزات تصميم الجينات ، ويلش وآخرون. وجد أن الاختلاف في ترددات استخدام الكودون المترادف كان له تأثير عميق على كمية البروتين المنتجة في E. coli ، بغض النظر عن تأثيرات التسلسل المحلية 5 '. شوهد تباين لا يقل عن أمرين من حيث الحجم في التعبير بسبب الاستبدال بعد الرموز الـ 15 الأولية لـ ORF. ارتبط هذا الاختلاف ارتباطًا وثيقًا بترددات استخدام الكودون العالمي للجينات ، على الرغم من أن ترددات الكودون الموجودة في أعلى المتغيرات المعبر عنها لا تتوافق مع تلك الموجودة في الجينوم أو في الجينات الذاتية المعبر عنها بشكل كبير للإشريكية القولونية. أظهر التحليل متعدد المتغيرات أن ترددات أكواد معينة لنحو ستة أحماض أمينية يمكن أن تتنبأ بالاختلافات الملحوظة في التعبير. ليس من الواضح ما هو الأساس الكيميائي الحيوي لهذا الارتباط.

3. هيكل مرنا واستطالة متعدية

في حين أن الكثير من الأدلة تشير إلى أن بنية الرنا المرسال يمكن أن تتداخل مع بدء الترجمة في كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى ، فإن تأثيرات البنية على الاستطالة ليست مفهومة جيدًا. قد يكون هذا جزئيًا بسبب نشاط الهليكاز الجوهري للريبوسومات ، والذي يسمح بالترجمة حتى من خلال دبابيس شعر قوية جدًا وقد يمنع العديد من الهياكل من الحد من معدل الترجمة في أي من بدائيات النوى أو حقيقيات النوى. ربما الأهم من ذلك ، أنه من الصعب التنبؤ ببنية الرنا المرسال ، خاصة بالنسبة للرسائل المترجمة بنشاط والتي هي في تدفق مستمر بين مختلف الحالات المطوية وغير المطوية.

4. عوامل خاصة بالبروتين توفر تعقيدًا إضافيًا

قد يكون البروتين غير مستقر بشكل خاص في المضيف ، خاصةً إذا كان مطويًا بشكل ضعيف بسبب عدم الاستقرار المتأصل ، أو عدم وجود عوامل صناعية كافية ، أو تعديل غير لائق بعد الترجمة ... قد يكون التعبير عن البروتينات المفرزة والغشائية مقيدًا بآليات توجيه هذه البروتينات إلى الغشاء. بل من الممكن أن يحد تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين من كفاءة الترجمة. على سبيل المثال ، يُعتقد أن البرولين يُترجم ببطء في الإشريكية القولونية ، بغض النظر عن الكودون المستخدم.

قد يكون التعبير عن البروتين سامة إلى الخلية مما يؤدي إلى عدم استقرار ناقل التعبير أو قمع المضيف لتخليق البروتين ... تتمثل الإستراتيجية الشائعة لتقليل السمية في تقليل التعبير إلى مستويات مقبولة. يمكن أن تكون المحفزات المتنوعة في القوة أدوات قيمة للعثور على معدل التعبير الأمثل لتحقيق أقصى قدر من العائد ... إحدى الطرق المحتملة لتجنب سمية بعض البروتينات هي توجيه التعبير إلى المحيط أو الوسائط. يمكن تحقيق ذلك عن طريق اندماج N- طرفي لتسلسل إشارة إفراز.

لمزيد من المعلومات ، يرجى قراءة الورقة كاملة. أوصي أيضًا بقراءة معلمات التصميم للتحكم في التعبير الجيني التخليقي في الإشريكية القولونية.


البلازميدات 101: سلالات الإشريكية القولونية لتعبير البروتين

في مدونة سابقة لـ Plasmids 101 ، استعرضنا السمات البارزة للعديد من سلالات شائعة من بكتريا قولونية لتكاثر الحمض النووي. بينما كبيرة لأغراض الاستنساخ ، هذه بكتريا قولونية عادة لا تكون السلالات مناسبة بشكل جيد للتعبير عن البروتين المؤتلف. يمكن أن تنشأ العديد من التحديات عند الإفراط في التعبير عن بروتين غريب في بكتريا قولونية. سنراجع المزالق المحتملة لتعبير البروتين المؤتلف وبعض السلالات التجارية الأكثر شيوعًا المصممة لتجنبها.


خطوات مشروع معالجة ميزات Cusabio مهلة
1 البناء البلازميد التوليف الجيني لتحسين كودون متجهات متعددة الأمثل ، المزيد من الخيارات للعملاء
قم بتحسين المتجهات المتعددة في نفس الوقت حدد المتجه الذي يحتوي على أعلى عائد ، والذي يمكن أن يقصر وقت التنفيذ
15-20 يوم عمل
هضم تقييد منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الارتباط بناقل التعبير ، على سبيل المثال Pcold-SUMO ، pGEX-4T-1 ، pET22b-JT ، إلخ.
تحويل الخلايا المختصة TOP10 E. coil
الحصول على البلازميد المؤتلف الصحيح
2 فحص التحول والانفعال تحويل البلازميد المؤتلف إلى الخلايا المضيفة ، على سبيل المثال BL21 (DE3) ، Rosetta-gami B (DE3) pLysS ، خلايا C41 ، ثقافة طوال الليل عند 37 ℃ تحسين متعدد الشروط واختيار مضيفين متعددين
في الاختبار الصغير ، تم تحسين درجة الحرارة و IPTG للحصول على أفضل ظروف الاستزراع. يتم تحويل العديد من العوائل في نفس الوقت لاختيار البكتيريا المضيفة ذات العائد الأعلى.
5 أيام عمل
حدد مستعمرة واحدة للتعبير المستحث على نطاق صغير. اكتشف تعبير البروتين بواسطة SDS-PAGE الحفاظ على أفضل مستعمرة.
تحسين شروط التعبير
3 الهدف من التعبير عن البروتين وتنقيته 1-10 لتر تعبير واسع النطاق طرق تنقية متعددة (اختياري)
استكشف الظروف الكروماتوجرافية المختلفة بما في ذلك التبادل الأيوني ، والطارد للماء وغيرها باستخدام AKTA ، ثم حدد طريقة التنقية المثلى.
12-15 يوم عمل
تنقية البروتين
4 إعادة تشبع الجسم إعادة الطي إذا كان البروتين المستهدف هو جسم التضمين طرق إعادة تشكيل متنوعة
يتم استخدام مجموعة متنوعة من ظروف التخزين المؤقت لفحص أفضل صيغة لمخزن إعادة التشكيل بسرعة. يتم الحصول على البروتين المعاد تشكيله بنقاوة أكبر من 90٪ عن طريق إعادة التشبع بالتخفيف ، تجديد غسيل الكلى ، إعادة التشبع اللوني للعمود وما إلى ذلك. يمكن تحقيق الذوبان وإعادة الطي لأكثر من 95٪ من الهيئات المتضمنة.
5 خدمات إضافية (اختياري) الشحنة إزالة العلامات عن طريق حصر الهضم خدمات إضافية مرنة
يمكن للعملاء الاختيار بمرونة من بين مجموعة متنوعة من الخدمات الإضافية لاحتياجاتهم الخاصة ، على سبيل المثال إزالة السموم الداخلية ، وتعقيم المرشح ، وإزالة العلامات ، والتجميد ، وما إلى ذلك ، بعضها مجاني ، وبعضها يتطلب رسومًا إضافية.
3 أيام عمل
حر إزالة السموم الداخلية بالتجميد بالفلتر يومان عمل
6 مراقبة الجودة اختبار النقاء والتركيز وما إلى ذلك يتم توفير تقرير مراقبة الجودة. تقرير مفصل عن شهادة توثيق البرامج
يتم توفير صحيفة بيانات المنتج التفصيلية و COA لكل مشروع.
3-5 أيام عمل
إجمالي وقت التسليم 35-45 يوم عمل

حالة 1
الخصائص: البروتين هو بروتين اندماجي ، ويتم هضمه بالبروتياز PreScission بين عشية وضحاها من خلال عمود كروماتوغرافيا تقارب GST ، وبعد ذلك بتنقية من خطوة واحدة للحصول على البروتين بدون علامة.

  • لين 1 : خلية محللة (السهم يشير إلى بروتين الاندماج المستهدف
  • المسار 2 : يتدفق من خلاله
  • المسار 3 : البروتين الذي يتم هضمه بواسطة البروتياز PreScission (السهم يشير إلى البروتين المستهدف)
  • المسار 4 ، قم بإزالة الشوائب باستخدام برنامج تلفزيوني
  • شطف الخط 5 : GSH (يشير السهم إلى البروتين الموسوم بعلامة GST
  • لين 6 : بروتين هدف مركز

الحالة 2
الخصائص: بعد التعبير ، تمت تنقية البروتين المستهدف بواسطة كروماتوجرافيا تقارب عمود النيكل. بلغت درجة النقاء 90٪ ، وبلغ المحصول 20 ملجم / لتر

  • لين 1 ، خلية المحللة
  • المسار 2 : يتدفق من خلاله
  • لين 3 - 30 ملي شطف إيميدازول
  • حارة 4:60 مم شطف إيميدازول
  • لين 5 : 200 ملي شطف إيميدازول
  • حارة 6 : 500 ملي شطف إيميدازول

الحالة 3
الخصائص: يمكن توفير خيارات علامات متعددة لبروتين واحد.

  • لين 1:60 ملي شطف وتركيز إيميدازول
  • لين 2 : 200 ملي شطف إيميدازول وتركيزه
  • لين 3 : 500 ملي شطف وتركيز إيميدازول

الحالة 4
الخصائص : البروتين المؤتلف نشط وظيفيًا.

نشاط الربط لـ aqpZ مع ytfE

تقاس من خلال قدرتها على الارتباط في ELISA وظيفية. يمكن لـ aqpZ المجمد عند 5 ميكروغرام / مل أن يربط ytfE البشري ، و EC50 لبروتين ytfE البشري هو 197.90-259.70 ميكروغرام / مل.

أنظمة التعبير المميزة

pET22b-JT بلازميد + بكتيريا مضيفة Rosetta-gami B (DE3) pLysS نظام التعبير عن درجات الحرارة المنخفضة

احمل مروجًا قويًا T7 يحتوي على ببتيد إشارة PelB تعبير إفرازي ناتج عن درجة حرارة منخفضة ، مما يساعد على تصحيح طي البروتين وتعزيز قابلية ذوبان البروتين.

الاستنساخ السلس ، لا حاجة إلى إنزيم تقييد.

بالمقارنة مع علامة 6xHis التقليدية ، تتمتع علامة N-terminal 10xHis بقدرة ربط أقوى في IMAC. وفي الوقت نفسه ، يسهل موقع الثرومبين إزالة العلامة.

يمكن استخدام علامة C-terminal MYC للكشف عن WB ، ولديها حساسية أقوى مقارنة بعلامته.

pCold-SUMO plasmid + Rosetta-gami B (DE3) pLysS نظام التعبير عن درجات الحرارة المنخفضة للبكتيريا المضيفة

حمل معزز قوي cspA يحتوي على بروتين انصهار SUMO يمتلك قدرة قوية على تعزيز التعبير.

الاستنساخ السلس ، لا حاجة إلى إنزيم تقييد.

بالمقارنة مع علامة 6xHis التقليدية ، تتمتع علامة N-terminal 10xHis بقدرة ربط أقوى في IMAC. وفي الوقت نفسه ، يسهل موقع الثرومبين إزالة العلامة.

يمكن استخدام علامة C-terminal MYC للكشف عن WB ، ولديها حساسية أقوى مقارنة بعلامته.


Li، C.، Schwabe، J.W.، Banayo، E. & amp Evans، R.M. يزيد تعايش شركاء المستقبلات النووية من قابليتهم للذوبان وأنشطتهم البيولوجية. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 94, 2278–2283 (1997).

ريفاس ، ف. وآخرون. Argonaute المنقى 2 و siRNA يشكلان RISC بشري مؤتلف. نات. هيكل. مول. بيول. 12, 340–349 (2005).

بروس ، ب. وآخرون. يتغلب الإفراط في التعبير عن مرافقات GroESL البكتيرية جزئيًا على تجميع الطي والرباعي غير المنتج بكتريا قولونية- نازع هيدروجيناز أسيل- CoA البشري ذو السلسلة المتوسطة (MCAD) يحمل الطفرة السائدة المسببة للمرض K304E. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 1182, 264–274 (1993).

Woestenk، E.A.، Hammarstrom، M.، van den Berg، S.، Hard، T. & amp Berglund، H. تأثير علامته على قابلية ذوبان البروتينات البشرية المنتجة في الإشريكية القولونية: مقارنة بين أربعة نواقل التعبير. J. الهيكل. Funct. علم الجينوم 5, 217–229 (2004).

كابوست ، R.B. & amp Waugh ، D. الإشريكية القولونية يعتبر بروتين ربط المالتوز فعالا بشكل غير مألوف في تعزيز قابلية ذوبان البولي ببتيدات التي يندمج فيها. علوم البروتين. 8, 1668–1674 (1999).

Selzer ، G. ، Som ، T. ، Itoh ، T. & amp Tomizawa ، J. أصل تكرار البلازميد p15A والدراسات المقارنة على متواليات النوكليوتيدات حول أصل البلازميدات ذات الصلة. زنزانة 32, 119–129 (1983).

دافيسون ، ج. آلية التحكم في تكرار الحمض النووي وعدم التوافق في البلازميدات من نوع ColE1 - مراجعة. الجين 28, 1–15 (1984).

Ho، T.Q.، Zhong، Z.، Aung، S. & amp Pogliano، J. تستهدف البلازميدات البكتيرية المتوافقة إلى مواقع خلوية مستقلة في الإشريكية القولونية. EMBO J. 21, 1864–1872 (2002).

سونغ ، ج.ج. ، سميث ، س.ك. ، هانون ، ج. & amp Joshua-Tor، L. هيكل بلوري من Argonaute وآثاره على نشاط تقطيع RISC. علم 305, 1434–1437 (2004).

ليو ، ج. وآخرون. Argonaute2 هو المحرك الحفاز للثدييات RNAi. علم 305, 1437–1441 (2004).

مايستر ، ج. وآخرون. يتوسط الإنسان Argonaute2 انقسام الحمض النووي الريبي المستهدف بواسطة miRNAs و siRNAs. مول. زنزانة 15, 185–197 (2004).

عقدت ، D. ، Yaeger ، K. & amp Novy ، R. ناقلات جديدة للتوافق لتوسيع التوافق في بكتريا قولونية. في Novations 18, 4–6 (2003).


إنتاج بروتينات الثدييات القابلة للذوبان في الإشريكية القولونية: تحديد سمات البروتين التي ترتبط بالتعبير الناجح

خلفية: في البحث عن استراتيجيات التعبير العام لعائلات بروتين الثدييات ، تم فحص العديد من نواقل التعبير البكتيري لمعرفة قدرتها على تعزيز إنتاجية عالية من البروتين القابل للذوبان. شملت البروتينات التي تمت دراستها مستقبلات سطح الخلية (مستقبلات إفرين و إف ، CD44) ، كينازات (مجال EGFR-سيتوبلازميك ، CDK2 و 4) ، البروتياز (MMP1 ، CASP2) ، بروتينات تحويل الإشارة (GRB2 ، RAF1 ، HRAS) وعوامل النسخ (GATA2 ، Fli1 ، Trp53 ، Mdm2 ، يونيو ، FOS ، MAD ، MAX). تم إجراء أكثر من 400 تجربة حيث تم تقييم التعبير عن 30 بروتينًا كامل الطول ومجالًا بروتينيًا مع 6 شركاء اندماج N-terminal و 8 شركاء C-terminal مختلفين. تم أيضًا التعبير عن مجموعة إضافية من 95 بروتينًا للثدييات لاختبار استنتاجات هذه الدراسة.

نتائج: ترتبط العديد من سمات البروتين بإنتاجية التعبير عن البروتين القابل للذوبان بما في ذلك الوزن الجزيئي وعدد المخلفات المتجاورة الكارهة للماء والمناطق منخفضة التعقيد. لم تكن هناك علاقة بين التعبير الناجح والبروتين pI ، والمتوسط ​​الكبير للفاعلية المائية (GRAVY) ، أو الموقع الخلوي الفرعي. فقط البروتينات السيتوبلازمية الكروية الصغيرة بمتوسط ​​وزن جزيئي يبلغ 23 كيلو دالتون لم تتطلب علامة تعزيز الذوبان للتعبير القابل للذوبان عالي المستوى. كان Thioredoxin (Trx) وبروتين ربط المالتوز (MBP) أفضل اندماج بروتين طرفي N لتعزيز التعبير القابل للذوبان ، لكن MBP كان أكثر فاعلية باعتباره اندماجًا طرفيًا C. 63 من 95 بروتينًا للثدييات معبرًا عنها بمستويات قابلة للذوبان تزيد عن 1 مجم / لتر على شكل اندماج H10-MBP N-terminal وتلك التي فشلت تمتلك ، في المتوسط ​​، وزنًا جزيئيًا أعلى وعددًا أكبر من الأحماض الأمينية الكارهة للماء ومناطق منخفضة التعقيد.

الاستنتاجات: من خلال تحليل ميزات البروتين المحددة هنا ، ستساعد هذه الدراسة في التنبؤ ببروتينات الثدييات والمجالات التي يمكن التعبير عنها بنجاح في الإشريكية القولونية كمنتج قابل للذوبان وأيضًا أفضل استهداف لنظام التعبير حقيقيات النواة. في بعض الحالات ، قد يتم اقتطاع البروتينات لتقليل الوزن الجزيئي وأعداد الأحماض الأمينية الكارهة للماء والمناطق منخفضة التعقيد للمساعدة في التعبير القابل للذوبان في الإشريكية القولونية.


نتائج

من أجل تمكين فحص IMP المذاب في المنظفات باستخدام لطخة CoFi ، تم تعديله وتحسينه لاستخدام المنظفات (البيانات غير معروضة).

ال بكتريا قولونية تم اختيار البروتينات في هذه الدراسة وتصنيفها وفقًا لمستويات التعبير التي تم الحصول عليها في تجارب المقارنة المعيارية السابقة (انظر المواد والطرق). من هذه المجموعة اخترنا ثمانية بكتريا قولونية أهداف بالإضافة إلى بروتين غشاء بشري واحد مع تعبير فارغ أو منخفض أو متوسط ​​(الجدول 1). تعرضت جميع IMPs لطفرات عشوائية ، وفحص لطخة CoFi ، والتوصيف.

الجدول 1.

البروتينات المستخدمة في هذه الدراسة

إنشاء مكتبات عشوائية للطفرات

تم إنشاء مكتبات الطفرات العشوائية باستخدام بوليميراز متاح تجاريًا بمعدل طفرة يمكن التحكم فيه بسهولة ، والذي اقتصر على طفرات 3 & # x020137 / كيلو بايت. تم استنساخ إطار القراءة المفتوح المتحور (ORF) في تعبير البلازميد الذي يحتوي على علامة N-terminal FLAG وعلامة C-terminal His6 علامة باستخدام نظام البوابة وتحويلها إلى سلالة استنساخ ، مما أدى إلى ما لا يقل عن 15000 مستعمرة. تم بعد ذلك حصاد هذه المكتبة المضخمة وتحويلها إلى سلالة تعبيرية C41 وفحصها باستخدام لطخة CoFi. عادةً ما تم فحص 6000 & # x020138000 مستعمرة لكل مكتبة.

فحص لطخة CoFi والتحقق من صحة ثقافة السائل

في المكتبات المقابلة للبروتينات الأربعة MP01 و 02 و 06 و 08 ، لم نتمكن من اكتشاف الحيوانات المستنسخة التي تعبر عن مستويات أعلى من الخلفية في لطخة CoFi (الشكل 1 أ). تم تصنيف كل هذه البروتينات الأربعة سابقًا على أنها منخفضة أو غير معبرة (Eshaghi et al. 2005) (الجدول 1 الشكل التكميلي 1). أظهرت مكتبات البروتينات الخمسة المصنفة في الأصل كمعبرات منخفضة أو متوسطة (MP03 و 04 و 05 و 07 و 09) اختلافات كبيرة في الكثافة بين المستعمرات (الشكل 1B & # x02013D). من هذه البقع CoFi اخترنا ما بين 20 و 50 مستعمرة بأعلى كثافة. بالنسبة لـ MP07 ، لم يكن هناك سوى عدد قليل من المستعمرات القوية وكانت معظم المستعمرات المختارة ذات كثافة متوسطة. نمت المستعمرات المختارة من البروتينات المختلفة وحفزت في مزارع سائلة مع تراكيب WT مكررة. باستخدام إستراتيجية فصل الترشيح 96-جيدًا (Knaust and Nordlund 2001) متبوعة بصمة نقطية تم فحصها باستخدام كاشف Ni-chelate ، تم تحديد تركيبات بروتين مذابة في المنظفات. بالنسبة للأهداف MP03 و 04 و 05 و 07 و 09 ، تم عرض عدد من الحيوانات المستنسخة المحددة للتعبير بشكل أفضل من WT (الجدول 1).

مثال على لطخات CoFi لمكتبات الطفرات العشوائية لأربعة أهداف مختلفة. (أ) MP01 لا تحتوي على أي مستعمرات تم الحكم عليها على أنها إيجابية. (ب) MP07 يظهر فقط عدد قليل من المستعمرات الإيجابية. (ج) MP05 و (د) MP09 يوضح بقع CoFi مع اختلافات كبيرة في مستويات التعبير.

للحصول على تقدير لأداء لطخة CoFi المتوافقة مع المنظفات ، قمنا بمقارنة 24 مستعمرة تم تصنيفها على أنها منخفضة و 24 مصنفة على أنها عالية من كل مكتبة من مكتبات MP04 و 05. تم الحكم على المستعمرات بالتعبير على مستوى عالٍ. نمت التركيبات في مزارع سائلة وصُنعت بقع نقطية من مادة نقية. بالنسبة إلى MP04 و MP05 ، كان هناك ارتباط جيد بين تصنيف لطخة CoFi والكثافة التي شوهدت في بقع نقطية من المواد المذابة (الشكل 2A ، B ، D ، E) ، وبالنسبة لـ MP07 تمكنا من تحديد عدد قليل من الحيوانات المستنسخة الأقوى بشكل صحيح موجودة في المكتبة جنبًا إلى جنب مع العديد من التركيبات التي تعبر عن المستوى المتوسط ​​(الأشكال 1 ب ، 2 ج ، و).

التحقق من طريقة لطخة CoFi لبروتينات الغشاء. (أ & # x02013C) تم استخدام بقع CoFi للمكتبات لـ MP04 و 05 لتقسيم الحيوانات المستنسخة من كل لطخة إلى فئات ذات مستوى تعبير مرتفع أو منخفض. بالنسبة إلى MP07 ، قمنا أيضًا بتضمين المستعمرات التي تعبر عن فئات ذات مستوى متوسط. من كل لطخة ، تم اختيار 48 مستعمرة تم تصنيفها على أنها عالية ، أو متوسطة ، أو منخفضة التعبير ، وتنميتها ، وتحفيزها للتعبير ، جنبًا إلى جنب مع النوع البري المقابل في المزارع السائلة. تم عمل بقع نقطية من المواد المذابة من هذه. فوق النقاط الرباعية من النوع البري ، توجد أربع عينات من النوع البري غير المستحث. (د & # x02013F) شدة النقطة في أ & # x02013C تم تحديدها كميا. تم استخدام النقاط من النوع البري كمرجع وتم تعيينها على 1. تم تصوير متوسط ​​الشدة على شكل أشرطة وتم تمثيل الكثافة الفردية على شكل نطاقات.

التعبير والتنقية على نطاق متوسط

من أجل تأكيد الاختلافات في مستويات التعبير ، أجرينا تنقية IMAC متوسطة الحجم على عينات ثلاثية على الأقل للحصول على أفضل استنساخ معبر و WT المقابلة للأهداف MP03 و 04 و 05 و 07 و 09. تم تحليل البروتينات المنقاة إما عن طريق البقع الغربية (MP03 و 05 و 09) أو بواسطة البقع النقطية (MP04 و 07).

في جميع الحالات ، كان التحسين في العائد كبيرًا وكانت الاختلافات داخل مجموعات الاختبار صغيرة (الشكل 3 أ & # x02013E). كان أصغر تغيير في المحصول في هذه التجارب متوسطة الحجم زيادة تقريبية بمقدار 1.5 ضعفًا في المتوسط ​​لـ MP03. أكبر تغيير لوحظ كان لـ MP07 ، حيث شهدنا زيادة تقريبية بمقدار 12 ضعفًا في المتوسط.

مقارنة بين أفضل الحيوانات المستنسخة المعبر عنها والنوع البري المقابل. تم إجراء تنقية متعددة متوسطة الحجم لـ (أ) MP03 ن = 3, (ب) MP04 ن = 7, (ج) MP05 ن = 4, (د) MP07 ن = 7، و (ه) MP09 ن = 4. تم تحليل العينات المنقى بواسطة لطخات غربية (أ,ج,ه) أو عن طريق النقاط (ب ، د) وتم تحديد شدة النطاق / النقطة بشكل شبه كمي. تم ضبط شدة النوع البري على 1 ، وتمثل كل قيمة شريطية متوسط ​​& # x000b1 SD لـ ن التجارب. (F) عينات تم تنقيتها بعد عمليات تنقية واسعة النطاق وتحليلها على SDS-PAGE. (ز & # x02013I) كروماتوجرام ترشيح الهلام من عمليات التنقية واسعة النطاق لـ (جي) MP03 ، (ح) MP07 و (أنا) MP09. يشار إلى الفراغ بواسطة سهم. للحصول على أفضل استنساخ معبر من كل هدف ، حصلنا في المتوسط ​​على 1 مجم بروتين نقي (بعد تنقية من خطوتين) لكل لتر من ثقافة LB (عند OD600 من & # x0223c2.0).

التعبير والتنقية على نطاق واسع

تم التعبير عن الأهداف MP03 و 07 و 09 في ثقافة سائلة واسعة النطاق (4 & # x0201312 لترًا) وتعرضت لتنقية التقارب وترشيح الهلام. تم تحليل العينات المنقاة بواسطة SDS-PAGE الملون Coomassie (الشكل 3F). أظهرت المخططات اللونية لترشيح الهلام أنه يمكن تنقية البروتينات على أنها غير مجاميع ، وأن المظهر الكروماتوغرافي لكل استنساخ يشبه ذلك الخاص بـ WT (الشكل 3G & # x02013I).

بالنسبة لهذه البروتينات ، تم إجراء تحديد أكثر دقة لعائد تعبير الاستنساخ المحسن عن طريق حساب المنطقة الواقعة تحت المنحنى الكروماتوغرافي. بالنسبة لـ MP03 ، تم تحسين الزيادة في المحصول بنسبة 25 ٪ ، على غرار الكمية المقدرة من التجارب متوسطة الحجم. أظهرت النسخ الأولى والثانية من MP09 زيادة في التعبير بنسبة 60٪ و 80٪ على التوالي ، وكان لدى MP07 تحسنًا بمقدار 40 ضعفًا (4000٪) في التعبير.

تحليل التسلسل

تم ترتيب الحيوانات المستنسخة الإيجابية المختارة من لطخة CoFi التي أسفرت عن زيادة مستويات التعبير في الثقافات السائلة من أجل تحديد مدى الطفرات وموقعها. في المتوسط ​​، لوحظت 0.60 من بدائل الأحماض الأمينية لكل 100 حمض أميني (الجدول 1). تم أيضًا ترتيب الحيوانات المستنسخة التي تظهر زيادة معتدلة ، أي قريبة من مستويات التعبير من النوع البري ، ولها نفس معدلات الطفرات. نظرًا لعدم وجود بنية محددة تجريبياً متاحة للبروتينات المستهدفة ، فقد توقعنا البنية الثانوية للبروتينات باستخدام TMHMM (Krogh وآخرون 2001). ثم تم استخدام هذه النتائج لإنشاء نموذج هيكل ثانوي تم رسم الطفرات عليه (الشكل 4 أ & # x02013E). بشكل عام ، تم توزيع الطفرات بالتساوي على البروتين بأكمله. تم تلخيص جميع البدائل في النسخ الإيجابية في الجدول التكميلي 1.

تنبؤ البنية الثانوية وتحليل موقع الطفرات. طوبولوجيا الأهداف (أ) MP03 ، (ب) MP04 ، (ج) MP05 ، (د) MP07 و (ه) تم توقع MP09 باستخدام TMHMM (22). يشار إلى عدد النسخ وموقع الطفرات بألوان مختلفة. يتم تصوير النسخ التي يتم التعبير عنها على أعلى المستويات بواسطة دوائر أكبر. تظهر أجزاء الغشاء المتنبأ بها باللون الرمادي الداكن.


I. بروتوكول التعبير في بكتريا قولونية

ويرد أدناه البروتوكول العام لعملية التعبير من الجين إلى البروتين.


المرحلة 1: تخليق الجينات المحسن من كودون وبناء المتجهات

  • تحسين بنية Codon و mRNA
  • صهر الجين في علامة بروتين وأدخلها في ناقل التعبير
  • تحقق من صحة البناء بالتسلسل

المرحلة 2: تحويل متجه التعبير إلى بكتريا قولونية الخلايا المختصة

  • أضف ناقل التعبير إلى الخلايا المختصة إذابة الجليد
  • أضف الخلايا المصابة بالحرارة إلى مرق LB ورجها
  • زرع خلية لوحة على لوحات أجار LB مع المضادات الحيوية المناسبة

المرحلة الثالثة: ثقافة المبتدئين

  • اختر مستعمرة مفردة من سلالة التعبير إلى 5 مل من LB مع المضاد الحيوي المناسب
  • رج العبوة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 إلى 5 ساعات

المرحلة الرابعة: التوسع في ثقافة المبتدئين

  • توسيع الثقافة عن طريق إضافة ثقافة البادئ إلى حجم أكبر LB مع المضاد الحيوي (درجة حرارة الغرفة)
  • احتضان لمدة 1-4 ساعات حتى تصل كثافة الثقافة من OD600 0.5-0.6

ملحوظة: قم بتغطية القارورة بالقطن أو بغطاء قارورة مستنبت للسماح للأكسجين بالزراعة دون أن تلوث البيئة.
المرحلة الخامسة: الحث

  • حث التعبير عن طريق إضافة IPTG إلى تركيز نهائي قدره 0.5 ملي مولار بعد أن وصلت الثقافة إلى OD600 0.5-0.6
  • حمل لمدة 3-4 ساعات عند 37 ℃ مع الرج

ملحوظة: IPTG عبارة عن محلول مجمد في الفريزر -20 درجة مئوية.

الخيار 2: درجة حرارة الغرفة (20 ℃) ​​التعريفي

  • قم بتبريد المزرعة إلى درجة حرارة الغرفة عن طريق وضعها في الثلاجة أو حمام مائي مثلج بعد أن تصل إلى OD600 0.5-0.6
  • حمل التعبير عن طريق إضافة IPTG إلى تركيز نهائي من 0.1 إلى 1.0 ملي مولار
  • حمل بين عشية وضحاها (12-18 ساعة) في درجة حرارة الغرفة (20 ℃) ​​مع الرج

المرحلة 6: جمع الخلايا وتحللها

  • الطرد المركزي الخلايا في 3500 x ز لمدة 20 دقيقة
  • Resuspend الخلايا في الجليد الباردة PBS وإعادة الطرد المركزي في أنبوب بحجم مناسب
  • قم بإزالة الحبيبات الطافية والتجميد للمعالجة اللاحقة
  • خلايا ليس باستخدام البروتوكول المناسب

التعبير عن البروتين المؤتلف بتنسيق بيتشيا باستوريس

مقدمة ل بيتشيا باستوريس

بيتشيا باستوريس هي خميرة methylotrophic ويمكن استخدامها كنظام تعبير غير متجانسة [1]. إنه كائن حي دقيق وحيد الخلية يسهل التلاعب به وثقافته الإشريكية القولونية [2]. في غضون ذلك ، باعتبارها حقيقيات النوى ، تمتلك قدرات التعديلات اللاحقة للترجمة التي تقوم بها الخلايا حقيقية النواة الأعلى. يمكن بالتالي إنتاج البروتينات التي تعبر عن أجسام تضمين غير نشطة في أنظمة التعبير البكتيري كجزيئات نشطة بيولوجيًا في P. باستوريس، مع المعالجة الصحيحة للبروتين ، والطي ، وتشكيل رابطة ثاني كبريتيد والجليكوزيل. إلى جانب ال P. باستوريس يُنظر إلى النظام أيضًا على أنه أسهل وأسرع وأكثر فعالية من حيث التكلفة للاستخدام من أنظمة التعبير المطورة من حقيقيات النوى الأعلى مثل خلايا الحشرات وأنظمة خلايا زراعة أنسجة الثدييات. مستويات التعبير عن البروتين في P. القس بشكل عام أعلى من ذلك بكثير. باعتبارها الخميرة ، فإنها تشترك في مزايا التلاعب الجيني السهل مع السكريات علاوة على ذلك ، فهي تمتلك ميزة مستويات أعلى من التعبير البروتيني غير المتجانسة بمقدار 10-100 ضعف. جعلت جميع الميزات المذكورة أعلاه بيتشيا نظام تعبير بروتين مفيد للغاية. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن أيضًا تطبيق العديد من التقنيات التي تم تطويرها للسكريات في البداية بيتشيا, including transformation by complementation, gene disruption and replacement.

Pichia pastoris is a type of methylotrophic yeast and thus is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source [3] . The first step in the metabolism of methanol is the oxidation of methanol into formaldehyde by molecular oxygen. The reaction also generates hydrogen peroxide except for formaldehyde. To avoid the toxicity of hydrogen peroxide, methanol metabolism normally takes place within the peroxisome, a specialized cellular organelle. Alcohol oxidase, the enzyme that catalyzes the oxidation of methanol has a poor affinity for oxygen, and thus Pichia pastoris has to generate large amounts of the enzyme as compensation. In the meantime, the promoter regulating the production of the enzyme is therefore used to drive heterologous protein expression in Pichia.

There are two genes code for alcohol oxidase in Pichia, AOX1 and AOX2 [4] . Generally, a majority of the activity of the enzymes relies on the AOX1 gene. Its expression is largely controlled by methanol. A plasmid-born version of the AOX1 promoter is applied to induce expression of inserted gene of interest for the desired heterologous protein [3,4] . Although AOX2 is about 97% homologous to AOX1, its growth on methanol is much slower than that of AOX1.

To be more specific, the expression of the AOX1 gene is controlled at the level of transcription. The regulation of AOX1 gene is a two-step process, which includes a repression mechanism and an induction mechanism. Since growth on glucose can repress transcription process even when methanol exists growth on glycerol is recommended for optimal induction with methanol.

As to the expression pattern of heterologous protein in Pichia pastoris, it can be either intracellular or secreted, depending on the chosen expression vector. Secretion requires the presence of a signal peptide on the protein via secretory pathway. A major advantage of secreted expression of heterologous protein is that Pichia pastoris itself secrets very low levels of native proteins. Thus the secreted heterologous comprises the majority of the total protein in Pichia growth medium and therefore simplifies subsequent purification procedure of the protein [1] .

Typically, posttranslational modifications in Pichia include removal of signal sequences, folding, disulfide bridge formation and O-/N-linked glycosylation. In mammals, O-linked oligosaccharides are composed of sugars including N-acetygalactosamine, galactose and sialic acid [2] . While in lower eukaryotes like P.pastoris, the added O-linked oligosaccharide simply refers to mannose residues.

P. pastoris has become a highly successful system for the expression of heterologous genes. Several important factors that contribute to its rapid spread and wide range application are summarized as following points [2] .

a.A promoter derived from the alcohol oxidase I (AOX1) gene of P.pastoris that is appropriate for the precise expression of foreign genes.
ب. Similar techniques of the molecular genetic manipulation in P.pastoris to those from خميرة الخميرة, one of the most well-characterized experimental systems in modern biology.
ج. P.pastoris prefers respiratory growth, which is a key physiological trait which allows its culturing at high cell densities relative to fermentative yeasts.

Our trained custom service group will perform all the steps for the fastest expression of your target protein using the P.pastoris Expression System, which will definitely save your resources and time.

Experimental Outline

The flow chart below illustrates the overall experimental process required for recombinant protein production using the Pichia Expression System.

Protocol for Recombinant protein expression using the Pichia Expression System

The following protocol can be a reference for you to understand more details of the techniques utilized in our lab and workflow involved in producing the protein of interest using P.pastoris.

1. Select the appropriate Expression Vector for your target gene.

You may choose to express your protein intracellularly if your protein is cytosolic and non-glycosylated. You can also have your target protein secreted into the culture media if your protein is generally secreted, glycosylated or directed to an intracellular organelle.

2. Transformation into E.coli.

أنا. Insert the target gene in frame with the expression vector.
ii. Transform the E.coli with the ligation mixture by electroporation or chemical methods.
ثالثا. Add LB medium to the cells for recovery after heat shock or electroporation.
رابعا. Plate on LB medium with Zeocin.
v. Incubate overnight.

3. Analyze transformants.

أنا. Select Zeocin-resistant colonies and inoculate into LB medium with Zeocin.
ii. Grow overnight and isolate plasmid DNA.
ثالثا. Sequence the gene construct to confirm the correct insertion of gene within the vector.

4. Preparation for transformation

Prior to transformation and selection in Pichia, the plasmid should be linearized. Vector linearized within the 5’ AOX1 region will integrate into the host 5’ AOX1 region by gene insertion.

أنا. Digest the plasmid DNA with selected restriction enzymes.
ii. Check the digested mixture for complete linearization by agarose gel electrophoresis.
ثالثا. Once the vector is confirmed to be completely linearized, use heat treatment for inactivation or add EDTA to cease the reaction immediately.
رابعا. Use phenol/chloroform for extraction and ethanol for precipitation of the DNA.
v. Centrifuge the solution and wash the pellet DNA with ethanol.
vi. Resuspend the DNA in sterile water after air-dry for immediate use or store at -20°C.

5. Electroporation of Pichia.

The method of electroporation is strongly recommended because it gives the highest transformation frequency in Pichia.

أنا. Grow the selected P.pastoris strain in yeast medium overnight.
ii. Add fresh medium in the overnight culture. Grow overnight again.
ثالثا. Centrifuge the cells and resuspend with ice-cold, sterile water. Repeat twice.
رابعا. Centrifuge the cells, then resuspend with ice-cold sorbitol. Repeat twice. Place the cells on ice before use.
v. Mix the cells with linearized DNA.
vi. Transfer the mixture to an ice-cold electroporation cuvette. Incubate on ice.
vii. Add ice-cold sorbitol to the cells, then transfer the cuvette content and incubate at 30°C.
viii. Spread the cells on plates for Zeocin selection.
ix. Incubate the plates until colonies form.
x. Pick 10-20 colonies for further selection.

6. Analyze Pichia transformants

أنا. Inoculate yeast medium with the chosen single colony of Pichia strain. Grow overnight.
ii. Dilute the cells from the overnight culture and grow approximately 4-6 h.
ثالثا. Centrifuge the cells and keep the pellet.
رابعا. Resuspend the cell pellet and get the competent cells.
v. The cells can be kept at room temperature and used for transformation assay at once or frozen for storage.

7. Transformation assay

The following procedure provides details of transformation of freshly prepared or frozen competent Pichia cells. Note that transformation efficiency may vary among different Pichia strains and expression vectors used.

أنا. Add linearized recombinant vector DNA to the competent cells.
ii. Add solution containing PEG into the DNA/cell mixture.
ثالثا. Incubate the transformation reaction for 1h at 30°C. Mix the reaction solution to increase transformation efficiency.
رابعا. Treat with heat shock and split the cells into microcentrifuge tubes for incubation.
v. Centrifuge the cells and keep the pellet.
vi. Resuspend and combine the cells.
vii. Plate the cells for selection. Incubate the plates until colonies appear.

8. Determine the Mut (Methanol Utilization Slow) phenotype.

Identify the expression levels among several chosen Mut phenotypes by SDS-PAGE analysis and screen for the high-expression Pichia recombinant clones. This may help optimize the expression condition of the recombinant clone.

The effectiveness of expression conditions of Pichia strain with Mut phenotype can be tested as follows.

أنا. Include a control gene transformed with the parent vector as a control for background intracellular expression.
ii. Inoculate a single colony in a baffled shaking flask and grow at 28-30°C.
ثالثا. Harvest the cells and centrifuge at room temperature.
رابعا. Discard supernatant and resuspend cell pellet. Cover the flask with 2 layers of sterile gauze and continue growth.
v. Add methanol every 24 hours to maintain induction.
vi. Transfer 1 ml of the expression culture to a fresh microcentrifuge tube to analyze expression levels at a series of time points (i.e., 0-96 h post-induction).
vii. Determine the optimal time to harvest the cells. Centrifuge the cells at room temperature.
viii. For secreted expression, transfer the supernatant to a fresh tube and store until ready to assay. While, for intracellular expression, discard the supernatant and store the cell pellets until ready to assay.
ix. Analyze the supernatants and cell pellets respectively for protein expression by SDS-PAGE and Western blot.

The above steps can be adjusted to optimize expression for your target protein.

9. Scale-up expression.

Once expression condition is optimized, larger baffled flasks or fermentation will be utilized to increase the culture volume for scale-up production of target protein.

Note that proteins secreted into the media are normally more than 50% homogeneous and need additional purification. Therefore it is an optimal step to concentrate the protein before the purification process if the expression level is low. Commonly used methods for this step are ammonium sulfate precipitation, lyophilization and centrifuge concentrator for small volumes [5] .

مراجع:

[1] Higgins D R. Overview of protein expression in Pichia pastoris[J]. Curr Protoc Protein Sci, 2001, Chapter 5: Unit5 7.
[2] Higgins D R, Cregg J M. Introduction to Pichia pastoris[J]. Methods Mol Biol, 1998, 103: 1-15.
[3] Lundblad R L. Glycosylation in Pichia pastoris[J]. Biotechnol Appl Biochem, 1999, 30 ( Pt 3): 191-2.
[4] Bretthauer R K, Castellino F J. Glycosylation of Pichia pastoris-derived proteins[J]. Biotechnol Appl Biochem, 1999, 30 ( Pt 3): 193-200.
[5] Buckholz R G, Gleeson M A. Yeast systems for the commercial production of heterologous proteins[J]. Biotechnology (N Y), 1991, 9(11): 1067-72.


مقدمة

Membrane proteins (MP) play a central role in several biological processes, which includes cell signaling, ion and metabolites transport and energy conversion. Since the first MP structure was determined in 1986 1 , over 450 unique MP structures have been obtained (see crystal structure list from White 2 and NMR structure list from Warschawski 3 ). They provide molecular details explaining how MP work. Despite numerous breakthroughs in X-ray diffraction 4,5 , NMR 6 and electron microscopy 7 , as well as in MP production 8,9,10,11 and stabilization 12 , the structural biology of MP is hampered by the production of the recombinant protein and its purification in a functional state. In 1986, Studier and colleagues 13 set up a powerful bacterial expression system, in which the RNA polymerase from the bacteriophage T7 specifically drove the transcription of the target gene inserted in the expression plasmid, under the control of the T7 promoter. However, one of the main drawbacks of the T7 based expression system is that the rate of transcription of the target gene is rather fast because the T7 RNA polymerase (T7 RNApol) transcription activity is over ten times faster than بكتريا قولونية RNA polymerase. Moreover, the expression system is further enhanced by the copy number of the expression plasmid. Consequently, upon expression of the T7 RNApol, an excess of target RNA is produced, which is often toxic to the cell and triggers uncoupling between transcription and translation and growth arrest 14,15 . Therefore, several strategies have been developed to attenuate and better regulate the T7 expression system: 1. Introducing a T7/lac hybrid promoter within the expression plasmid 2. Over-expressing the T7 lysozyme, a natural inhibitor of the T7 RNApol 16 3. Expressing the T7 RNApol under the control of the tightly regulated arabinose promoter (BL21-AI, Invitrogen).

In 1996, two spontaneous mutants of the BL21λ(DE3) bacterial host, namely C41λ(DE3) and C43λ(DE3), were isolated by exploiting the toxicity of the over-expression of the oxoglutarate mitochondrial carrier gene and of atpF encoding the b subunit of the بكتريا قولونية ATP synthase, respectively 17 . We found that the level of accumulation of the target gene mRNA is ten times lower in C41λ(DE3) and is delayed by one hour in the C41λ(DE3)-derived bacterial host, C43λ(DE3). More recently, Wagner وآخرون. have shown that the level of T7 RNApol is strongly reduced in both mutants, thereby allowing the bacterial cell to mediate cell growth with protein production 18 . Ensuring viability allowed metabolic adaptation, as illustrated by the production of the b subunit of the ATP synthase. In the C41λ(DE3) host, the b subunit was found in a partially unfolded state whereas in the C43λ(DE3) host, the production of the protein was accompanied by intense membrane proliferation with the b subunit in the correctly folded state 19 . In parallel to developments in the T7 based expression system, alternative expression systems have been established by employing arabinose 20 , lactose, tetracycline 21 , or T5 promoters 22 . Today, a profusion of expression plasmids and bacterial hosts are available for protein over-production 23,24 , however there is no clear rationale for choosing the appropriate bacterial expression system in each individual case.

Our objective here was to perform a global analysis of existing expression systems in the frame of MP production and structure determination. In a first step, entry codes referring to membrane protein structures obtained from بكتريا قولونية were extracted from the Protein Data Bank (PDB) and the two major expression systems, T7 and arabinose promoter based, were identified. In a second step, a bibliographic database was constructed to perform an extensive analysis of expression protocols. The results we have obtained thus provide a systematic set of rules for the successful production of membrane proteins in بكتريا قولونية.


مقدمة

Prion diseases, also referred as transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), are a family of rare progressive neurodegenerative disorders that affect both humans and animals [1]. TSEs include, for instance, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle, and Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans. These disorders are characterized by long incubation periods and characteristic spongiform changes in the brain associated with neuronal loss. The causative agent of TSEs is an infectious protein known as prion (also denoted as PrP Sc ) [2]. This pathogenic beta-sheet-rich conformer derives from the normal, mostly alpha-helical isoform, cellular prion protein (PrP or PrP C ), through a conformational conversion event which leads to aggregates in the brains of affected individuals leading to neurodegeneration [3].

Since the identification of prions as the causing agent of TSEs, recombinant PrP has been instrumental to study the structural and biophysical aspects of prion amyloidosis [4].

Due to its easy handling, inexpensive medium and large-scale production, the enteric bacterium الإشريكية القولونية (بكتريا قولونية) is the organism of choice for the production of numerous recombinant proteins [5]. However, expression of mammalian proteins in بكتريا قولونية remains difficult and often results in inactive aggregates because the recombinant proteins do not fold properly in this host [6]. For example, recombinant PrP is largely expressed as inclusion bodies [7]. Most refolding protocols require a large amount of reagents and are time consuming. Success is highly dependent on the experimenter's savoir-faire. Attempts to assist proper folding of the PrP in the cytoplasm of بكتريا قولونية by co-expression with bacterial chaperones failed [8]. As the formation of a disulfide bond is essential for PrP proper folding, expression of full-length PrP in the periplasm of بكتريا قولونية was also investigated, resulting in soluble PrP which is partially degraded at the unstructured N-terminal end [9]. It has been observed that PrP can interact with several chaperones from the endoplasmic reticulum (ER) [10], including Pdia3 (also known as ERp57) and Grp58 (ERp60) [11], suggesting that in physiological condition, PrP requires assistance to fold into the correct conformation. In addition, PrP contains a disulfide bond which is crucial for the proper α-helical fold [12]. Based on these observations, we investigated the use of QSOX as a folding catalyst for PrP in the cytoplasm of بكتريا قولونية. QSOX is a human chaperone that introduces disulfide bonds in secreted proteins downstream of the ER [13], and has been shown to be enzymatically active in the bacterial cytoplasm [14].

In the present study, we describe for the first time the production of soluble PrP of both mouse (MoPrP) and human (HuPrP) using co-expression with QSOX in the بكتريا قولونية cytoplasm.


شاهد الفيديو: محاضرة الإيشيريشيا كولاي Escherichia coli Lecture (كانون الثاني 2022).