معلومة

7.8: التعبير الجيني - علم الأحياء


المصدر: BiochemFFA_7_7.pdf. الكتاب الدراسي بأكمله متاح مجانًا من المؤلفين على http://biochem.science.oregonstate.edu/content/biochemistry-free-and-easy

تخبرنا عمليات النسخ والترجمة الموصوفة حتى الآن بالخطوات المتضمنة في نسخ المعلومات من الجين (DNA) إلى الحمض النووي الريبي (RNA) وتخليق البروتين الموجه بواسطة تسلسل النص (الشكل 7.102). هذه الخطوات مطلوبة للتعبير الجيني ، وهي العملية التي من خلالها تقوم المعلومات الموجودة في الحمض النووي بتوجيه إنتاج البروتينات التي تحتاجها الخلية.

ولكن ما الذي يحدد ما إذا كان الجين قد تم التعبير عنه في وقت معين؟ الخلايا ، كما نعلم ، لا تعبر عن كل جيناتها طوال الوقت. يتم التعبير عن بعض الجينات في أنواع خلايا معينة دون غيرها ، بينما يمكن التعبير عن البعض الآخر في مراحل محددة من التطور. يجب أن تكون الخلايا أيضًا قادرة على تغيير أنماط التعبير الجيني الخاصة بها استجابةً للإشارات الداخلية والخارجية ، والتحكم في إنتاج البروتينات حسب الحاجة ، لتلبية احتياجاتها المتغيرة. لذلك ، فإن تنظيم التعبير الجيني أمر بالغ الأهمية. بالنظر إلى وجود عدة خطوات متضمنة في التعبير الجيني ، هناك عدة نقاط مختلفة يمكن فيها تنظيم العملية. ليس من المستغرب أن العديد من الآليات التنظيمية معروفة ، كل منها يعمل في مرحلة مختلفة في المسار من الحمض النووي إلى البروتين.

تنظيم النسخ

الخطوة الأولى في التعبير الجيني هي النسخ ، لذا فإن تنظيم النسخ هو طريقة واضحة للتأثير على ما إذا كان الجين يتم التعبير عنه وإلى أي مدى.

ما هي المفاتيح الجزيئية التي تعمل على تشغيل النسخ أو إيقافه؟ على الرغم من وجود عوامل إضافية تؤثر على النسخ ، مثل إمكانية وصول الجين إلى آلية النسخ ، فإن الآلية الأساسية التي يتم من خلالها تنظيم النسخ تعتمد على تفاعلات محددة للغاية بين البروتينات المنظمة للنسخ والتسلسلات التنظيمية على الحمض النووي.

ما هي هذه التسلسلات التنظيمية وما البروتينات التي تربطها؟ بالإضافة إلى تسلسلات المحفز المطلوبة لبدء النسخ ، تحتوي الجينات على تسلسلات تنظيمية إضافية لرابطة الدول المستقلة (تسلسلات من الحمض النووي على نفس جزيء الحمض النووي مثل الجين) تتحكم في وقت نسخ الجين. التسلسلات التنظيمية مرتبطة بإحكام وبشكل خاص بمنظمات النسخ ، وهي بروتينات يمكنها التعرف على تسلسل الحمض النووي والارتباط بها. يمكن أن يؤدي ارتباط هذه البروتينات بالحمض النووي إلى تنظيم النسخ عن طريق منع أو زيادة النسخ من محفز معين.

تنظيم النسخ في بدائيات النوى

دعونا نفكر أولاً في بعض الأمثلة من بدائيات النوى. في البكتيريا ، غالبًا ما تتجمع الجينات في مجموعات ، بحيث تكون الجينات التي يجب التعبير عنها في نفس الوقت بجوار بعضها البعض ويتم التحكم فيها جميعًا كوحدة واحدة بواسطة نفس المروج. يُشار إلى مجموعات الجينات التي يتم تنظيمها بشكل منسق من قبل مروج واحد باسم الأوبراونات. يمكن التحكم في المجموعة الكاملة من الجينات في الأوبرون من خلال عمل بروتينات ربط الحمض النووي التي تعمل إما كمثبطات (تمنع نسخ الجينات) أو منشطات (زيادة نسخ الجينات). يتم التحكم في ارتباط هذه البروتينات بأهداف الحمض النووي الخاصة بها عن طريق ربط جزيئات صغيرة محددة تشير إلى حالة الخلية.

تحريض أوبرون لاك

يعد lac operon أحد هذه المجموعات من الجينات المنظمة بشكل منسق والتي تقوم بتشفير البروتينات اللازمة لامتصاص سكر اللاكتوز وتفكيكه. تستخدم خلايا الإشريكية القولونية بشكل تفضيلي الجلوكوز لاحتياجاتها من الطاقة ، ولكن إذا كان الجلوكوز غير متوفر وكان اللاكتوز موجودًا ، فإن البكتيريا ستمتص اللاكتوز وتفككه للحصول على الطاقة. نظرًا لأن البروتينات المستخدمة في امتصاص اللاكتوز وتفتيته مطلوبة فقط عند غياب الجلوكوز ويكون اللاكتوز متاحًا ، فإن الخلايا البكتيرية تحتاج إلى طريقة للتعبير عن جينات أوبرون اللاكتوز فقط في ظل هذه الظروف. الحالة الافتراضية لـ lac operon هي OFF.

إزالة القامع

يتم التحكم في نسخ مجموعة الجينات lac بشكل أساسي بواسطة بروتين مثبط يرتبط بمنطقة من الحمض النووي فقط في اتجاه مجرى تسلسل -10 لمحفز lac (الشكل 7.104). تذكر أن المروج هو المكان الذي يجب أن يرتبط فيه بوليميراز الحمض النووي الريبي لبدء النسخ. يُطلق على الموقع الموجود على الحمض النووي حيث يرتبط مثبط lac المشغل (الشكل 7.105). عندما يتم ربط القامع في هذا الموضع ، فإنه يمنع فعليًا بوليميريز الحمض النووي الريبي من نسخ الجينات ، تمامًا كما تمنعك السيارة التي تسد طريقك من الانسحاب. من الواضح ، إذا كنت تريد المغادرة ، يجب إزالة السيارة التي تسد مسارك. وبالمثل ، من أجل حدوث النسخ ، يجب إزالة القامع من المشغل لمسح مسار بوليميريز الحمض النووي الريبي (الشكل 7.106).

كيف يتم إزالة القامع؟ عندما يكون سكر اللاكتوز موجودًا ، يتم امتصاص كمية صغيرة منه بواسطة الخلايا وتحويلها إلى شكل إيزومري ، ألاولاكتوز (الشكل 7.107). يرتبط Allolactose بالقمع ، ويغير شكله بحيث لا يعود مرتبطًا بالمشغل. عندما لا يكون القامع مرتبطًا بالمشغل ، تتم إزالة "حاجز الطريق" أمام بوليميراز الحمض النووي الريبي ، مما يسمح بنسخ جينات أوبرون اللاكتات

ما يجعل هذا نظام تحكم فعال بشكل خاص هو أن جينات أوبرون اللاكتوز تقوم بترميز البروتينات التي تمكن من تكسير اللاكتوز. يتطلب تشغيل هذه الجينات وجود اللاكتوز. بمجرد أن يتم تكسير اللاكتوز ، يرتبط مثبط اللاكتوز بالمشغل مرة أخرى ولا يتم التعبير عن جينات اللاكتوز. هذا يسمح بالتعبير عن الجينات فقط عند الحاجة إليها.

تجنيد بوليميراز الحمض النووي الريبي

ولكن كيف تؤثر مستويات الجلوكوز في التعبير عن جينات اللاك؟ لاحظنا سابقًا أنه إذا كان الجلوكوز موجودًا ، فلن يتم استخدام اللاكتوز. يتم ممارسة المستوى الثاني من التحكم بواسطة بروتين يسمى Catabolite Activator Protein (CAP - الشكل 7.108)). يرتبط CAP (يُسمى أحيانًا بروتين ربط CBP أو cAMP) بموقع مجاور للمُحفز وهو ضروري لتجنيد RNA polymerase لربط محفز lac.

ملزم cAMP

يرتبط CAP بموقعه فقط عندما تكون مستويات الجلوكوز منخفضة. ترتبط مستويات الجلوكوز المنخفضة بتنشيط إنزيم ، adenylate cyclase ، الذي يجعل الجزيء دوري AMP (cAMP). يؤدي ربط cAMP بـ CAP إلى تغيير توافقي في CAP يسمح له بالارتباط بموقع ربط CAP. عندما يكون CAP مرتبطًا بهذا الموقع ، فإنه يكون قادرًا على تجنيد بوليميريز RNA لربط المحفز ، وبدء النسخ.

إن الجمع بين ربط CAP ومانع اللاكتوز الذي ينفصل عن المشغل عندما تكون مستويات اللاكتوز عالية يضمن نسخ أوبرون اللاكتوز فقط عندما تكون هناك حاجة ماسة إليه. قد يُنظر إلى ربط CAP على أنه ضوء أخضر لبوليميراز RNA ، في حين أن إزالة مثبط lac يشبه رفع حاجز أمامه. عندما يتم استيفاء كلا الشرطين ، يقوم بوليميراز الحمض النووي الريبي بنسخ جينات المصب.

السيطرة على الاوبرون بالقمع

إن أوبرون اللاكتوز الذي وصفناه للتو عبارة عن مجموعة من الجينات التي يتم التعبير عنها فقط في ظل الظروف المحددة لنضوب الجلوكوز وتوافر اللاكتوز. يمكن التعبير عن جينات أخرى ما لم يتم استيفاء شرط معين. بالنسبة لهذه الجينات ، تكون الحالة الافتراضية هي ON.

مثال على ذلك هو أوبرون trp ، الذي يشفر الإنزيمات اللازمة لتخليق الحمض الأميني التربتوفان. يتم التعبير عن هذه الجينات بشكل أساسي (دائمًا قيد التشغيل) ، إلا عندما يكون التربتوفان متاحًا من محيط الخلية ، مما يجعل تركيبه غير ضروري. في ظل الظروف التي يكون فيها التربتوفان وفيرًا في البيئة ، يمكن إيقاف تشغيل جينات trp. يتم تحقيق ذلك عن طريق بروتين مثبط يرتبط بالمشغل فقط في وجود التربتوفان (الشكل 7.110). يؤدي ربط التربتوفان بالقمع إلى ربط القامع بالمشغل. نظرًا لأنه يعمل مع القامع لإيقاف جينات trp ، يُطلق على التربتوفان اسم القامع المشترك.

توهين

هناك آلية أخرى تنظم التعبير عن معامل trp وهي التوهين. التوهين هو عملية يتم من خلالها التحكم في التعبير عن الأوبرون عن طريق إنهاء النسخ قبل الجين الأول للأوبون (الشكل 7.111).

في أوبرون trp ، يعمل هذا على النحو التالي: يبدأ النسخ بعد مسافة معينة من الجين الأول في الأوبرون ، وينتج ما يسمى تسلسل الزعيم 5. يحتوي تسلسل القائد هذا على فاصل جوهري يمكن أن يشكل بنية دبوس شعر توقف النسخ عند توفر مستويات عالية من التربتوفان للخلايا. يمكن أن تشكل أيضًا بنية مختلفة تسمح بالنسخ المستمر للجينات في الأوبرون عندما تكون مستويات التربتوفان منخفضة. كيف يؤثر مستوى التربتوفان على أي من هذين الهيكلين يتشكل؟

تذكر أن نهاية الـ 5 من الحمض النووي الريبي هي الجزء الأول من النسخة التي سيتم إجراؤها وأن ترجمة البكتيريا مرتبطة بالنسخ ، لذلك تبدأ ترجمة نهاية الـ 5 من الحمض النووي الريبي قبل عمل النص بأكمله. اتضح أن التسلسل الرئيسي 5 بوصات لأوبيرون trp mRNA يشفر ببتيدًا قصيرًا يحتوي على كودونين من نوع التربتوفان. إذا كان هناك الكثير من مادة التربتوفان المتاحة ، فسيتم ترجمة تسلسل القائد بسهولة. في ظل هذه الظروف ، يكون تسلسل القائد قادرًا على تشكيل منعطف حاد ، مما يمنع نسخ جينات trp المصب.

ومع ذلك ، إذا كانت مستويات التربتوفان منخفضة ، فإن أكشاك الريبوسوم تتوقف عند محاولتها ترجمة التسلسل الرئيسي. في ظل هذه الظروف ، يتبنى تسلسل القائد شكلاً مختلفًا يسمح بالنسخ المستمر لجينات أوبرون trp.

مفاتيح الريبوس

تشبه آلية التحكم التي تسمى المحول الريبي (الشكل 7.113) من حيث المفهوم توهين مشغل trp الموضح أعلاه ، ولكنه لا يعتمد على الترجمة. توجد المحولات الريبية عادةً في 5'UTR من الرنا المرسال (أي أنها جزء من تسلسل الحمض النووي الريبي). يمكن لهذه التسلسلات التحكم في نسخ جينات المصب بناءً على التشكل الذي تتبناه. يسمح التشكل الأول بالنسخ المستمر ، بينما يقوم الآخر بإنهائه. إذن ، ما الذي يحدد التشكل الذي يتبنونه؟

سمات

تتميز مفاتيح الريبوسات بميزتين مميزتين مهمتين لوظيفتها. الأولى هي منطقة من التسلسل تسمى aptamer ، والتي تطوي إلى شكل ثلاثي الأبعاد يمكنه ربط جزيء مستجيب صغير. والآخر عبارة عن منطقة متجاورة من الحمض النووي الريبي ، تسمى منصة التعبير ، والتي يمكن أن تطوى إلى مطابقة مختلفة اعتمادًا على ما إذا كان الأبتامر مرتبطًا بالمستجيب أم لا.

مثال على المحول الريبي الموجود في البكتيريا هو المحول الريبي الغواني ، الذي يتحكم في التعبير عن الجينات اللازمة للتخليق الحيوي للبيورين. ترتبط منطقة aptamer لهذا المحول الريبي بالمُستجيب ، الجوانين ، عندما تكون مستويات القاعدة مرتفعة. يؤدي ارتباط الجوانين إلى حدوث تغيير في طي منصة التعبير النهائية ، مما يتسبب في اعتمادها لتشكل ينهي نسخ الجينات اللازمة لتخليق الجوانين. في حالة عدم وجود الجوانين ، تفترض منصة التعبير شكلاً مختلفًا يسمح بنسخ جينات التخليق الحيوي للبيورين. وبالتالي ، يمكن استشعار مستويات الجوانين ويمكن التعبير عن الجينات اللازمة لتركيبها حسب الحاجة.

تنظيم النسخ في حقيقيات النوى

يتم أيضًا تنظيم النسخ في حقيقيات النوى من خلال ارتباط البروتينات بتسلسلات محددة من الحمض النووي ، ولكن مع بعض الاختلافات عن المخططات البسيطة الموضحة أعلاه.

بالنسبة لمعظم الجينات حقيقية النواة ، فإن عوامل النسخ العامة وبوليميراز الحمض النووي الريبي (أي مجمع بدء النسخ) ضرورية ولكنها ليست كافية لمستويات النسخ العالية. تسلسل الحمض النووي الداني المروج مثل صندوق CAAT ومربع GC البروتينات التي تتفاعل مع مجمع بدء النسخ ، مما يؤثر على تكوينه (الشكل 7.114).

التسلسلات التنظيمية البعيدة

هناك حاجة إلى تسلسلات تنظيمية إضافية تسمى المعززات والبروتينات التي ترتبط بها لتحقيق مستويات عالية من النسخ. المعززات عبارة عن تسلسلات قصيرة من الحمض النووي تنظم نسخ الجينات ، ولكنها قد تكون موجودة على مسافة من الجين الذي تتحكم فيه (على الرغم من وجودها على نفس جزيء الحمض النووي مثل الجين). غالبًا ما تكون المعززات عبارة عن عدة قواعد على الحمض النووي ، إما في المنبع أو في اتجاه مجرى الجين. كما يوحي الاسم ، يمكن أن تعزز المعززات (تزيد) نسخ جين معين. كيف يمكن أن يؤثر تسلسل الحمض النووي بعيدًا عن الجين الذي يتم نسخه على مستوى النسخ؟

منشطات النسخ

تعمل المعززات عن طريق ربط البروتينات (المنشطات النسخية) التي يمكنها بدورها التفاعل مع البروتينات المرتبطة بالمحفز. يمكن أن تتلامس منطقة مُحسِّن الحمض النووي ، مع المنشط (المنشط) النسخي المرتبط به ، مع مجمع بدء النسخ المرتبط في موقع بعيد عن طريق حلقات الحمض النووي (الشكل 7.115). يسمح هذا للبروتين المرتبط بالمُحسِّن بالاتصال بالبروتينات في مجمع النسخ القاعدي. قد يكون تفاعل المنشط مع معقد بدء النسخ مباشرًا ، أو قد يكون من خلال "الرجل المتوسط" ، وهو مركب بروتيني يسمى الوسيط.

يتمثل أحد تأثيرات هذا التفاعل في المساعدة في تجنيد البروتينات اللازمة للنسخ ، مثل عوامل النسخ العامة وبوليميراز الحمض النووي الريبي إلى المروج ، مما يزيد من تواتر وكفاءة تكوين مجمع بدء النسخ. هناك أيضًا دليل على أنه في بعض المروجين ، بعد تجميع معقد بدء النسخ ، يظل بوليميريز الحمض النووي الريبي متوقفًا عند المروج. في مثل هذه الحالات ، يمكن أن يلعب التفاعل مع مجمع بدء النسخ لمنشط مرتبط بمُحسِّن دورًا في تسهيل انتقال بوليميريز الحمض النووي الريبي إلى مرحلة استطالة النسخ.

بروتينات إعادة تشكيل الكروماتين

هناك آلية أخرى يمكن من خلالها للمنشطات المرتبطة بالمُحسِّن أن تؤثر على النسخ ، وهي عن طريق تجنيد البروتينات المحفزة التي يمكنها تعديل بنية تلك المنطقة من الكروموسوم. في حقيقيات النوى ، يتم تعبئة الحمض النووي بالبروتينات لتكوين الكروماتين. عندما يرتبط الحمض النووي ارتباطًا وثيقًا بهذه البروتينات ، يصعب الوصول إليه من أجل النسخ. لذا يمكن للبروتينات التي تجعل الحمض النووي أكثر سهولة في الوصول إلى آلية النسخ أن تلعب أيضًا دورًا في مدى حدوث النسخ.

كاتمات الصوت

بالإضافة إلى المعززات ، هناك أيضًا تسلسلات تنظيمية سلبية تسمى كاتمات الصوت. ترتبط مثل هذه التسلسلات التنظيمية ببروتينات المثبط النسخي. مثل المنشطات النسخية ، تعمل هذه المكابس من خلال التفاعل مع مجمع بدء النسخ. في حالة المثبطات ، فإن تأثيرها على معقد بدء النسخ هو تقليل النسخ.

بروتينات ربط الحمض النووي

منشطات النسخ والمثبطات عبارة عن بروتينات معيارية - لها جزء يربط الحمض النووي وجزء ينشط أو يقمع النسخ من خلال التفاعل مع مجمع بدء النسخ (الشكل 7.118). مجال ربط الحمض النووي هو جزء من البروتين يمنح خصوصية لتحديد الجين (الجينات) الذي سيتم تنشيطه أو قمعه. مجال التنشيط هو جزء من البروتين الذي يحفز أو يقمع النسخ. تشكل مجالات ربط الحمض النووي لمنشطات النسخ هياكل مميزة تتعرف على تسلسل الحمض النووي المستهدف من خلال إجراء اتصالات مع القواعد ، عادةً في الأخدود الرئيسي في حلزون الحمض النووي. من الممكن هندسة عوامل النسخ الهجينة التي تجمع بين مجال ربط الحمض النووي لأحد المنشطين ومجال التنشيط الخاص بآخر. تحتفظ هذه البروتينات بالخصوصية التي يمليها مجال ربط الحمض النووي. يمكن أيضًا إنشاء عوامل النسخ المقتطعة التي لها مجال ربط الحمض النووي الخاص بها ولكنها تفتقر إلى مجال التنشيط. يمكن أن تكون عوامل النسخ هذه أدوات مفيدة في دراسة تنظيم النسخ لأن مجالات ربط الحمض النووي الخاصة بها يمكن أن تتنافس مع عوامل النسخ الذاتية لمواقع الربط التنظيمي دون زيادة النسخ من المروجين المستهدفين.

عوامل متعددة

قد يشير الوصف أعلاه إلى أن كل جين في حقيقيات النوى يتم التحكم فيه عن طريق ربط منشط أو مثبط للنسخ بمُحسِّن معين أو موقع كاتم للصوت. ومع ذلك ، فقد اتضح أن نسخ أي جين معين يمكن تنظيمه في وقت واحد من خلال مجموعة من البروتينات ، المنشطات والمثبطات ، المرتبطة في مواقع تنظيمية متعددة على الحمض النووي ، وكلها تتفاعل مع مجمع بدء النسخ. توفر الطبيعة التجميعية لمثل هذا التنظيم تنوعًا كبيرًا ، مع مجموعات مختلفة من العناصر التنظيمية والبروتينات التي تعمل معًا استجابة لمجموعة متنوعة من الظروف والإشارات.

ركزت الآليات الموصوفة حتى الآن على عناصر التسلسل في الحمض النووي التي تنظم النسخ من خلال بروتينات المنشط والقمع المرتبطة بها. بعد النسخ ، يمكن أيضًا أن يؤدي التضفير البديل (انظر هنا) وتحرير النصوص إلى تعديل البروتينات التي تنتجها الخلية. سنقوم الآن بفحص بعض الطرق الأخرى التي يتم بها تعديل التعبير الجيني في الخلايا.

أولاً ، سننظر في بعض الآليات اللاجينية المزعومة التي تؤثر على التعبير الجيني. يُشتق مصطلح علم التخلق من epi (أعلاه ، أو فوق) والجينات (الجينات) ويشير إلى حقيقة أن هذه الآليات تعمل بالإضافة إلى المعلومات الموجودة في التسلسلات الجينية أو تتراكب عليها. اثنان من هذه الآليات اللاجينية هما التعديلات التساهمية للهيستونات في الكروماتين والمثيلة لتسلسل الحمض النووي.

تعديل هيستون

كما ذكرنا سابقًا ، فإن النسخ في حقيقيات النوى معقد بسبب حقيقة أن الحمض النووي معبأ بالهيستونات لصنع الكروماتين. هذا يعني أنه من أجل نسخ الجين ، يجب فتح المناطق ذات الصلة من الكروماتين للسماح بالوصول إلى بوليميريز الحمض النووي الريبي وعوامل النسخ. يوفر هذا نقطة أخرى محتملة للتحكم في التعبير الجيني. تساعد عوامل إعادة تشكيل الكروماتين ، المذكورة سابقًا ، في إعادة تنظيم بنية النواة في المناطق التي يجب إتاحتها.

ولكن ما الذي يحدد أن منطقة معينة من الكروماتين سيتم العمل عليها من خلال مجمعات إعادة التشكيل؟ تعمل بروتينات المنشط النسخية المرتبطة بالمعززات ، أحيانًا عن طريق تجنيد إنزيمات معدلة للهيستون في منطقة المروج. مثال على هذا الإنزيم المعدل هو هيستون أسيتيل ترانسفيراز (HAT) الذي يعمل على أسيتيل بقايا الأحماض الأمينية المحددة في ذيول الهيستونات التي تشكل نواة النواة (الشكلان 7.119 و 7.120).يُعتقد أن أستلة الهستونات هي المسؤولة عن تخفيف التفاعل بين الهيستونات والحمض النووي في الجسيمات النووية وتساعد على جعل الحمض النووي أكثر سهولة للنسخ. يمكن تحقيق التأثير المعاكس إذا كانت الإنزيمات المعينة هي هيستون ديستيلاس (HDAC) التي تزيل مجموعات الأسيتيل من ذيول الهيستونات في الجسيم النووي ، وتؤدي إلى إحكام تعبئة الكروماتين.

الكتاب والقراء والمحايات

بالإضافة إلى هيستون أسيتيل ترانسلايز و ديستيلاسيس ، قد تضيف إنزيمات أخرى أو تزيل مجموعات الميثيل ، ومجموعات الفوسفات ، والشقوق الكيميائية الأخرى إلى سلاسل جانبية معينة من الأحماض الأمينية على ذيول الهيستون. يتم إنشاء أنماط هذه التعديلات التساهمية ، التي تسمى أحيانًا رمز هيستون ، من قبل ما يسمى بـ "الكتاب" ، أو الإنزيمات ، مثل هيستون ميثيل ترانسفيرازات ، التي تضيف المجموعات الكيميائية إلى ذيول الهيستون. ومع ذلك ، فإن الإنزيمات الأخرى ، مثل دي ميثيلاز هيستون ، قد تعمل بمثابة "محايات" ، حيث تزيل المجموعات الكيميائية التي أضافها "الكتاب". يتم تفسير كود هيستون من قبل "القراء" ، وهي بروتينات ترتبط بمجموعات محددة من التعديلات وتساعد إما في إسكات التعبير عن الجينات في المنطقة المجاورة أو جعل المنطقة أكثر نشاطًا نسبيًا.

مثيلة الحمض النووي

يمكن أيضًا تنظيم التعبير الجيني عن طريق مثيلة المكون الآخر للكروماتين - DNA. إنزيمات تسمى DNA methyltransferases (DNMTs) تحفز الإضافة التساهمية لمجموعة الميثيل إلى C5 من السيتوزينات في الحمض النووي. تختلف أنماط مثيلة السيتوزين باختلاف الكائنات الحية ، حيث تتركز الميثلة في بعض أجزاء الجينوم في بعض المجموعات وتنتشر في جميع أنحاء الجينوم في أخرى. في الفقاريات ، تكون السيتوزينات التي يتم ميثيلها بشكل عام بجوار الجوانين (عادةً ما يتم اختصار CG ثنائي النوكليوتيد إلى CpG). يبدو أن مثيلة الحمض النووي مرتبطة بإسكات الجينات بينما يرتبط نزع الميثيل بزيادة النسخ (الشكل 7.121).

كيف تنظم مثيلة الحمض النووي في مواقع CpG التعبير الجيني؟ على الرغم من أن مدى مثيلة الحمض النووي بالقرب من المحفزات قد لوحظ أنه يرتبط بإسكات الجينات ، إلا أنه ليس من الواضح بالضبط كيف تؤدي المثيلة إلى هذا التأثير. تم اقتراح أن المثيلة يمكن أن تمنع ارتباط البروتينات اللازمة للنسخ. قد تمنع الميثيل في مواقع المحسن أيضًا ربط المنشطات النسخية بها.

ملاحظة أخرى مثيرة للاهتمام هي أن بعض البروتينات التي ترتبط بمواقع CpG الميثيلية يبدو أنها تتفاعل أيضًا مع هيستون ديستيلاسيس. كما هو مذكور أعلاه ، تقوم هيستونات نزع الأسيتيل بإزالة مجموعات الأسيتيل من الهستونات ، وتعزز التعبئة الأكثر إحكامًا للكروماتين وإسكات النسخ. وبالتالي ، من المحتمل أن تعمل المثيلة على الحمض النووي بالاشتراك مع تعديل هيستون للتأثير على التعبير الجيني.

RNAs التنظيمية

كان أحد أكثر الاكتشافات غير المتوقعة في العقود القليلة الماضية هو الدور الذي تلعبه RNAs في تنظيم التعبير الجيني. من المعروف الآن أن النظرة الكلاسيكية القائلة بأن الحمض النووي الريبي (RNA) إما يشفر البروتينات (mRNA) أو يساعد في تركيبها (rRNA و tRNA) أقل بكثير من الطرق المختلفة التي تعمل بها RNA في التعبير الجيني. من الواضح الآن أن RNAs التنظيمية لها تأثيرات واسعة النطاق وهامة على التعبير الجيني ، وهو إدراك أحدث ثورة في فهمنا لتنظيم الجينات.

ما هي بعض الطرق التي تعمل بها الرنا التنظيمي لتعديل التعبير الجيني؟

الحمض النووي الريبي التنظيمي الصغير

MicroRNAs (miRNAs) و RNAs قصيرة التداخل (siRNAs) هي رنا صغيرة غير مشفرة تعمل على مستوى ما بعد النسخ لتنظيم التعبير الجيني (الشكل 7.123 و 7.124). يبدو أن هذه الرناوات تعمل على إسكات الجينات عن طريق الاقتران الأساسي مع mRNAs المستهدفة وتمييزها للتحلل ، أو عن طريق منع ترجمتها. تتكون الأشكال الوظيفية لكل من miRNAs و siRNAs من 20-30 نيوكليوتيدات طويلة ويتم اشتقاقها من خلال المعالجة من النصوص الأولية الأطول. تعمل miRNAs الناضجة و siRNAs جنبًا إلى جنب مع فئة من البروتينات تسمى بروتينات Argonaute لتشكيل مركب إسكات الجينات.

يتم نسخ MicroRNAs من جينات معينة بواسطة RNA polymerase II. يتم طي النسخة الأولية ، المعروفة باسم pri-miRNA على نفسها لتشكيل هياكل دبوس شعر مزدوجة تقطعت بهم السبل مشقوقة بواسطة RNase في النواة تسمى Drosha. يتم تصدير منتجات انقسام دروشا ، RNAs مزدوج الشريطة لما يقرب من 60-70 نيوكليوتيدات معروفة باسم pre-miRNAs ، إلى السيتوبلازم ، حيث تتم معالجتها أيضًا في أطوال نيوكليوتيد صغيرة 20-30 من miRNAs الناضجة مزدوجة الشريطة بواسطة إنزيم المعروف باسم Dicer. إن ازدواج RNA لـ miRNAs غير متطابق تمامًا ، ولها حلقات وعدم تطابق (الشكل 7.124).

تستمد siRNAs أيضًا من RNAs مزدوج الشريطة ، ولكنها قد تنشأ إما من مصادر داخلية أو خارجية (مثل الفيروسات). تتم معالجة هذه RNAs مزدوجة الشريطة في السيتوبلازم بواسطة نفس الإنزيم ، Dicer ، الذي يولد miRNAs الناضجة ، لإنتاج 20-30 نيوكليوتيد مزدوج الشريطة RNAs.

على عكس miRNAs ، فإن siRNAs الناضجة تقترن تمامًا بقاعدة على طول أطوالها.

تجميع RISC

ثم يتم تجميع كل من miRNAs و siRNAs مع بروتينات Argonaute لتشكيل مجمع إسكات يسمى RISC (مجمع الإسكات الناجم عن RNA). تذكر أن كلا من الجزيئات المجهرية و siRNAs مزدوجة الشريطة في هذه المرحلة. يشار إلى خيط واحد من RNA باسم دليل RNA ، بينما يسمى الآخر RNA الراكب.

أثناء عملية تحميل RNA على بروتين Argonaute ، تظل خيوط التوجيه الخاصة بـ RNA مرتبطة بالبروتين ، بينما تتم إزالة حبلا الراكب. إن دليل الحمض النووي الريبي المرتبط ببروتين الأرجونوت هو مركب إسكات الجينات الوظيفي (الشكل 7.125).

يؤدي تسلسل الاقتران الأساسي المحدد من الدليل RNA مع mRNA إما إلى تدهور mRNA بواسطة بروتين Argonaute (في حالة siRNAs) أو في قمع ترجمة mRNA (لـ miRNAs). إلى أي مدى تلعب هذه العمليات دورًا في تنظيم التعبير الجيني مثير للإعجاب. لقد ثبت بالفعل أن التعبير عن ما لا يقل عن ثلث جميع الجينات البشرية يتم تعديله بواسطة miRNAs ، مما يدل بوضوح على أن هذه RNAs تلعب دورًا رئيسيًا في تنظيم الجينات.

RNAs طويلة غير مشفرة

الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (lncRNAs) عبارة عن رنا يحتوي على أكثر من 200 نيوكليوتيد لا يرمز للبروتينات. بعض هذه الحمض النووي الريبي مشتق من تسلسلات intron ، في حين أن البعض الآخر ، المنسوخ من مناطق بين الجينات يشكل مجموعة فرعية من lncRNAs تسمى lincRNAs (رنا طويلة بين الجينات غير مشفرة). ومع ذلك ، يتم إنتاج lncRNAs الأخرى كنصوص مضادة للترميز من الجينات المشفرة. يُعتقد أن 30000 نسخة مذهلة في البشر هي lncRNAs ، لكن لا يُعرف سوى القليل عن وظيفتها. من خلال عدد قليل من lncRNAs التي تمت دراستها بشكل مكثف ، من الواضح أنها لا تعمل جميعها بنفس الطريقة. ومع ذلك ، يبدو أنها تؤثر على التعبير الجيني بطرق متنوعة بما في ذلك تعديل بنية الكروماتين ، وتنظيم التضفير ، أو العمل كسقالات هيكلية لتجميع مجمعات البروتين النووي. سيتم الكشف عن آليات إضافية بلا شك أثناء التحقيق في هذه الرنا الرائعة في السنوات القادمة.

تنظيم الترجمة

يعتمد تخليق البروتينات على مدى توفر الرنا المرسال الذي يشفرها. إذا تم حظر mRNA عند نهايته 5 ، فلا يمكن ترجمته. سيؤثر معدل تحلل الرنا المرسال على المدة التي يستغرقها لتوجيه تخليق البروتين الذي يرمز إليه. يمكن أيضًا تنظيم التعبير الجيني من خلال آليات تغير معدل تحلل الرنا المرسال. يستخدم تنظيم الترجمة للتحكم في إنتاج العديد من البروتينات. مثالان ، الفيريتين ومستقبل الترانسفيرين ، مهمان لتخزين الحديد ونقله في الخلايا. الفيريتين هو بروتين مرتبط بالحديد يعزل ذرات الحديد في الخلايا لمنعها من التفاعل. عندما تكون مستويات الحديد مرتفعة ، تكون هناك حاجة إلى مزيد من الفيريتين مقارنةً بانخفاض مستويات الحديد. كيف يتم تنظيم مستويات الفيريتين؟ يحتوي 5'UTR من ferritin mRNA على تسلسل 28 نيوكليوتيد يسمى عنصر الاستجابة الحديدية ، أو IRE (الشكل 7.127). عندما تكون مستويات الحديد منخفضة ، يرتبط IRE بالبروتين. وجود البروتين المرتبط بـ IRE عند ترجمة الكتل 5'UTR لـ ferritin mRNA. ومع ذلك ، إذا كانت مستويات الحديد عالية ، فإن الحديد يرتبط بالبروتين المرتبط بـ IRE ، والذي يخضع لتغييرات تكوينية وينفصل عن IRE. هذا يحرر نهاية 5 'من ferritin mRNA لتجميع الريبوسوم وترجمته ، مما ينتج المزيد من الفيريتين.

البروتين الآخر المشارك في نقل الحديد ، مستقبل الترانسفيرين ، مطلوب لامتصاص الحديد في الخلايا ، عندما تكون مستويات الحديد داخل الخلايا منخفضة. في حالة مستقبلات الترانسفيرين ، عندما تكون مستويات الحديد منخفضة ، هناك حاجة إلى المزيد منه. عندما تكون مستويات الحديد عالية ، ليست هناك حاجة لعمل المزيد من مستقبلات الترانسفيرين. يحتوي ترميز mRNA لمستقبل الترانسفيرين أيضًا على تسلسلات IRE ، ولكن في هذه الحالة ، يقع IRE في 3'UTR من النص (الشكل 7.128). إن IRE ، كما في حالة الفيريتين ، مرتبط بالبروتين المرتبط بـ IRE. عندما تكون مستويات الحديد في الخلية عالية ، يرتبط الحديد بالبروتين المرتبط بـ IRE ، والذي ينفصل عن IRE. هذا يترك 3'UTR عرضة للهجوم من قبل RNases ، مما يؤدي إلى تدهور مستقبل الترانسفيرين mRNA. في الأوقات التي تكون فيها مستويات الحديد منخفضة ، يظل البروتين المرتبط بـ IRE مرتبطًا بـ UTR 3 من mRNA ، مما يؤدي إلى استقراره والسماح بمزيد من مستقبلات الترانسفيرين عن طريق الترجمة.

يتم التحكم في التعبير الجيني في العديد من الخطوات

كما يتضح من الأمثلة في هذا القسم ، فإن تنظيم التعبير الجيني في الخلايا حقيقية النواة هو وظيفة لآليات متعددة تعمل في مراحل مختلفة في تدفق المعلومات من الحمض النووي إلى البروتين ، وتستجيب للحالة الداخلية للخلية وكذلك الظروف والإشارات الخارجية.

معالجة المعلومات: التعبير الجيني

803

محاضرات يوتيوب

بواسطة كيفن

هنا هنا

804

الشكل 7.102 - مستويات متعددة من التحكم في التعبير الجيني

ويكيبيديا

805

الشكل 7.103 - جينات بدائية النواة منظمة في أوبرون

ويكيبيديا

الشكل 7.104 - مواقع ربط البروتين في المنطقة التنظيمية لأمريكا اللاتينية والكاريبي

صورة مارثا بيكر

التعلم التفاعلي

وحدة

هنا

806

الشكل 7.105 - هيكل أوبر لاك ومنتجاته

صورة مارثا بيكر

الشكل 7.106 - أوبرون لاك في غياب (وسط) ووجود (أسفل) المحفز

صورة مارثا بيكر

807

الشكل 7.107 - اللاكتوز (أعلى) واللاكتوز (أسفل)

الشكل 7.108 - CAP (أزرق) مرتبط بالحمض النووي المجاور لمروج lac (برتقالي). يظهر المخيم باللون الوردي.

ويكيبيديا

الشكل 7.109 - أوبرون لاك في وجود (أعلى) وغياب (أسفل) الجلوكوز

صورة مارثا بيكر

808

الشكل 7.110 - هيكل وتنظيم مشغل trp

ويكيبيديا

محاضرات يوتيوب

بواسطة كيفن

هنا هنا

809

الشكل 7.111 - التخفيف في تنظيم عملية trp

ويكيبيديا

الشكل 7.112 - تسلسل المنطقة الرائدة لعامل trp

XX AUG AAA GCA AUU UUC GUA CUG AAA GGU UGG UGG CGC ACU UCC UGA -XX

MET LYS ALA ILE PHE VAL LEU LYS GLY TRP TRP ARG THR SER STOP

810

الشكل 7.113 - ميزات Riboswitch

811

الشكل 7.114 - التسلسلات التنظيمية لجين حقيقي النواة

ويكيبيديا

812

الشكل 7.115 - تسمح حلقات الحمض النووي بالاتصال بين المنشط المرتبط بمُحسِّن بعيد ومجمع النسخ القاعدي

صورة مارثا بيكر

813

الشكل 7.116 - عوامل النسخ في تنظيم نسخ حقيقيات النوى

ويكيبيديا

محاضرات يوتيوب

بواسطة كيفن

هنا هنا

814

الشكل 7.117 - ربط بروتين c-myc بتسلسل الحمض النووي المستهدف

ويكيبيديا

الشكل 7.118 يمكن للمنشطات المرتبطة في مواقع متعددة تنظيم النسخ من مروج معين

OpenStax

815

الشكل 7.119 - تنشيط النسخ (يمين) وإلغاء التنشيط (يسار) عن طريق تعديل هيستون

ويكيبيديا

816

الشكل 7.120 - يؤثر تكوين الكروماتين على النسخ

ويكيبيديا

التعلم التفاعلي

وحدة

هنا

817

الشكل 7.121 - تعطيل النسخ بواسطة مثيلة CpG

صورة إنديرا راجاجوبال

محاضرات يوتيوب

بواسطة كيفن

هنا هنا

818

الشكل 7.122 - التغيرات فوق الجينية من خلال تعديل هيستون والحمض النووي

819

الشكل 7.123 - وظيفة miRNAs في تنظيم التعبير الجيني

ويكيبيديا

الشكل 7.124 هياكل دبوس الشعر Pre-miRNA مع دليل miRNAs الناضج الموضحة باللون الأحمر

ويكيبيديا

820

الشكل 7.125 - إسكات الجينات بواسطة siRNA

الصورة بواسطة بير جاكوبسون

821

الشكل 7.126 - مزدوج سيرنا معالج بإقران أساسي مثالي ، فوسفات 5 بوصات وقاعدتان متدليتان في نهاية كل 3 بوصات

822

الشكل 7.127 - تنظيم ترجمة ferritin mRNA

الصورة بواسطة Aleia Kim

محاضرات يوتيوب

بواسطة كيفن

هنا هنا

823

الشكل 7.128 - تنظيم ترجمة mRNA لمستقبل الترانسفيرين

الصورة بواسطة Aleia Kim

كانت الصور الرسومية في هذا الكتاب نتاج عمل العديد من الطلاب الموهوبين. الروابط لصفحات الويب الخاصة بهم أدناه

انقر هنا من أجل

مارثا بيكر

صفحة على الإنترنت

انقر هنا من أجل

بير جاكوبسون

صفحة على الإنترنت

انقر هنا من أجل

أليا كيم

صفحة على الإنترنت

انقر هنا من أجل

بينيلوبي ايرفينغ

صفحة على الإنترنت

مجموعة المشاكل المتعلقة بهذا القسم هنا

ملخص نقطة بنقطة لهذا القسم هنا

للحصول على شهادة إتقان هذا القسم من الكتاب ، انقر هنا

دورات iTunes U المجانية التي يقدمها Kevin Ahern - المدرسة الأساسية / المتوسطة / المتقدمة

كيمياء حيوية مجانية وسهلة (كتابنا الآخر) هنا / صفحة الفيسبوك

دليل كيفن وإنديرا للالتحاق بكلية الطب - كتاب / دورة iTunes U

لمشاهدة دورات نظام التعليم في جامعة ولاية أوهايو الخاصة بـ Kevin Ahern - BB 350 / BB 450 / BB 451

للتسجيل في دورات OSU الخاصة بـ Kevin Ahern - BB 350 / BB 450 / BB 451

الكيمياء الحيوية مجانية للجميع صفحة الفيسبوك (يرجى الإعجاب بنا)

صفحة الويب الخاصة بـ Kevin Ahern / صفحة Facebook / صفحة الويب Taralyn Tan

التنزيلات المجانية لـ Kevin Ahern هنا

برنامج الكيمياء الحيوية / الفيزياء الحيوية بجامعة ولاية أوهايو هنا

كلية العلوم OSU هنا

جامعة ولاية أوريغون هنا

Email Kevin Ahern / Indira Rajagopal / Taralyn Tan

بارك الله في هذه المجمعات

على أنغام "بارك الله في أمريكا"

موقع الأنغام الأيضية هنا

جميع المعلومات بتنسيق

الحمض النووي للخلايا

يزيد فقط

بالقطع

مختلطة ومتطابقة في mRNAs

ربط exons

جميعا

استخدام الشخير في

مجمع- ES

بارك الله في spiceosomes

والمجلدات العابرة

(بطيئة وبصوت عال) بارك الله في spiceosomes

و ge-nome الخاص بي

معلومات مخططك هي

في الحمض النووي

بما أنك في حاجة إليها

تدقيقه

أو ستحوّر mRNA

تستطيع ان تترجم

كل الكودونات

مع جنرال الخلايا

كود et-ic

بارك الله في الريبوسومات

يترجمون الكود

(بطيئة وبصوت عالٍ) بارك الله في الريبوسومات

والبروتينات

تسجيل ديفيد سيمونز

كلمات كيفن أهيرن
تسجيل ديفيد سيمونز كلمات كيفن أهيرن

كتاب الحياة

على أنغام أغنية "The Look of Love"

موقع الأنغام الأيضية هنا

كتاب الحياة - مادة الأحلام

في كل مكان ، على ما يبدو

كتاب الحياة هو الكيمياء الحيوية و

كلماتها تملأ كل يوم

فقط ما يقوله مكتوب في الحمض النووي

أنا فقط أريد التعرف عليه

كيف يتم ترميز المعلومات

ما هي كل الأسرار؟

يمكن للريبوسومات قراءتها

الطيبة تعرف أنها ضرورية

وهكذا الأبجدية

في أشكال الكودون

لديدان الكتب الريبوسوم

قرأوه بشكل صحيح

تتوافق وظيفة البروتين مع تسلسله

إنها ليست مجرد روابط ببتيدية تم إنشاؤها عشوائيًا

يا لها من أعجوبة الخلق ، كيف يترجمون

من سلاسل m-R-N-A ،

باستخدام أجزاء من الجلايسين

البرولين وبعض الليسين

ترجم الكود

مفيدة

أنا فقط مندهش من المعرفة

التي حصلت عليها في الكلية

لتعلم كل الأسرار

مساحات حلزونية مزدوجة

القواعد التكميلية

بيريميدين

يقترن بورينات

كتاب الحياة

التسجيل بواسطة كارول أدريان سميث

كلمات كيفن أهيرن
تسجيل كارول أدريان سميث كلمات كيفن أهيرن


الإسكات الجزئي للتعبير الجيني fucosyltransferase 8 يمنع تكاثر خلايا Ishikawa ، وهي خط خلوي لسرطان بطانة الرحم

يرتفع التعبير الجيني Fucosyltransferase 8 في الأنسجة المصابة بسرطان بطانة الرحم.

تم اكتشاف بروتين Fucosyltransferase 8 على وجه التحديد في الغدد المصابة بسرطان بطانة الرحم.

أدى إسكات إنزيم fucosyltransferase 8 إلى كبح تكاثر خلايا Ishikawa ، وهي خط خلايا سرطان بطانة الرحم.

تشير هذه النتائج إلى أن fucosyltransferase 8 قد يكون متورطًا في انتشار سرطان بطانة الرحم.


خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


المواد والأساليب

ثقافة الخلية والتزامن وإعداد RNA

تم طلاء خلايا HeLa S3 (2 × 10 6 خلايا) في أطباق زراعة الأنسجة 150 مم في DMEM مع 10 ٪ من مصل بقري جنيني و 100 وحدة من البنسلين الستربتومايسين (Invitrogen ، Carlsbad ، CA). تم القبض على الخلايا في المرحلة S باستخدام كتلة ثيميدين مزدوجة أو في الانقسام مع كتلة thymidine-nocodazole بشكل أساسي كما هو موضح سابقًا (Whitfield وآخرون.، 2000) وفي المادة التكميلية. تم تحضير Poly (A) RNA من الخلايا التي تم جمعها على فترات (عادةً 1-2 ساعة) عن طريق تحلل الخلايا مباشرة على اللوحة باستخدام مجموعة عزل FastTrack 2.0 mRNA (Invitrogen). تمت مراقبة التزامن عن طريق تحليل التدفق الخلوي للخلايا الملطخة يوديد البروبيديوم (مرفق ستانفورد المشترك FACS ، كلية الطب بجامعة ستانفورد ، ستانفورد ، كاليفورنيا).

تم جمع الخلايا الانقسامية كل 10 دقائق باستخدام شاكر الخلية الآلي (Eliassen وآخرون.، 1998) ، مخزنة على الجليد ، ومطلية بفواصل زمنية مدتها ساعتان في وسائط جديدة مُدفأة مسبقًا (على الأقل 10 6 خلايا لكل نقطة زمنية). نظرًا لأنه لا يمكن الحصول إلا على عدد صغير من الخلايا عن طريق التخلص الانقسامي ، فقد تم تحضير إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام نظام عزل ULTRASPEC RNA (Biotecx ، Houston ، TX). تم تحديد عدد الخلايا في المرحلة S عند كل نقطة باستخدام مجموعة العلامات والكشف عن 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) (Roche Applied Science ، Indianapolis ، IN).

تم تحضير الحمض النووي الريبي المرجعي من خلايا هيلا النامية بشكل غير متزامن باستخدام TRIzol (Invitrogen) و poly (A) RNA المعزول بواسطة كروماتوجرافيا التقارب على السليلوز oligo-dT (Amersham Biosciences ، Piscataway ، NJ). تم استخدام Poly (A) RNA كمرجع في جميع التجارب باستثناء الهزة الانقسامية ، حيث تم تصنيف إجمالي الحمض النووي الريبي.

توليف (كدنا) وتهجين ميكروأري

تم نسخ الحمض النووي الريبي من الخلايا المتزامنة إلى Cy5-dUTP (Amersham Biosciences) - المسمى cDNA ، ونسخ RNA العكسي إلى Cy3-dUTP (Amersham Biosciences) - cDNA المسمى بالطرق القياسية (Eisen and Brown ، 1999) (التفاصيل متاحة في HTTP : //genome-www.stanford.edu/Human-CellCycle/HeLa/.) إجمالي عينات الحمض النووي الريبي من الخلايا التي تم جمعها في تجربة التخلص الانقسامي ، وتم تضخيم الحمض النووي الريبي المرجعي الإجمالي لأول مرة باستخدام بروتوكول Eberwine المعدل قبل تخليق cDNA (وانج) وآخرون.، 2000) المسمى cDNA من الحمض النووي الريبي المضخم.

المصفوفات الدقيقة cDNA المرقطة ، التي تحتوي على 22،692 عنصرًا تمثل ∼16،332 جينًا بشريًا مختلفًا أو تحتوي على 43،198 عنصرًا يمثلون 29،621 جينًا (تم تقديرها بواسطة مجموعات UNIGENE) ، تم تصنيعها في مرفق Stanford Microarray (http://www.microarray.org). تم تهجين كميات متساوية من cDNA المسمى Cy5 و Cy3 إلى مصفوفات ميكروية cDNA رصدت وتم مسحها ضوئيًا باستخدام ماسح GenePix 4000A (Axon Instruments ، Union City ، CA). البروتوكولات التفصيلية متاحة على http://brownlab.stanford.edu/protocols.html/.

معالجة البيانات

تم استخراج البيانات عن طريق تركيب شبكة فوق كل صفيف باستخدام برنامج GenePix 3.0 (Axon Instruments). تمت إزالة البقع ذات الجودة الرديئة ، التي تم تحديدها عن طريق الفحص البصري ، من التحليل الإضافي. تم تخزين البيانات التي تم جمعها لكل مجموعة في قاعدة بيانات Stanford Microarray (SMD) وهي متاحة من SMD في http://genome-www.stanford.edu/microarray/ (Sherlock et al. ، 2001).

تم تحليل الميزات ذات كثافة الإشارة بنسبة 20 ٪ على الأقل فوق الخلفية في كل من قنوات Cy5 و Cy3 والتي تم الحصول على بيانات جودة مناسبة لها لما لا يقل عن 80 ٪ من العينات في دورة زمنية معينة. نقاط البيانات التي لم تستوف هذه المعايير فارغة في جداول البيانات الأولية. سجل2 تم استرداد (Cy5 / Cy3) لكل نقطة بيانات واستخدامها لجميع التحليلات ، حيث (Cy5 / Cy3) هي النسبة الطبيعية لشدة تصحيح الخلفية ، كما هو محدد في SMD (شيرلوك) وآخرون., 2001).

بسبب الاختلافات المنهجية بين التجارب (على سبيل المثال ، مجموعة المصفوفة ، وطرق وضع العلامات ، وطرق المزامنة) في كل مرة تم تركيز الدورة التدريبية بشكل مستقل عن طريق تصفية eigengene الأول والأكثر أهمية (Alter وآخرون.، 2000) ، والذي كان ناقلًا مسيطرًا وثابتًا. نظرًا لأن تحلل الصمام المفرد (SVD) يتطلب مصفوفة بيانات كاملة ، فقد تم تقدير نقاط البيانات المفقودة باستخدام خوارزمية الجيران الأقرب لـ k (Troyanskaya وآخرون.، 2001) مع k = 12. تم استخدام هذه القيم المنسوبة طوال التحليل ولكن تمت إعادتها إلى حالة "غير معروفة" في الأشكال وتركت فارغة في جداول البيانات الأولية (http://genome-www.stanford.edu/Human) -دورة الخلية / هيلا /).

تحديد النصوص المعبر عنها بشكل دوري

تم تطبيق تحويل فورييه (مكافئ 1-3) على البيانات الخاصة بكل استنساخ في التجربة (Spellman وآخرون.، 1998) ، والمتجه الناتج (ج، مكافئ. 3) من الجيب (أ) وجيب التمام (ب) تم تخزين المعاملات ، حيث تي هي فترة دورة الخلية ، ر هو الوقت بعد الإفراج ،φ هو إزاحة المرحلة ، و نسبة(ر) هي نسبة تعبير Cy5 / Cy3 الطبيعية في الوقت المناسب ر. قيمة ال φ تم تعيينه مبدئيًا إلى 0. القيم التي تم الحصول عليها من أجلج تم تحديدها على مدى 40 قيمة من تيمتباعدة بالتساوي 1 ساعة فوق وتحت فترة دورة الخلية المقدرة والقيم الناتجة في المتوسط ​​والمخزنة.

نظرًا لأن كل تجربة لا تبدأ في نفس النقطة تمامًا في دورة الخلية ، فإن الإزاحة (φ، مكافئ. تم حساب 1 و 2) لكل مجموعة بيانات نسبة إلى أول اعتقال ثيميدين مزدوج. مقادير تحويل فورييه (د، مكافئ. 4) لأعلى 1000 نسخة تم جمعها باستخدام قيم مختلفة لـφ، متباعدة بالتساوي بين 0 و 2π. الإزاحة التي أعطت أعلى متوسط ​​حجم مشترك (د، مكافئ. 4) بين مجموعتي البيانات لهذه الجينات 1000. تم بعد ذلك تكرار تحويل فورييه على مجموعات البيانات المتبقية بالقيم التالية لـ Τ و φ: Thy-Thy 2 (تي = 15.5 ساعة ، φ = 0.5 راد) ، خاصتك 3 (تي = 15.4, φ = 0.0 راد) ، Thy-Noc (تي = 18.5, φ = 3.2 راد) ، والاختيار الانقسامي (تي = 24.5, φ = 3.5 راد). النواقل ج (مكافئ 3) لجميع مجموعات البيانات الخمس ثم تم تصنيف الجينات وفقًا للحجم (D ، مكافئ 4) من نواقلها المجمعة. لاحظ أن تجارب التخلص من Thy-Noc و الانقسامية الانقسامية ، التي توقف الخلايا في الانقسام الفتيلي ، لها إزاحات نصف دورة تقريبًا (π راديان) من Thy-Thy 1 ، والتي توقف الخلايا في G1 / S.

نظرًا لأن ملفات تعريف التعبير الجيني للعديد من جينات دورة الخلية لا تتطابق بدقة مع منحنيات الجيب وجيب التمام ، فقد ارتبط ملف تعريف التعبير لكل جين بموجه مثالي تم الحصول عليه من الجينات المعروفة المعبر عنها في كل مرحلة من مراحل دورة الخلية (G1 / S ، S ، G2 ، و G2 / M) على النحو المحدد في الشكل 2 أ. باستخدام ارتباط Pearson القياسي ، تلقى كل جين درجة ارتباط ذروة مُعرَّفة على أنها أعلى علاقة قيمة مطلقة بين أحد النواقل المثالية الأربعة وملف تعريف التعبير الخاص به (Spellman وآخرون.، 1998). تم استخدام القيمة المطلقة لارتباط الذروة لقياس حجم المتجه (ج، مكافئ. 2) إنشاء "درجة دورية" لكل جين (الجدول 1).

الجدول 1. درجات دورية الجينات المختارة عينة من الدرجات الدورية للجينات المنظمة لدورة الخلية التمثيلية. تم إنشاء قطع الجين المنظم لدورة الخلية من خلال موازنة المعدلات الإيجابية الزائفة والسلبية الكاذبة. استخدمنا حدًا أعطى ما يقدر بنسبة 0.15 - 0.75٪ معدل إيجابي كاذب و 6.5٪ معدل سلبي كاذب ، مما أدى إلى استنساخ 1333. الحد الأقصى لتغيير الطية هو أقصى سعة يتم ملاحظتها في أي من المزامنات الخمسة. متوسط ​​تغيير الطية هو متوسط ​​السعة عبر جميع عمليات المزامنة الخمسة.

لتقدير الحد الأدنى لدرجة دورية لجين منظم لدورة الخلية ، تم تكرار التحليل الموصوف أعلاه على بيانات عشوائية. تم اختيار البيانات بشكل عشوائي إما داخل الصفوف فقط ، أو داخل كل من الصفوف والأعمدة ، لكل مجموعة من مجموعات البيانات الخمس التي تبدأ بالبيانات المحتسبة والمتمحورة حول SVD. تم تطبيق تحويل فورييه والارتباطات باستخدام القيم المحسوبة مسبقًا لـ تي وφ النواقل الناتجة (ج، مكافئ. 3) لكل مجموعة بيانات. الحجم (د، مكافئ. 4) من تحويل فورييه تم قياسه من خلال ارتباط الذروة لكل "جين" بواحد من ملفات تعريف التعبير المثالية الأربعة. تم تكرار هذا التحليل ، بما في ذلك التوزيع العشوائي للبيانات ، 10 مرات وتم تجميع الدرجات من خلال حساب متوسط ​​الدرجة لكل من "الجينات" ذات أعلى الدرجات من كل عشوائية ، متبوعة بالثاني الأعلى ، والثالث الأعلى ، إلخ. المعدل الإيجابي الخاطئ المقدر عند درجة دورية معينة هي عدد الجينات التي تحصل على الأقل على تلك الدرجة في البيانات العشوائية. لقد اخترنا درجة دورية لا تقل عن 3.29 ، مما أعطانا 1333 نسخة بتقدير إيجابي خاطئ أولي بنسبة 1٪ عندما تم توزيع البيانات بشكل عشوائي في صفوف. أعطى تكرار هذا التحليل 10 مرات ما يقدر بـ 10 إيجابيات خاطئة (0.75٪ درجات دورية من 5.18-3.33) عندما كانت البيانات عشوائية فقط داخل الصفوف ، وإيجابيات كاذبة (0.15٪ درجات دورية من 3.72 و 3.30) عندما تم توزيع البيانات عشوائيًا في كلا الصفوف والأعمدة.

من المرجح أن يقلل التقدير الإيجابي الخاطئ ، المحسوب أعلاه ، من المعدل الحقيقي الإيجابي الخاطئ لأنه لا يأخذ في الاعتبار الجينات التي حصلت على درجة فورييه عالية لأنها أظهرت نمطًا جيبيًا في جزء فقط من الدورة الزمنية. لتصفية الجينات التي لا تظهر التعبير الدوري ، تم حساب الارتباطات التلقائية لكل 1333 نسخة (مكافئ 5). الارتباط التلقائيأ يساوي المجموع في جميع الأوقات ر من حاصل ضرب النسبة عند ر مضروبة في النسبة في وقت واحد ر + تي، أين تي هي فترة دورة الخلية التي يحددها تحليل فورييه. إذا تكررت بيانات الجين مع فترة تي، سيكون الارتباط التلقائي مرتفعًا.

تم استخدام الارتباطات التلقائية كمرشح لإزالة الجينات التي أظهرت تعبيرًا عابرًا على الرغم من تلقي درجة دورية عالية. 199 جينة ذات ارتباط ذاتي سلبي (يشير الارتباط الذاتي السلبي إلى أن النسب المقاسة لا تكرر كل دورة خلية) تم استبعادها من المجموعة الأولية للجينات المفترضة المنظمة لدورة الخلية. تم حساب الارتباطات التلقائية أيضًا للبيانات العشوائية في الصفوف ، حيث تلقى عدد قليل من الجينات ارتباطات تلقائية سلبية في البيانات العشوائية ، مما يشير إلى أنه من غير المرجح أن تحدث الدرجات السلبية عن طريق الصدفة. يظهر توزيع درجات الارتباط التلقائي في الشكل التكميلي 16.

تحتوي قائمتنا النهائية على 1134 نسخة مطابقة لـ 874 مجموعة UNIGENE (UNIGENE build 143 ، تم إصداره في 9 نوفمبر 2001 ، 21 نسخة غير موجودة في UNIGENE ، 66 خريطة لأكثر من مجموعة UNIGENE). تتوفر البيانات لجميع المستنسخات البالغ عددها 1134 بالإضافة إلى البيانات الأولية في http://genome-www.stanford.edu/Human-CellCycle/HeLa/.


دور مسارات بروتين كينيز التي تنظم NF-κB و AP-1 في IL-8 TRANSCRIPTION

تقريبًا جميع المحفزات المجهدة والمسببة للالتهابات المعروفة بتحفيز إنتاج IL-8 تنشط عددًا من كينازات البروتين ، والتي تتمتع بشكل أساسي بالقدرة على تعديل نشاط NF-B أو AP-1.

يتم تنظيم خطوة تحديد المعدل في تنشيط NF-B - تحلل البروتين IκB - بواسطة كينازات IκB التي تم تحديدها مؤخرًا (IKKα / β و IKKγ / Nemo) ، والتي تفسفر على وجه التحديد سرينات متجاورة في بروتينات IκB [70]. في المقابل ، فإن المسار (المسارات) الذي ينظم معاملات NF-B ، بدلاً من الانتقال ، أقل تحديدًا [59].

يتم تنشيط AP-1 بواسطة كينازات البروتين المنشط بالميتوجين (MAPK). تساهم ثلاثة مسارات MAPK في التعبير الجيني IL-8 ، وهو بروتين كيناز خارج الخلية المنظم (ERK) ، وبروتين كيناز JUN-N- طرفي (JNK) ، وشلالات p38 MAPK. هناك نوعان من ERK (1 و 2) ، وثلاثة JNK التي يؤدي الربط التفاضلي فيها إلى ظهور 10 أشكال إسوية ، وأربعة أشكال إسوية من p38 MAPK [68 ، 69 ، 71 ، 72]. يتم تنشيط كل منهم عن طريق الفسفرة من خلال كينازات MAPK ثنائية الخصوصية (MKK). يتم تنشيط ERK بواسطة MKK1 أو 2 ، ويتم تنشيط JNK بواسطة MKK7 ، بينما يتم تنشيط p38 MAPK بواسطة MKK3 و 6. بالإضافة إلى أن MKK4 ينشط JNK و p38 MAPK. تتطلب MKK الفسفرة في مجال كيناز الثامن المحفوظ للتنشيط بواسطة كينازات المنبع (انظر أدناه).

استخدمت العديد من المعامل طفرات كيناز غير نشطة ، أو رنا مضاد للتحسس ، أو مثبطات محددة لمنع هذه المسارات على مستويات مختلفة في الخلايا البشرية السليمة لدراسة مساهمتها في التعبير الجيني لـ IL-8 (انظر الجدول 1). لا يُعرف اليوم أي متماثل للفأر لـ IL-8 ، [1] ، مما يمنع تحليل تعبير IL-8 في الفئران التي تعاني من نقص في أي من جزيئات الإشارة هذه. ومع ذلك ، فإن المعلومات الخاصة بتنظيم IL-6 ، وهو سيتوكين يتم تنظيم تعبيره في كثير من النواحي بشكل مشابه جدًا لـ IL-8 [44 ، 59 ، 64] ، متاح من الفئران التي تعاني من نقص في المكونات الفردية للمسارات التي تنشط NF-B و AP -1.

كما هو متوقع من المتطلبات الأساسية لـ NF-B رابطة الدول المستقلة- عنصر لنسخ IL-8 ، تثبيط NF-B بواسطة المسوخات السلبية المهيمنة لـ IKKβ [42] أو IκB [40 ، 41] أو عن طريق مضادات NF-κB [37 38 39] يضعف بشدة IL-1- و TNF - التعبير النصي الناجم عن IL-8 (انظر أيضًا الجدول 1). تماشياً مع أهمية NF-B للتعبير الجيني الالتهابي ، يتم فقدان تعبير IL-6 المحرض في الفئران التي تعاني من نقص IKKβ و IKKγ [73 ، 74].

مقارنةً بـ NF-κB ، لم يتم استكشاف دور JNK في تنظيم IL-8 على نطاق واسع. ومع ذلك ، يتم تنشيط JNK ، مثل NF-B ، بقوة في ظل معظم الظروف التي تحفز IL-8. الملاحظة التي تفيد بأن JNK ضرورية في الواقع لتعبير IL-8 (و IL-6) تم إجراؤه في البداية في الخلايا الظهارية البشرية عن طريق منع تنشيط JNK عن طريق التعبير المستقر عن RNA المضاد أو بواسطة طفرات سالبة سلبية [44]. كان تثبيط JNK محددًا ولم يؤثر على تنشيط NF-B أو p38 MAPK [44]. تم تأكيد المطلب المطلق لـ JNK للتعبير IL-6 لاحقًا في JNK2 - / - الخلايا الليفية [73]. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير مثبط تنافسي عكسي ATP ، وهو anthrapyrazolone SP600125 ، والذي يثبط بشكل تفضيلي JNK في المختبر (Ki 0.19μM) وبتركيزات أعلى من 5 ميكرومتر في الجسم الحي. ومع ذلك ، عند تركيزات أعلى (50 ميكرومتر) ، فإنه يمنع أيضًا p38 MAPK [75]. على عكس النتائج المذكورة أعلاه ، لم يكن للمثبط أي تأثير على تعبير IL-8 في الخلايا الوحيدة البشرية المحفزة لعديد السكاريد الدهني (LPS) [75]. لذلك ، يبقى أن نرى ما إذا كان يؤثر على تعبير IL-8 في الأنظمة الأخرى.

JNK هي كينازات c-JUN الوحيدة التي تم تحديدها حتى الآن. لذلك ، يُعتقد عمومًا أنها تنشط الجينات الالتهابية عبر c-JUN و AP-1 رابطة الدول المستقلة- العنصر [76 ، 77]. ومع ذلك ، فإن التعبير الفيروسي الغدي للطفرة السلبية السائدة لـ c-JUN ، حيث تم حذف مجال المعاملات ، فشل في تثبيط تحريض IL-8 في تقرير واحد [40] ، ولكن هذا المتحور أثر بالفعل على تعبير IL-8 في دراسة أخرى [ 46]. تتوافق هذه النتائج مع المساهمة المتغيرة المعروفة لموقع AP-1 في نسخ IL-8 وقد تشير إلى دور أقل أهمية لـ c-JUN في تنظيم IL-8 في بعض الظروف [57].

مجتمعة ، تشير البيانات المتاحة إلى أن مسارات NF-B و JNK لا غنى عنها لتنظيم IL-8 المحرض. يؤدي حصار أحد المسارات في وجود التنشيط الطبيعي للطريق الآخر إلى تقليل إفراز الإنترلوكين -8 بشكل كبير. لتوضيح المساهمة الفردية لـ NF-B و JNK (وكذلك p38 انظر أدناه) ، تم تنشيطها في غياب التحفيز خارج الخلية. تم تحقيق ذلك من خلال التعبير العابر عن طفرات بروتين كيناز النشطة بشكل أساسي. على الرغم من أن هذا النهج غير فسيولوجي ، إلا أنه يسمح بالتنشيط الانتقائي للمسارات الفردية وحدها أو مجتمعة. MKK7 ​​النشط التأسيسي ، وهو منشط محدد لمسار JNK ، أو كيناز NF-κB (NIK) ، وهو منشط محدد في المنبع لـ NF-B ، تسبب في تخليق ونسخ IL-8 منخفض من مروج IL-8 ضئيل [13] . ومع ذلك ، فإن MKK7 متآزرة في كلا التأثيرين مع NIK. يتطلب تنشيط المروج IL-8 بواسطة أي من الكينازات مواقع NF-B و AP-1 الوظيفية [13].

ما هي أهمية تعاون المسار هذا؟ ال رابطة الدول المستقلة- توجد عناصر NF-B و AP-1 وعوامل النسخ الأخرى على مقربة من أقل من 200 زوج أساسي من مروج IL-8 (المراجع [45 ، 57] والشكل 2). يشير هذا إلى تكوين مجمعات بروتين نووي أعلى رتبة. تم تحليل مثل هذا المركب المعقد ، الذي يُطلق عليه اسم التعزيز النسخي ، بالتفصيل من أجل مضاد للفيروسات السيتوكين interferon (IFN)-[78 ، 79]. الغرض من المعززات هو توفير سطح متعدد البروتينات يجعل الاتصال الأمثل مع بروتينات آلية النسخ القاعدية وبالتالي يسهل النسخ الجيني الأقصى [80]. يتم تمكين الاتصالات بين البروتينات أو تحسينها عن طريق التعديلات اللاحقة للترجمة ، أو إعادة تشكيل الكروماتين عبر أستلة هيستون أو فسفرة هيستون [81] ، أو بروتينات مُحفِّزة كبيرة مثل p300 / CBP [82]. هذا الأخير يوفر منصات متعددة القوائم ويمتلك أنشطة أسيتيل ترانسفيراز جوهرية [83].

في الواقع ، تشير الملاحظات الحديثة إلى أن الهياكل الشبيهة بالجسم تعدل تعبير IL-8. يعزز CBP / p300 نسخ IL-8 بوساطة p65 بطريقة تعتمد على الأستلة [64] ، بينما يؤثر HDAC-1 سلبًا على نشاط محفز IL-8 [61]. باستخدام تقنية الترسيب المناعي للكروماتين ، تم مؤخرًا إثبات ارتباط p65 NF-B وتكوين مركب مسبق محفز لعامل TNF في محفز IL-8 يحتوي على RNA polymerase II المفسفر بشكل محرض [84].


البروتين النووي NRF مطلوب من أجل النسخ الأساسي وغير القابل للإصلاح IL-8

الاستنتاج القائل بأن نسخ IL-8 ينظمه مركب متعدد البروتينات يدعمه أيضًا التحديد الأخير للمستجيب للإشارة رابطة الدول المستقلة-العنصر الذي يتداخل مع موقع الربط NF- B.

تعبير IL-8 منخفض في الخلايا غير المحفزة. هذا جزئيا نتيجة لقمع النسخ من المروج. من خلال مقارنة التسلسل مع مروج IFN-، تم العثور على عنصر تنظيمي سلبي (NRE) في مروج IL-8 متداخلاً جزئيًا مع عنصر استجابة NF-B [85]. يرتبط عامل تثبيط NF-κB (NRF) بعنصر محفز IL-8 NF-κB-NRE [45 ، 86]. يؤدي تقليل NRF الخلوي عن طريق التعبير عن RNA المضاد لـ NRF إلى التعبير الجيني العفوي لـ IL-8. في المقابل ، يتأثر إفراز IL-8 الناجم عن IL-1 بشدة عن طريق التعبير عن NRF-antisense RNA. يؤدي تحور موقع NRE إلى فقدان ارتباط NRF وزيادة نسخ IL-8 القاعدية. على العكس من ذلك ، يتم تقليل نسخ IL-8 الناجم عن IL-1 عن طريق تحور عنصر NRE. توفر هذه البيانات دليلاً على الدور المزدوج لـ NRF في نسخ IL-8. على الرغم من أنه في غياب التحفيز ، فإنه يشارك في إسكات النسخ ، في الخلايا التي يسببها IL-1 ، وهو مطلوب للتحريض الكامل لمحفز IL-8 [45].

تظل الآلية التي يساهم بها NRF في تنشيط محفز IL-8 الناجم عن IL-1 بعيدة المنال. لم يؤدي الإفراط في التعبير عن NRF وحده إلى تعزيز نسخ IL-8 بوساطة NF-κB. ومع ذلك ، عندما تم التعبير عن p65 NF-B مع JNK النووي النشط ، عززت NRF نسخ IL-8 بشكل إضافي. تشير هذه النتائج إلى أن NRF يتم تعديله من خلال آلية تعتمد على JNK أو أنه يتفاعل مع مروج IL-8 مع عامل (عوامل) النسخ المنشط للكيناز. يتطلب تعاون NRF ليس فقط موقع NRE سليمًا ولكن أيضًا ربط بروتينات NF-κB و AP-1 بها. رابطة الدول المستقلة- العناصر [45]. يشير هذا إلى أن ارتباط عوامل النسخ الثلاثة بمواقع ارتباط الحمض النووي الخاصة بها وتفاعلها المادي ضروري لتحقيق أقصى قدر من التحريض لمحفز IL-8. تتداخل NRE مع موقع NF-B ، وقد ظهر بالفعل أن NRF قادرة على التفاعل مباشرة مع أفراد عائلة rel [86]. يتم تعديل NF-κB بواسطة كينازات البروتين [87 88 89] ، ويتفاعل مع البروتينات المختلفة التي تعزز نشاط النسخ [63 ، 90 91 92] ، والاتصالات من خلال مكونات الطرف C لآلية النسخ القاعدية [93]. وبالتالي ، فمن الممكن أنه في الخلايا المحفزة بـ IL-1 ، تعزز NRF نشاط NF-B بالتنسيق مع AP-1 من خلال العمل على واحدة أو أكثر من هذه الآليات. يتم حفظ مزيج مواقع NF-κB و NRE في مجموعة متنوعة من الجينات ذات الصلة بالالتهاب [85 ، 86 ، 94]. لا يتداخل عنصر NRE مع موقع NF-B في جميع الحالات. ومع ذلك ، فقد تبين سابقًا أن التأثير المثبط لـ NRE على عناصر NF- B المختلفة يتم عرضه على مسافات تصل إلى 2.5 كيلو بايت [86]. وبالتالي ، من المغري التكهن بأن NRF يشكل عامل نسخ رئيسي ، مما يمنع التعبير غير المنضبط للبروتينات المسببة للالتهابات ويساهم في تركيبها الفعال أثناء المرض.

تم وصف آلية أخرى لقمع جين IL-8 سابقًا [67]. في هذا النموذج ، يتم إحداث نسخ محفز IL-8 عن طريق استبدال المثبط OCT-1 بـ NF-B و C / EBP كنتيجة لتحفيز IL-1 [67]. على عكس هذه الآلية التنافسية ، يقوم NRF بقمع مروج IL-8 ، على الأرجح بواسطة آلية غير تنافسية ، حيث لا يتم استبداله بـ NF-B بعد التحفيز بواسطة IL-1 (الشكل 2) ، وكما هو موضح أعلاه ، فإنه يتغير وظيفتها ومطلوبة للنشاط المروج الأقصى أثناء التحفيز.

كما تم تلخيصه في الشكل 2 ، يتم التوفيق بين هذه النتائج بشكل أفضل مع نموذج ، حيث يتم قمع نسخ IL-8 بشكل فعال في الخلايا غير المحفزة من خلال مجموعة من ثلاث آليات تتضمن نزع استيل الهستونات [61 ، 95] ، ربط OCT-1 [67] ، والقمع النشط من قبل جبهة الخلاص الوطني [45].

يتطلب تحريض نسخ IL-8 القوي بواسطة السيتوكينات IL-1 و TNF تعزيزًا نشطًا لتشكيل بنية شبيهة بالمعزز في المروج من خلال إشارتين على الأقل ، إحداهما يتم توفيرها عن طريق الانتقال النووي لـ NF- B والأخرى عن طريق تنشيط مسار JNK. من المفترض ، من خلال هذه المسارات ، أن المحسنات تدمج إشارات خارجية مختلفة عن طريق استخدام اندماجي لمجموعة محدودة من المنشطات ، وبالتالي فهي قادرة على تنظيم حجم نسخ الجين IL-8 (انظر الشكل 4). يتطلب مزيد من التبصر في هذه الآلية تحديد جميع البروتينات المعنية ، بما في ذلك هدف (أهداف) JNK.

التحكم الكمي في تخليق IL-8 من خلال تعاون ثلاثة مسارات إشارات على الأقل. عمليا لا يوجد تخليق IL-8 يمكن اكتشافه في معظم الخلايا أو الأنسجة نتيجة لقمع النسخ وزعزعة استقرار mRNA الخاص به. يعد تنشيط NF-κB وحده ضروريًا لنسخ جين IL-8 ولكن مثل تنشيط JNK ، ينتج عنه فقط إفراز منخفض لـ IL-8. يؤدي تنشيط NF-B و JNK (و ERK أو مسارات أخرى؟) إلى تخليق وإفراز IL-8 mRNA المعتدل. عندما يتم توفير إشارة ثالثة من مسار p38 MAPK ، يتم تثبيت الحمض النووي الريبي المنسوخ بسرعة ، ويتم إنتاج كميات كبيرة من البروتين [13].


7.8: التعبير الجيني - علم الأحياء

أنا أسئلة تاريخية

II.1 سلاسل الضوء (كابا أو لامدا)

II.1.1 سلسلة كابا: إعادة ترتيب VJ
II.1.2 سلسلة Lambda: إعادة ترتيب VJ
II.1.3 استبعاد الأليل والنمط المتماثل

2.2.1 إعادة ترتيب V-D-J
2.2.2 تبديل النمط المتماثل

II.3 غشاء و Igs المفرز

III.1. تنوع السلالة الجرثومية: عائلات متعددة الجينات
III.2. التنوع بسبب إعادة ترتيب الحمض النووي
ثالثا -3. التنوع نتيجة فرط الطفرات الجسدية

يتكون الغلوبولين المناعي (Ig) من سلسلتين خفيفتين متطابقتين (L) وسلاسل ثقيلة متطابقة (H) (على سبيل المثال من النوع IgG) على المستوى ثلاثي الأبعاد ، وتتكون سلسلة Ig من مجال متغير N- طرفي واحد ، V ، وواحد (لسلسلة L) أو عدة (لسلسلة H) مجال (مجالات) ثابت C للطرف C ، C.

تصنع خلايا الخط B الغلوبولين المناعي. يتم إنتاجها إما في غشاء (على سطح الخلايا الليمفاوية B) أو يتم إفرازها (بواسطة الخلايا البلازمية).

بمجرد اكتشاف الخصائص الرئيسية للجلوبيولين المناعي ، ظهر عدد من الأسئلة:

II.1. السلاسل الخفيفة (كابا أو لامدا)

1.1.1. سلسلة كابا: إعادة ترتيب VJ

ملاحظة: تخضع فقط الجينات الخاصة بالجلوبيولينات المناعية ومستقبلات T لإعادة ترتيب الحمض النووي.

يتبع كل جين IGKV في اتجاه مجرى النهر (في الموضع 3 ') بواسطة RS تتكون من CACAGTG heptamer ، ثم بفاصل 12-bp ، ثم ACAAAAACC nonamer.

يسبق كل جين IGKJ المنبع (في الموضع 5) بواسطة RS تتكون ، بين 5 'و 3' ، من nonamer GGTTTTTGT ، فاصل 23 bp و CACTGTG heptamer.

II.1.2. سلسلة Lambda: إعادة ترتيب VJ

II.1.3. استبعاد الأليل والنمط المتماثل

II.3. غشاء و Igs المفرز

III.1. تنوع السلالة الجرثومية: عائلات متعددة الجينات

III.2. التنوع بسبب إعادة ترتيب الحمض النووي

ثالثا -3: التنوع نتيجة فرط الطفرات الجسدية

أخيرًا ، الطفرات الجسدية عديدة للغاية (الطفرات الجسدية المفرطة) وتنتج توصيفًا مستهدفًا للغاية للجينات VJ و V-D-J المعاد ترتيبها من Ig ، لكن آلية ظهورها لم تُعرف بعد. قد يكون AID (ديميناز السيتيدين الناجم عن التنشيط) متورطًا في حدوث الطفرات وآلية التبديل. تظهر الطفرات أثناء تمايز الخلايا الليمفاوية B في الغدد الليمفاوية وتساهم في زيادة تنوع Igs بعامل إضافي قدره 10 3 ، مما يجعل من الممكن تحقيق تنوع محتمل يبلغ 10 12 Igs (الإجابة على السؤال أ) ).

تتيح آليات التنوع المختلفة هذه الحصول على 10 12 غلوبولين مناعيًا مختلفًا ، قادرًا على الاستجابة لعدة ملايين من المستضدات المعروفة (الإجابة على السؤال أ).

في الواقع ، يقتصر عدد Igs المختلفة على عدد الخلايا البائية في نوع معين.


أنماط التعبير الجيني في سرطان الكبد البشري

سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو سبب رئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم. باستخدام المصفوفات الدقيقة (كدنا) لتوصيف أنماط التعبير الجيني في سرطان الكبد (HCC) ، وجدنا اختلافات ثابتة بين أنماط التعبير في سرطان الكبد مقارنةً بتلك التي تظهر في أنسجة الكبد غير السرطانية. تم تمييز أنماط التعبير في سرطان الكبد أيضًا بسهولة عن تلك المرتبطة بالأورام المنتقلة إلى الكبد. كانت أنماط التعبير الجيني العالمية المتأصلة في كل ورم مميزة بشكل كافٍ بحيث يمكن عادةً التعرف على عقيدات الورم المتعددة من نفس المريض وتمييزها عن غيرها في مجموعة العينات الكبيرة على أساس أنماط التعبير الجيني الخاصة بها وحدها. تعد أنماط التعبير الجيني المميزة من سمات الأورام وليس المريض ، لم تكن برامج التعبير التي شوهدت في عقيدات الورم المستقلة نسليًا في نفس المريض أكثر تشابهًا من تلك الموجودة في الأورام من مرضى مختلفين. علاوة على ذلك ، تميزت أيضًا كتل الورم المرتبطة بالنسخة والتي أظهرت ملامح تعبير مميزة باختلافات النمط الجيني. ارتبطت بعض سمات أنماط التعبير الجيني بخصائص نمطية وراثية محددة للأورام ، بما في ذلك معدل النمو ، والغزو الوعائي ، والإفراط في التعبير عن البروتين p53.


أساليب

تحليل أصل النص.

لتحديد المصدر الخلوي للجينات المعبر عنها تفاضليًا في ملفات تعريف النسخ على مستوى الجينوم ، حددنا درجة تشخيص نوع الخلية ، سcg، تحديد المدى الذي يتم فيه نسخ كل جين فردي (مفهرسة ز = 1 إلى جي, ز يتم التعبير عن 22،283 نسخة جينية بشرية تم فحصها بواسطة مصفوفة ميكروأري Affymetrix U133A) في الغالب بواسطة كل نوع من خلايا كريات الدم البيضاء الرئيسية (مفهرسة ج = 1 إلى ج, ج). البيانات المرجعية عن التعبير الأساسي لجميع الجينات البشرية المسماة في مجموعات فرعية مميزة من الكريات البيض تأتي من أطلس الجينات البشرية المتاح للجمهور [Gene Expression Omnibus (GEO) series GSE1133 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/query /acc.cgi؟acc=GSE1133] (18). سcg يحدد المستوى المتوسط ​​للجين زتعبير في نوع الخلية ج (يشار إليه) باعتباره أ ض- النتيجة المحسوبة بالنسبة للمتوسط ​​و SD لمتوسط ​​مستوى التعبير للجين نفسه عبر جميع أنواع الخلايا الأخرى [باستثناء نوع الخلية ج (بمعنى آخر.، أنا = 1 إلى ج, أنا ≠ ج)]: أين يقصد و sd تمثل المتوسط ​​و SD المحسوبة على أنواع الخلايا المفهرسة (48). نوع الخلية الهدف ج يستثنى من حساب المتوسط ​​المرجعي و SD لأنه في الحالات التي يكون فيها الجين ز يتم التعبير عنها في الغالب في نوع خلية واحدة (أي أنها تشخيصية للغاية) ، فإن إدراج هذا النوع من الخلايا في التوزيع المرجعي من شأنه أن يؤدي إلى حدوث انعطاف إيجابي شديد يؤدي إلى تضخيم كل من المتوسط ​​المرجعي و SD (48). لاكتشاف النصوص التشخيصية لنوع الخلية بشكل أكثر كفاءة ، تركز هذه النتيجة على الاختلافات في متوسط ​​مستوى التعبير عبر أنواع الخلايا وتستبعد عمدًا المعلومات حول التباين في التعبير داخل أنواع الخلايا (49).

بالنظر إلى أي مجموعة تعسفية من الجينات المعبر عنها تفاضليًا ، يمكن حساب متوسط ​​درجة التشخيص لتلك الجينات لكل نوع خلية محتمل المنشأ واختبارها لارتفاع ذي دلالة إحصائية أعلى من متوسط ​​درجة السكان لهذا النوع من الخلايا عبر جميع الجينات البشرية (على سبيل المثال ، باستخدام واحد -عينة ر اختبار) (48). يستوعب هذا حقيقة أن متوسط ​​درجات التشخيص للسكان تختلف باختلاف أنواع الخلايا (49) وحقيقة أن المجموعة الإجمالية من الجينات المقايسة تقترب من الجينوم البشري بأكمله (أي أن متوسط ​​عدد السكان وتباين درجات التشخيص معروفان أساسًا ولا يلزم تقديرهما من مجموعة فرعية أصغر بكثير وربما غير تمثيلية من الجينات المعبر عنها تفاضليًا). توفر درجات تشخيص متوسط ​​العينة مقياسًا أحادي القطب لمدى تميز مجموعة الجينات العينة بشكل فريد لنوع خلية معين ، مع وجود قيم سلبية تشير إلى عدم التشخيص (أي لا يتم التعبير عنها غالبًا بواسطة هذا النوع من الخلايا وحده). الدرجات السلبية غير احتمالية ، وبالتالي تركز الاختبارات الإحصائية على الأهمية الإحصائية أحادية الطرف للدرجات الإيجابية العالية (أي مدى التعبير عن النصوص المرصودة بشكل مميز بنوع خلية معين). لا توفر درجات التشخيص السلبي معلومات حول الأصل الخلوي للجينات الخاضعة للتنظيم. يتم تحديد الأصل الخلوي للنصوص الخاضعة للتنظيم من خلال درجات التشخيص الإيجابية المهمة المحسوبة على مجموعة الجينات الخاضعة للتنظيم.

دراسات التحقق من الصحة.

تم اختبار تحليل أصل النص من أجل الدقة التجريبية في خمس مجموعات بيانات التنميط النسخي المستقلة التي تتضمن مجموعات فرعية معزولة من الكريات البيض البشرية. تم تقييم حيدات CD14 + للتعبير الجيني التفاضلي بعد التحفيز باستخدام LPS + IFN-γ أو IL-4 باستخدام صفيف Affymetrix U133A عالي الكثافة قليل النوكليوتيد (GEO رقم الانضمام GSE5099) (50). تم مسح الخلايا التغصنية البلازمية BDCA4 + للتعبير الجيني التفاضلي بالنسبة للخلايا الوحيدة باستخدام مصفوفات أليغنوكليوتيد Affymetrix U133A عالية الكثافة (GEO رقم الانضمام GSE11943) (51). تمت زراعة خلايا CD16 + / CD56 + NK في الوسط وحده أو تم تحفيزها باستخدام IL-2 + IL-15 قبل التنميط النسخي بواسطة Amersham CodeLink Human 20K I رصدت صفائف cDNA (انضمام GEO رقم GSE1511) (52). تعرضت الخلايا الليمفاوية CD3 + T التي تم تنشيطها بالأجسام المضادة لـ CD3 + CD28 للنوربينفرين أو السيارة قبل التنميط النسخي بواسطة مصفوفات أليغنوكليوتيد عالية الكثافة من Affymetrix HuGene FL (53). خضعت خطوط الخلايا اللمفاوية البائية إلى التنميط الجيني للتعبير الجيني بواسطة مصفوفات أليغنوكليوتيد عالية الكثافة من Affymetrix U133A 2.0 بعد الزرع في غياب أو وجود عامل النسخ الفيروسي Epstein-Barr النووي 2 (GEO access no. GSE4525) (54). في جميع الدراسات ، تم تحسين عتبات التعبير الجيني التفاضلي للحفاظ على قيم FDRs 10 ٪ (55) وتم وضع قيم تعبير Affymetrix عند 100 لقمع تقديرات تغيير الطية الزائفة (53). في كل مجموعة بيانات ، تم حساب درجات التشخيص لكل نوع خلية وأخذ الأصل الخلوي المتوقع كنوع خلية يظهر أعلى درجة من الأهمية الإحصائية (أدنى ص القيمة). تم تقييم موثوقية درجات تشخيص النسخ من خلال الارتباطات النصفية المحسوبة على أقسام عشوائية من العينات في كل مجموعة بيانات.

دراسات الاكتشاف.

سبق ذكر خصائص عينة الدراسة ومنهجية القياس (4). باختصار ، تم إجراء التنميط النسخي على مستوى الجينوم في الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) المعزولة بواسطة الطرد المركزي المتدرج لكثافة Ficoll القياسي لـ 10 مل من الدم الكامل من 14 مشاركًا في Chicago Health ، Aging ، and Social Relations Study (CHASRS) ، 6 من الذين سجلوا باستمرار في أعلى 15٪ من مقياس UCLA للوحدة (56) توزيع نقاط على 4 سنوات السابقة (وحيد بشكل مزمن) و 8 أفراد مطابقين للعمر والجنس والعرق الذين سجلوا باستمرار في أدنى 15٪ (غير عادي). تم قياس الاتصال الاجتماعي الموضوعي بواسطة SNI (19). تم إجراء التنميط الجيني للتعبير الجيني على إجمالي RNA من 10 7 PBMCs باستخدام صفيف Affymetrix U133A عالي الكثافة قليل النوكليوتيد في UCLA DNA Microarray Core. تم تحديد وفرة النسخ ذات المستوى المنخفض بواسطة Robust Multiarray Averaging (57) ، وتم تحديد النصوص المعبر عنها تفاضليًا بفارق 30 ٪ في متوسط ​​مستوى التعبير في العينات من الأفراد المنخفضي مقابل الأشخاص الوحيدين (المقابلة لـ 10 ٪ FDR) ، كما هو مقدر في تحليل نموذج خطي عام للسجل2- بيانات التعبير المحولة (55). من بين إجمالي 22283 نسخة من mRNA التي تم تحليلها ، تم تنظيم 78 في الأفراد الوحيدين بشكل مزمن و 131 تم تنظيمهم لأسفل (4).

دراسات التأكيد.

تم الحصول على ملفات تعريف نسخ على مستوى الجينوم على عينات PBMC من جميع المشاركين الـ 93 في CHASRS الذين قدموا عينات الكريات البيض في عام الدراسة 8. تم التعرف على الوحدة المزمنة من خلال مقياس الوحدة UCLA 41 (أعلى 25٪) في 3 سنوات أو أكثر من الدراسة الأولى 5 سنوات ، وتم قياس العزلة الاجتماعية الموضوعية من خلال متوسط ​​درجة SNI خلال نفس الفترة. تم إجراء التنميط الجيني للتعبير الجيني على إجمالي RNA من 10 7 PBMCs مفصولة عن Ficoll باستخدام Illumina Human Ref 8 v3.0 BeadArrays في المختبر الأساسي UCLA Southern California Genotyping Consortium باتباع البروتوكول القياسي للشركة المصنعة. تم تطبيع قيم وفرة النسخ لـ 18،630 جينًا تم فحصها كميا (57) ، وتم تحديد الجينات المعبر عنها تفاضليًا بفارق 15 ٪ في متوسط ​​مستوى التعبير في العينات المأخوذة من الأفراد الذين يعانون من العزلة العالية مقارنةً ببقية العينة (المقابلة لـ 5). ٪ FDR) ، وفقًا لتقدير تحليل نموذج خطي عام للسجل2- قيم التعبير المحولة التي تتحكم في العمر والعرق والجنس والحالة الاجتماعية (سجل) دخل الأسرة مؤشر كتلة الجسم والتكوين الجزئي للخلايا المحببة والوحيدات والخلايا الليمفاوية داخل تجمع الكريات البيض المقايسة (عدد خلايا الدم الكامل الذي يتم إجراؤه في مختبرات مركز جامعة شيكاغو الطبي) و ، حيثما تمت الإشارة إليه ، درجات SNI (الموحدة). أظهرت التحليلات الإضافية عدم وجود فرق كبير في انتشار التدخين واستهلاك الكحول أو تعاطي المخدرات لدى الأفراد الذين يعانون من الوحدة المزمنة مقارنة ببقية العينة. يتم إيداع البيانات على أنها رقم انضمام إلى جيو. GSE25837.


أساليب

الفئران والطفيليات

تم استخدام فئران C57BL / 6 و CBA من الإناث بعمر ستة إلى ثمانية أسابيع. L. مكسيكانا (سلالة MNYC / BZ / 62 / M379) تم تربيتها بروماستيجوتيس في المختبر في وسط شبه محدد / 10٪ مصل جنيني معطل بالحرارة (hiFCS) / 1٪ بنسلين-ستربتومايسين (SDM كامل) عند 26 درجة مئوية. تمت تربية Amastigotes محوريًا عند 34 درجة مئوية في وسط Drosophila الخاص بشنايدر (Gibco BLR) مع 20 ٪ hiFCS و 3.9 جم / لتر 2- (N-morpholino) حمض إيثان سلفونيك (Sigma ، المملكة المتحدة). تمت تربية الطفيليات المعدلة وراثيا في نفس الظروف مع إضافة 20 ميكروغرام / مل من بوروميسين (سيجما ، المملكة المتحدة).

زراعة الخلايا

تم تمرير خط خلية البلاعم الفأري J774 في DMEM الذي يحتوي على 10٪ hiFCS / 1٪ بنسلين-ستربتومايسين / 1٪ L- جلوتامين وتم تربيته عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO.2.

بناء تعبير الليشمانيا ل باء الملايو ALTs

تم تصميم الاشعال لتضخيم منطقة الترميز بأكملها من بديل 1 و بديل 2 من باء الملايو مكتبة L3 [كدنا]. تستخدم oligonucleotides ل بديل 1 كانت 5'-CCGCTCGAGATGAACAAATTGCTAATAGCA-3 '(بمعنى ، بدء الكودون بالخط العريض) و 5'-TGCTCTAGATTACGAGCATTGCCAACTTTC-3 '(مضاد المعنى ، كودون الإنهاء بالخط العريض) وللحصول على بديل 2، 5'-CCGCTCGAGATGAATAAACTTTAATAGCA-3 '(بمعنى) و 5'-TGCTCTAGACتاتGCGCATT GCCAACCTGC-3 '(مضاد المعنى). بعد خطوة تمسخ أولية عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، تم تدوير PCR بين 94 و 55 و 72 درجة مئوية (دقيقة واحدة لكل منهما) لمدة 35 جولة ، تليها جولة واحدة عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تم هضم الشظايا مع XhoI و XbaI واستنساخه في متجه pSSU (13) ، مما أسفر عن pSSU-بديل 1 و pSSU-بديل 2. تم استنساخ تسلسل كامل على كلا الخيوط. تم استخراج الحمض النووي من pSSU-بديل 1 و pSSU-بديل 2 باستخدام مجموعة Qiagen Miniprep باتباع إرشادات الشركة المصنعة

الطفرات موقع الموجه

ALT-2 تم إنشاء متحولة ، حيث تم حذف المجال الحمضي للبروتين (الأحماض الأمينية 24-49) ، باستخدام مجموعة الطفرات الموجهة من الموقع المستندة إلى Exite PCR (Stratagene ، الولايات المتحدة الأمريكية) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. ال pSSU-بديل 2 تم استخدام الإنشاء (انظر أعلاه) كقالب في تفاعل PCR يحتوي على اثنين من قليل النيوكليوتيدات: 5'-TGATTCTGATACACACGGGAGTGT-3 '(مضاد تحسس ، تمهيدي فسفرة) و 5'-TATGTAACCAAAGGGAATTTGTT-3' (بمعنى). كانت معلمات ركوب الدراجات على النحو التالي: دورة واحدة من دقيقة واحدة عند 94 درجة مئوية ، و 4 دقائق عند 53 درجة مئوية ودقيقتين عند 72 درجة مئوية تليها 10 دورات من دقيقة واحدة عند 94 درجة مئوية ، ودقيقتين عند 55 درجة مئوية (إضافة 10 ثوانٍ بعد كل دورة) ودقيقة واحدة عند 72 درجة مئوية ودورة نهائية مدتها 5 دقائق عند 72 درجة مئوية. بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تم هضم البلازميدات الأبوية غير المطفرة Dpn انزيم التقييد. ثم تم صقل الحمض النووي الخطي غير المهضوم باستخدام Pfu بوليميريز DNA و ligated عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع T4 DNA ligase. ثم تم تحويل الحمض النووي المرتبط إلى بكتريا قولونية، مما أسفر عن بناء pSSU-ADD (تم حذف المجال الحمضي). تم تسلسل الإدخال للتحقق من أن الطفرة المقصودة تم إنشاؤها بشكل صحيح.

تعداءالليشمانيا

تم إلكتروستيجوتات المرحلة اللوغاريتمية (4 × 10 7) بـ 10 ميكروغرام من PmeI شظايا خطية من أي من pSSU-بديل 1، pSSU-بديل 2 أو pSSU-يضيف. تم اختيار الحيوانات المستنسخة على 24 طبقًا جيدًا في SDM الكامل مع 20 ميكروغرام / مل من بوروميسين وتم نشرها في حجم مزرعة يبلغ 10 مل.

تألق مناعي

تم غسل Promastigotes في PBS ، وتثبيته في 2 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة ، وإخمادها في NH4Cl لمدة 10 دقائق. تم تحضين الطفيليات من النوع البري بمحلول مخفف (0.1٪ سابونين ، 2٪ مصل ماعز) في وجود مضاداتإل. مكسيكانا مصل الأرانب أو مصل الفأر المضاد لـ ALT (من C57BL / 6 الفئران) لمدة 45 دقيقة. بعد 3 غسلات بمحلول غسيل (0.1٪ سابونين ، PBS) تم تحضين الطفيليات إما بجسم مضاد للأرنب FITC أو مضاد ثانوي لـ FITC (DAKO ، الدنمارك) لمدة 45 دقيقة. ثم تم غسلها ثلاث مرات قبل تركيبها باستخدام Cityfluor (Cityfluor Ltd ، المملكة المتحدة) للفحص المجهري.

التدفق الخلوي

تم غسل Promastigotes في PBS ، وتعليقه عند 1 × 10 6 / مل وتم تثبيته بدون نفاذية في 2 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. بعد غسلين في برنامج تلفزيوني ، 10٪ FCS (غسل FACS) ، تلطخت الطفيليات بجسم مضاد لـ ALT-1 أو مصل فأر عادي مخفف في غسل FACS. تبع ذلك حضانة مع جسم مضاد ثانوي مضاد للفأر FITC (DAKO ، الدنمارك). تم إجراء تحليل التدفق الخلوي باستخدام FACScan (Becton Dickinson) وتحليله باستخدام برنامج CellQuest 3.1.

تحضير الضامة المشتقة من نخاع العظم (BMM)

تم الحصول على BMM من عظام الفخذ والساق من فئران CBA عمرها من 6 إلى 8 أسابيع عن طريق غسل العظام باستخدام DMEM (Gibco ، BLR) الذي يحتوي على 10٪ hiFCS / 1٪ بنسلين ستربتومايسين / 1٪ L- جلوتامين. تم طرد الخلايا وطليها في أطباق بتري غير المزروعة بالأنسجة بكثافة 5 × 10 5 / مل في DMEM الكامل ، مع استكمالها بنسبة 20 ٪ (حجم / حجم) L929 وسط مكيف بالخلايا كمصدر لـ M-CSF و 20 ٪ hiFCS. بعد 6 أيام عند 37 درجة مئوية ، تم فصل الخلايا عن طريق الحضانة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 3 ملي مولار EDTA و 10 ملي جلوكوز ، مطلية ومثقف في أطباق بتري الصغيرة غير الأنسجة عند 2.5 × 10 5 / مل في DMEM الكامل لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.

إصابة BMM بـL. مكسيكانا

أصيب يوم 7 BMM لمدة 24 ساعة أو 7 أيام عند 34 درجة مئوية مع النوع البري أو بديل-الأماستيغوتات المنقولة بنسبة 10 طفيليات لكل بلاعم. بعد فترة الإصابة بالعدوى ، تم حصاد الضامة كما هو موصوف أعلاه ، وغسلها باستخدام PBS وتثبيتها ونفاذها باستخدام "Fix & amp Perm kit" (Pharmigen) 1 × 10 5 تم طرد الخلايا على شرائح زجاجية باستخدام Cytospin. تم الكشف عن الطفيليات داخل الخلايا وحسابها عن طريق التألق المناعي كما هو موضح أعلاه. تم حساب ما بين 100 و 200 من الضامة لكل نقطة زمنية.

الالتهاباتفي الجسم الحي

ل L. المكسيكية في الجسم الحي عدوى ، تم حقن مجموعات من 8 إناث C57BL / 6 فئران تحت الجلد في وسادة القدم مع 3 × 10 6 طور ثابت من النوع البري L. مكسيكانا, بديل 1 transfectants و بديل 2 المتحولون. تم قياس حجم الآفة أسبوعيًا أثناء الإصابة بميكرومتر قرص وتم التعبير عنه بالفرق في الحجم بين وسادة القدم المصابة ولوحة القدم المقابلة غير المصابة.

ل B. الملايو في الجسم الحي عدوى ، تم حقن مجموعات من 5 إناث C57BL / 6 فئران داخل الصفاق مع 200 يرقة معدية تم استعادتها من سحقها الزاعجة المصرية البعوض. بعد الفترة التجريبية ، تم التخلص من الفئران بواسطة مخدر طرفي ، وتم حصاد الخلايا البريتونية (PEC) عن طريق الغسيل الشامل للتجويف البريتوني باستخدام 15 مل من RPMI المثلج المضاف إليها 10 ٪ FCS. تم طلاء PEC المحصود في 24 لوحة ثقافة جيدة 2 × 10 6 خلايا / بئر. بعد 3 ساعات عند 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالالتزام ، تم حصاد مجموعات الخلايا المخصبة بالبلاعم غير الملتصقة والملتصقة.

تقدير كمية الطفيليات

تم تقدير عدد الطفيليات في وسادة القدم عن طريق الحد من مقايسة التخفيف. تم حصاد وسادات القدم المصابة في برنامج تلفزيوني بارد بعد إزالة الجلد. تم تشتيت أنسجة وسادة القدم من خلال مصفاة خلية وتعليقها في PBS-1 ٪ من البنسلين / الستربتومايسين. بعد الطرد المركزي ، تم تعليق الحبيبات في SDM الكامل. تم بعد ذلك تخفيف تعليق الخلية بشكل متسلسل بخطوات 10 أضعاف ، في أربع مرات ، في 96 طبقًا جيدًا. تم تحضين الصفائح لمدة 4 أيام عند 27 درجة مئوية ثم لوحظ نمو الطفيل في الآبار.

قياس إنتاج النتريت

تم طلاء J774 الضامة على 96 طبقًا جيدًا (1 × 10 5 / بئر) وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. ثم أزيل الوسيط وغسلت الزنازين مرتين و L. مكسيكانا تمت إضافة بروماستيجوتيس لمدة 4 ساعات بمعدل 10 طفيليات لكل بئر. تمت إضافة IFN-(40 وحدة / مل) و LPS (10 نانوغرام / مل) ، مع أو بدون نظير أرجينين ن-مونوميثيل- D- أرجينين (D-NMMA) ، 1 مم. تم استخدام تراكم النتريت في الوسط خلال فترة 24-48 ساعة التالية كمؤشر على إنتاج NO وتم تقييمه بواسطة تفاعل Griess حيث تمت إضافة 100 ميكرولتر من كاشف Griess [55] إلى 100 ميكرولتر من كل مادة طافية في آبار ثلاثية في 96 -كذلك لوحة. تمت قراءة اللوحات عند 490 نانومتر مقابل الطول الموجي المرجعي 620 نانومتر باستخدام قارئ لوحة ELISA. نانو2 تم استخدامه لعمل منحنى قياسي لكل قراءة لوحة.

مقايسة مبيد الليشمانيات

تم طلاء BMM (5 × 10 4) على أغطية زجاجية في 24 لوحًا جيدًا ، وتم السماح لها بالالتصاق لمدة 24 ساعة ، وتحفيزها بـ 100 نانوغرام / مل LPS والتركيزات المحددة لـ IFN-. تم تحضين الخلايا لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية قبل إضافة بروماستيجوتيس المرحلة الثابتة من النوع البري L. مكسيكانا أو منقولة بديل 1 و بديل 2 طفيليات بنسبة 10 طفيليات لكل خلية. بعد 72 ساعة عند 37 درجة مئوية ، كانت الخلايا ملطخة بـ Giemsa. تم تحديد النسبة المئوية للبلاعم المصابة بالطفيليات من خلال عد 4 عينات من 100 خلية.

عزل الحمض النووي الريبي

تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من BMM غير المصابة والمصابة وكذلك مجموعات الخلايا الملتصقة وغير الملتصقة باستخدام TRIzol Reagent (Invitrogen ، تقنيات الحياة) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم إخضاع الحمض النووي الريبي (RNA) لمعاملة DNase (Ambion ، INC) للقضاء على التلوث الجيني ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة

تحليل مجموعة الجينات

تم تحليل التعبير الجيني باستخدام Mouse Cytokine Expression Array (أنظمة R & ampD). تم أولاً تلدين المواد الأولية الخاصة بالسيتوكين الخاصة بالفأر إلى إجمالي الحمض النووي الريبي ، والتي تم نسخها عكسيًا في وجود SuperScript II (Invitrogen ، تقنيات الحياة) و [α- 33 P] dCTP. تم تهجين تحقيقات (كدنا) ذات العلامات الإشعاعية المتولدة من الخلايا غير المصابة والمصابة إلى أغشية متطابقة تحتوي على صفائف (كدنا) الماوس. بعد التهجين ، تم إجراء عمليات غسل عالية الشدة وتعرض الأغشية للتصوير الشعاعي الذاتي. تم إجراء القياس الكمي باستخدام PhosphorImager وتم تحليل البيانات باستخدام ImageQuant v1.2.

تحليل RT-PCR في الوقت الحقيقي

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي في Trizol ، كما هو موضح أعلاه ، وتم تصنيع cDNA أحادي الجديلة باستخدام النسخ العكسي MMLV (Stratagene). تم قياس الكمي النسبي للتعبير عن الجينات ذات الأهمية بواسطة PCR في الوقت الحقيقي باستخدام LightCycler (Roche Molecular Biochemicals). تم إجراء تضخمات PCR في 10 مجلدات ميكرولتر تحتوي على 1 ميكرولتر (كدنا) ، و 2.5 ملي MgCl2 ، و 3 ميكرومتر من البادئات ومزيج LightCycler-DNA SYBR Green I (Qiagen). تم إجراء التفاعل في الظروف التالية: خطوة تنشيط 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية لدورة واحدة ، وتمسخ 15 ثانية عند 95 درجة مئوية ، وتسخين 20 ثانية عند 50 درجة مئوية واستطالة 15 ثانية عند 72 درجة مئوية ، لمدة 50 دورة . تمت مراقبة صبغة الحمض النووي الفلورية SYBR Green بعد كل دورة عند 80 درجة مئوية. خمسة تخفيف 1: 2 من المسلسل بديل 2 تم استخدام البلاعم المصابة (كدنا) لإنتاج منحنى معياري في كل تفاعل. تم التعبير عن وفرة GATA-3 و SOCS-1 كنسب من المنتج المضخم إلى بروتين الريبوسوم الفأري S29. كانت الاشعال لتحليل RT-PCR كما يلي: GATA-3: 5'-CTA CGG TGC AGA GGT ATC C-3 'و 5'-GAT GGA CGT CTT GGA GAA GG-3' SOCS-1: 5'-ACC TTC TTG GTG CGC GAC AGT CGC CAA-3 'و 5'-GGA ACT CAG GTA GTC ACG GAG TAC-3' و S29 بروتين ريبوسوم: 5'-ATG GGT CAC CAG CAG CTC TAC-3 'و 5'-GTC CAA CTT AAT GAA GCC TAT-3 '.


شاهد الفيديو: الأوبيرون وتنظيم الجينات في البكتيريا. الأحياء. تنظيم الجينات (كانون الثاني 2022).